CHK2 KINASE

CHK2 KINASE - A BUSY MESSENGER

Jacob Falck, Jiri Lukas
Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, 877-886 (2001)

Checkpoint kinase 2 (Chk2) является ключевым медиатором различных клеточных реакций на генотоксические стрессы, сохраняющим интегральной генома в ходе эволюции эукариот. Выявлена фундаментальная роль Chk2 в сети путей геном-надзор (genome-surveillance), которая координирует ход клеточного цикла с репарацией ДНК и выживанием или гибелью клеток. Дефекты в Chk2 вызывают образование как наследуемых, так и спорадических опухолей, это указывает на нее как на супрессор опухолей Большинство протеин киназ - энзимов, которые вызывают ковалентные модификации белков путем переноса фосфатных групп с АТФ на субстрат - инициируют или усиливают ранг клеточных сигналов, которые участвуют во многих фундаментальных физиологических процессах.
Одним из жизненно необходимых процессов является постоянный мониторинг и поддержание качества хромосомной ДНК  - обязательное условие для успешного удвоения и сеграгации генома. Этот  надзор оперирует посредством сложной сети т. наз. genome-integrity или checkpoints клеточного цикла. Эти молекулярные каскадыобнаруживают и отвечают на неполную репликацию ДНК или различные формы повреждений ДНК, которые обусловливают генотоксические стрессы (Рис. 1). Учитывая необычные размеры генома, большинство ошибок, которые  неизбежно появляются  во время ее репликации, и  обширный набор ДНК-повреждающих воздействий, которые постоянно атакуют наши гены, хорошо функционирующие мониторинг (checkpoint) механизмы необходимы для правильного развития и выживания. Такие ДНК -повреждающие воздействия включают и средовые мутагены, такие как генотоксические  химические в-ва, УФЛ или ионизирующая иррадиация, а также разнообразные  эндогенные реактивные виды кислорода, которые возникают во время обычного клеточного метаболизма.

(Рис.1.)  |  Cell-cycle checkpoints.

Лучшим способом оценить важную роль checkpoint кухни (machinery) является рассмотрение последствий ее нарушений, возникающих в результате естественных или индуцированных мутаций или EPIGENETIC дефектов критических компонентов  checkpoint путей. В зависимости от тяжести и времени нарушения функции надзора м. возникать уродства развития, эмбриональная летальность или некопление мутаций, которые м. потенциально приводить к генетическим болезням, включая рак. Часто появление повреждений ДНК нуждается в быстром и эффективном привлечениии ДНК-репарирующих механизмов и временной остановки хода клеточного цикла у пролиферирующих клеток, чтобы иметь время для репарации и предупредить фиксацию и размножение вредных мутаций. Это становится возможным с помощью эффективной ДНК-репарирующей кухни, а также с помощью точек мониторинга клеточного цикла.
Механизмы мониторинга и оповещения (checkpoint) осуществляют быстрый аварийный сервис, благодаря быстрой амплификации сигналов, передаваемых от повреждений ДНК вниз к checkpoint эффекторам, который задерживают ход клеточного цикла и активируют репарацию ДНК. Все еще неясно какие молекулы обнаруживают поврежденную ДНК, но скорость и расширение передаваемых сигналов , как известно,  сопровождается  цепью событий фосфорилирования, которые осуществляются протеин киназами двух уровней по ходу checkpoint каскадов. Наиболее высоко стоящие передающие сигналы киназы  принадлежат семейству, родственнуму  phosphatidylinositol kinase (PIK) и включают в свой состав  'ataxia-telangiectasia, mutated' (ATM) и 'ataxia-telangiectasia и Rad3-related' (ATR) киназы у позвоночных и их гомологи у дрожжей. На следующей ступени сигналы о повреждении ДНК передаются и умножаются  с помощью двух структурно не родственных,функционально комплементарных serine/threonine kinases, Chk1 и Chk2, которые находят нижестоящие эффекторы checkpoint путей.
Довольно много уже известно о ATM и ATR, стоящих на вершинах checkpoint каскадов. Функции ATM находятся в связи со сложными симптомами у пациентов с  ataxia-telangiectasia (тяжелым заболеванием, вызываемым мутациями в гене ATM). Напротив, Chk1 и Chk2 привлекли к себе меньше внимания, однако накапливающиеся данные указывают на роль Chk2 как критической связи между ATM/ATR киназами и   checkpoint эффекторами клеточного цикла и ДНК-репарационной кухней.  Идентифицированы и мутации гена CHK2 при наследственых и спорадических опухолях у человека.
Итак, Chk2 квалифицируется как новый супрессор опухолей и рассматривается как цель для будущих терапевтических стратегий рака. Эти и дополнительные функции Chk2 киназы и ее гомологов эволюционно законсервированы.
Boxes
Box 1 | Radioresistant ДНК synthesis (RDS)
This is the inability of cells to reduce the rate of ДНК replication after exposure to ionizing radiation. RDS was originally discovered in cells that were derived from patients with ataxia-telangiectasia. It was later found that RDS is also associated with other genetically transmitted и cancer-prone diseases, such as Nijmegen breakage syndrome (NBS) и ataxia-telangiectasia-like disorder (ATLD). Cells from patients with NBS и ATLD are deficient in the Mre11-Nbs1-Rad50 protein complex, which is normally required for various aspects of the cellular response to ДНК damage, including recombinational ДНК repair. Interestingly, the Nbs1-Mre11-Rad50 complex is itself targeted by the ATM kinase in response to ionizing radiation. RDS also occurs in cancer cells with deficient BRCA1 или CHK2 tumour suppressors. Experimentally, RDS could be evoked by preventing radiation-induced degradation of the Cdc25A phosphatase.
Box 2 | Chk2 versus Chk1
Chk2 is a relatively stable protein (with a half-life longer than six hours), which is expressed и can be activated in all phases of the cell cycle, including G0 (quiescence evoked either by depletion of growth factors или by contact inhibition). Moreover, Chk2 is present - и can be activated - in at least some differentiated cells и tissues. By contrast, Chk1 is an unstable protein (with a half-life of less than two hours), и its expression is restricted to the S и G2 phases of the cell cycle. Chk1 is also absent in differentiated cells. There is indirect evidence that Chk1 expression (unlike that of Chk2) might be regulated by E2F TRANSCRIPTION FACTORS . The Chk1 и Chk2 proteins are structurally distinct, и Chk1 lacks the FHA domain that is found in Chk2.

In terms of an immediate response (within two hours of ДНК damage), the ATM-Chk2 pathway is specifically activated by the generation of ДНК double-strand breaks that are induced by ionizing radiation или radiomimetic drugs. The ATR-Chk1 pathway, by contrast, is activated in response to stalled ДНК-replication forks that are induced by either UV light (which stalls replication by generating nucleotide dimers) или drugs such as hydroxyurea (which depletes the cellular deoxyribonucleotide pool) и aphidicolin (which inhibits ДНК polymeraseα).

Homozygous disruption of either the ATR или Chk1 genes causes early embryonic lethality. Hence, both genes seem to be essential и cannot be replaced by redundant mechanisms. By contrast, ATM-deficient organisms (both humans и mice) do not show gross developmental defects, although deficiency of ATM predisposes to several symptoms, including cancer. The consequences of homozygous Chk2 disruption in mice are unknown.



Links
DATABASES
Interpro: | FHA |
LocusLink: | ATR | Bax | CtIP | cyclin E | GADD45 | p21CIP1/WAF1 |
OMIM: | ataxia-telangiectasia | ataxia-telangiectasia-like disorder | Nijmegen breakage syndrome |
Saccharomyces Genome Database: | Mec1 | Mek1 | Mrc1 | Mre11 | Rad3 | Rad9 | Rad50 | Rad53 |
Swiss-Prot: | 53BP1 | ATM | BRCA1 | c-Abl | Cdc25A | Cdc25C | Chk1 | Chk2 | Mdm2 | p53

Chk2 in evolution

Термин 'checkpoints' (контрольно-пропускной пункт, КПП) впервые предложен на базе открытий у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae регуляторных путей, которые арестовывают ход клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК, чтобы дать время для репарации.
Обнаружение члена 'Chk2 family' checkpoint киназ, названного Rad53, впервые произошло в 1994 , как киназы, участвующей во многих checkpoint реакциях у почкующихся дрожжей. Гомологи Rad53 были затем обнаружены у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe (названа cds1)и у высших эукариот (Рис. 2). Ее гомолог у человека назван Chk2 группой Elledge, которые впервые клонировали ген человека. Независимо клонированны гомологи у разных организмов или разными лабораториями у одного организма привели к неразберихе к номенклатуре. Авт. исходят из названия ее у млекопитающих,Chk2, и используют специфические названия только при объяснении специфических свойств гомологов у низших эукариот.

(Рис.2.)  |  Chk2 in evolution.

Структура Chk2 сходна у всех эукариот (Рис. 2). Степень общей гомологии Chk2 белковых последовательностей среди видов грубо отражает эволюционное расстояние  среди различных организмов (Рис. 2). Напр., CHK2 человека обнаруживает 83% и 82% идентичность аминокислот с киназой крысы и мыши, соотв., 61% идентичности с  Xenopus laevis белком; 51% с рыбкой данио; 34% с Drosophila melanogaster; 32% с S. pombe и нематодой Caenorhabditis elegans; и 28% с S. cerevisiaeRad53. Интересно, что  Rad53 киназа почкующихся дрожжей, столь удаленная, единственный член семейства Chk2 имеет большое С-терминальное расширение, которое также включает второй forkhead-associated (FHA) домен.
Несмотря на общую структурную гомологию  и сходную биологическую роль важных трансдукторов сигналов checkpoint клеточного цикла имеются функциональные различия  между различными гомологами Chk2. Тогда как дрожжевые Rad53 и cds1 киназы необходимы для ответов на разные формы повреждений ДНК , а также для блокирования репликации, то Chk2 млекопитающих, по-видимому, отвечает в первую очередь за большинство летальных типов повреждений ДНК — двунитчатые разрывы ДНК, которые вызываются агентами, такими как ионизирующая иррадиация и RADIOMIMETIC DRUGS .
Др. отличием явлется роль некоторых гомoлогов Chk2 в мониторинге мейотической рекомбинации в зародышевых клетоках. Эта функция особенно отчетлива у  Chk2 гомолога C. elegan, и подтвержается локализацией Chk2 в зародышевых клетках  Drosophila. У почкующихся дрожжей, однако, мейотическая рекомбинация подвергается мониторингу со стороны более удаленной киназы, называемой Mek1, скорее, чем  Rad53  и неизвестно какая киназа отвечает за эту функцию у млекопитающих.
Выявление функциональных параллелей среди членов семейства Chk2 у разных организмов осложняется частичным перекрыванием или  дифференциальным использованием  структурно отличающихся киназ Chk1 и их гомологов. Функции Chk1 киназ кооперируются, перекрываются или  противодействуют функциям  Chk2 киназ, в зависимости от организма и природы генотоксического воздействия. С др. стороны, ген CHK2 устраняет checkpoint дефеты как у почкующихся, так и делящихся дрожжей, дефицитных по Rad53 и cds1 , соотв., это указывает на общую консервацию его функции в Chk2 семействе.

Chk2 structure и activation

Ген человека, который кодирует CHK2 , занимает 50 kilobases геномной ДНК и содержит 14 экзонов (Рис. 3а). На белковом уровне, структура Chk2 киназ  характеризуется несколькими эволюционно законсервированными элементами (Рис. 3b).

(Рис.3.)  |  CHK2 genomic и protein structure.

The SQ/TQ motif. N-терминальный домен содержит серию из семи сериновых или треониновых остатков, сопровождаемых глютамином glutamine (SQ или TQ мотивы). Это предпочтительные сайты для фосфорилирования с помощью ATM/ATR киназ. В самом деле, показано, что после повреждения ДНК (обусловленного ионизирующим излучением или УФЛ) или блокады репликации после воздействия hydroxyurea, Thr68 и др. сайты в этой области становятся фосфорилированными с помощью  ATM/ATR и следовательно, этот домен Chk2 обладает регуляторной функцией . В делящихся дрожжах, фосфорилирование  Thr11 в TQ мотиве с помощью Rad3 необходимо для активации icds1 checkpoint киназы.
The forkhead-associated domain. Др. ключевым доменом Chk2 является FHA домен,впервые идентифицированный в forkhead транскрипционных факторах и поздрнее обнаружен в ряде (в основном ядерных) белков с различными функциями.  Хотя границы Chk2 FHA домена (между аминокислотными остатками 115 и 165) на (Рис. 3b) соответствуют первоначальной работе, но последние исиследования показали, что функциональные FHA домены м. соотвествовать аминокислотным остаткам 120–140. FHA домены, по-видимому, связывают phosphothreonine остатки и, по-видимоу, участвуют в межбелковых взаимодействиях, которые вероятно запускаются фосфорилированием белков, которые распознаются с помощью  FHA-содержащих партнеров, таких как Chk2. Итак, FHA домен прекрасный кандидат на роль динамических взаимодействий Chk2 с их вышестоящими регуляторами  и/или нижестоящими мишенями при передаче сигналов  cell-cycle-checkpoint.

The kinase domain. Киназный домен занимает почти всю С-терминальную половину Chk2 и его ключевые функциональные элементы — включая ACTIVATION LOOP — идентифицированы на базе их гомологии с др. serine/threonine киназами (Рис.3b). Мутация одного из ключевых остатков этого домена,  Asp347, в аланин, дает киназа-дефектных мутантов, пригодных для исследования.

Наконец, наиболее уникальным свойством Chk2 млекопитающих, которое не законсервировано у низших эукариот, является c-Abl SRC HOMOLOGY-3 (SH3) DOMAIN -consensus связывающих последовательностей, которые находятся выше FHA домена. Функциональное значение этого мотива не известно; однако, как Chk2, так  и c-Abl фосфорилируются и активируются с помощьью ATM в ответ на повреждение ДНК. Более того, ATM и активированная Chk2 часто совместно направляются на нижестоящие checkpoint эффекторы, итак, Chk2 м. взаимодействовать с c-Abl, или физически или функционально.
Models of Chk2 activation. Существуют две модели Chk2 активации в ответ на повреждение ДНК, которые базируются на эксприментах с CHK2 человека и Rad53 почкующихся дрожжей, соотв.
В человеческой модели, первая ступень активирующего фосфорилирования CHK2 зависит от интегральности ее FHA домена и осуществляется с помощью ATM киназы в ответ на двунитчатые разрывы ДНК. Эта инициальная волна фосфорилирования затрагивает, в частности Thr68, а также дополнительные серины или треонины в регуляторном  SQ/TQ-богатом домене CHK2 человека. Фосфорилирование в Thr68 является предварительным условием для последующей ступени активации, которая обозначается как autophosphorylation CHK2 по остаткам Thr383 и Thr387 в активационной петле киназного домена.
Какой вклад вносит FHA домен в фосфорилирование Thr68 с помощью ATM и kак это способствует аутофосфорилированию CHK2? Неизвестно, но предполагается, что FHA домен м. обеспечивать закрепление  (docking) CHK2 на самой ATM или др. checkpoint регуляторе, который комплексуется с  ATM и/или CHK2, такими как BRCA1 или 53BP1. Инициальное фосфорилирование в SQ/TQ-богатом домене м. вызывать конформационные изменения в CHK2, которые делают легче доступ киназного домена к своей собственной активационной петле и тем самым способствуют  полной активации CHK2 (Рис. 4).

(Рис.4.)  |  Models of Chk2 activation.

В модели почкующихся дрожжей активации Rad53, повреждение ДНК damage или блок репликации вызывают быстрое соединение Rad53 с димером Rad9, важным  checkpoint регулятором, который содержит характерный BRCT HOMOLOGY DOMAIN , обнаруживаемый в  checkpoint белках всех эукариот. Взаимодействие Rad9 с Rad53 зависит от пре-фосфорилирования Rad9 с помощью Mec1, гомологом ATM киназы млекопитающих у почкующихся дрожжей (Рис. 4b). Эти два события сводят две Rad53 молекулы в непосредственную близость, позволяя тем самым осуществлению аутофосфорилирования  in trans Rad53, активированная форма которого затем высвобождается из комплекса с Rad9. Интересно, что адапторный белок, названный claspin, также, по-видимому, необходим для активации Chk1у Xenopus в ДНК-репликационной checkpoint, a claspin-подобный белок, Mrc1, как полагают, ведет себя как репликативный аналог Rad9/crb2 в активации Rad53 и cds1 у почкующихся и делящихся дрожжей, соотв.
Принимая во внимание, что нет четкой гомологии между Rad9 у высших эукариот, то две модели Chk2/Rad53 активации кажутся отличными. Однако, в обоих случаях  ATM/Mec1 участвуют в первой ступени активирующего фосфорилирования; BRCT-containing (BRCA1, 53BP1) или claspin-подобный адапторный белок м также вносить свой вклад в активацию Chk2 млекопитающих; и обе модели используют аутофосфорилирование Chk2 как финальную ступень активации.

Chk2 targets и functions

В ответ на генотоксическое воздействие Chk2 активиаруется и умножает checkpoint сигнал вдоль нескольких путей, которые в конечном счете обусловливают арест клеточного цикла в G1, S и G2/M фазах; активацию репарации ДНК  и, в некоторых случаях, апоптическую гибель клеток.
Сheckpoint эффекторы у млекопитающих, которые установлены как субстраты для Chk2 in vivo,  включают p53, BRCA1 и два из трех членов семейства Cdc25 phosphatases — Cdc25A и Cdc25C (Рис. 5). Белок Mdm2 — который способствует обмену  p53 и ингибирует его активность как транкрипционного фактора — по-видимому, фосфорилируется с помощью Chk1  и является кандидатом на роль субстрата для Chk2. Хотя этот список далеко неполон, функции известных мишеней для Chk2 уже позволят предположить, как Chk2 влияет на egjvzye.st выше различные клеточные процессы (Рис. 5).

(Рис.5.)  |  Chk2 downstream effectors.

Фосфорилирование p53 по Ser20 с помощью Chk2 и /или Chk1 (возможно вместе с фосфорилированием Mdm2) стабилизирует p53 белок, которое увеличивает его потенциал  позитивно регулировать экспрессию факторов, которые участвуют в репарации ДНК, гибели клеток и контроле клеточного цикла. Мышиные Chk2-дефицитные клетки, после ионизирующего облучения неспособны стабилизировать и активировать p53, как это делают клетки, экспрессирующие киназа-дефицитные Chk2 мутации. Итак, путем модулирования p53, Chk2 и Chk1 помогают увеличить шансы репарации ДНК и вызывают устойчивуют G1 и G2/M блокаду клеточного цикла или апоптоз (Рис. 5). Нижестоящие медиаторы этих p53-регулируемых клеточных эффектов включают GADD45 и p21CIP1/WAF1 iингибиторы циклин=зависимых киназ, способствующих апоптозу факторов, таких как Bax и Fas, и др. мишеней, чья роль в реакции на повреждения ДНК еще не установлена.
BRCA1, др. субстрат для Chk2, является одним из ключевых checkpoint-контролирующих белков и регулятором HOMOLOGOUS RECOMBINATIONAL REPAIR и TRANSCRIPTION-COUPLED REPAIR , клеточного цикла, CHROMATIN REMODELLING и, возможно, гибели клеток. Фосфорилирование Ser988  в BRCA1 человека с помощью CHK2 (Рис. 5) необходимо для высвобождения  BRCA1 из его комплекса с CHK2, и это событие является важным для выживания клеток после повреждения ДНК.
Помимо участия Chk2/p53 в поддержании блокады G2, арест клеточного цикла в G2/M, по-видимому, по крайней мере частично, связан с Chk2-обусловленным фосфорилированием Ser216 на Cdc25C. Это фосфорилирование ингибирует фосфатазную активность Cdc25C и вносит вклад в ее цитоплазматическое секвестрирование путем взаимодействия  с 14-3-3 PROTEINS . Т.к. устранение ингибиторного тирозинового фосфорилирования у митотической cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) с помощью Cdc25C является скорость-зависимой ступенью  в клеточных делениях, то такое продолжительное фосфорилирование Ser216 на Cdc25C с помощью Chk2 помогает предупреждбать вступление клеток с поврежденной ДНК в митоз.
Субстратом для Chk2 является и Cdc25A. Эта фосфатаза активирует  cyclin E/Cdk2 и циклин A/Cdk2 киназы, которые необходимы для вступления и прохождения фазы Sв клетках млекопитающих. В ответ на ионизирующее излучение  Chk2 фосфорилирует Ser123 на Cdc25A, и эта модификация направляетCdc25A  на быструю ubiquitin-зависимую, протеосомами опосредованную деградацию. Cdc25A деградирует также и в ответ на УФЛ  и остановку репликации ДНК, хотя участие Chk2 в этих событиях неясно. Во всяком случае, такое молчание Cdc25A фосфатазы ведет к персистенции фосфорилирования тирозина у Cdk2 и, следовательно,  к неспособности зажечь ORIGINS OF ДНК REPLICATION . Это, в свою очередь, ведет к задержке поздней G1 и S фазы.
Функциональная связь между Chk2 и Cdc25A — и , на самом деле, идентификация  оси ATM–Chk2–Cdc25A–Cdk2 , которая активирует реакцию на ионизирующее излучение  — проливает больше света на клинически важный феномен, известный как radioresistant ДНК synthesis (RDS; Box 1). Генетические манипуляции, которые нарушают какой-либо компонент пути ATM–Chk2–Cdc25A–Cdk2 ведут к RDS, что указывает на значение этого checkpoint механизма для поддержания интеграции генома. Эти результаты выявляют также понециальную функциональную связь между Chk2–Cdc25A взаимодействием и Mre11–Nbs1–Rad50 checkpoint белковым комплексом ( Box 1), дефекты которого также ведут к RDS.
Общей темой в передаче сигналов checkpoint является то, что ATM и ATR, которые преимущественно активируются в ответ на ионизирующее облучение и УФЛ  или дейекты репликации, соотв., часто фосфорилируют несколько белков из одного и того же комплекса. Напр., такое множественное фосфорилирование включает p53–Mdm2 cкомплекс, или BRCA1 и его ингибирующий interactor CtIP (BRCA1 carboxy-terminal interacting protein). Это стремление к кооперативному фосфорилированию подтверждается еще тем фактомЮ что Chk2 часто затрагивает белки, которые являются также субстратами для ATM, такие как p53, BRCA1, и возможно также Mdm2. Остается определить, верно ли это и для Cdc25A и Cdc25C. Единственная возможность в том, что множественное фосфорилирование приложимо в основном к мишеням с плейотропными клеточными эффектами ( включая клеточную гибель), к таким как p53–Mdm2 и BRCA1, скорее, чем к более 'committed' эффекторам клеточного цикла, таким как Cdc25 фосфатазы (Рис. 5). Вообще-то первый набор узловых эффекторов должен рекрутироваться и активироваться только тогда, когда checkpoint реакции полностью активированы, чтобы устранить какие-либо случайные запалы их потенциально вредных функций.

Chk2 и tissue biology

Миссия checkpoints геномной интеграции необходима для сохранения точности генетической передачи во время клеточных делений. Итак, спектр checkpoint путей, которые развернуты, и время или степень их ответной реакции, м. отличаться в зависимости от того, пролиферируют ли клетки во время повреждения ДНК. Др. уровень checkpoint адаптации м. отражать клеточно- и ткане-специфическую специализацию. Напр., лимфоцитам нужны воздействия, ведущие к повышенной частоте двунитчатых разрывов ДНК, которые генерируются во время  перестройки генов иммуногоглобулина или Т-клеточных рецепторов, а зародышевые клетки должны копироваться с разрывами, которые вносятся во время мейотической рекомбирнации.
Др. различия м.б. связаны с продолжительностью жизни различных типов клеток у высших эукариот, таким как крайние различия между  в основном непролиферирующими нейрональными клетками по сравнению с постоянно обновляющимися клеточнми популяциями, таким как эпидермис или эпителий слизистой ЖКТ. Учитывать этот дополнительный уровень сложности трудно, но необходимо для создания более точных модельных систем.  Уже известны примеры ткане-специфической экспрессии или субклеточной локализации критических checkpoint компонентов, таких как  BRCA1 или ATM.
Иммунохимический анализ Chk2 в культивируемых клетках млекопитающих показал, что Chk2 преимвущзественно — если не исключительно — ядерный белок (Рис. 6). Checkpoint белки — включая Chk2 — часто локализубются в отдельных субъядерных тельцах или 'фокусах и, на самом деле, ионизирующая иррадиация запускает накопление Chk2 в сайтах разрывов нитей ДНК. Однако, отличительные особенносити, состав и динамика этих структур в ответ на повреждения ДНК изучены слабо.

(Рис.6.)  |  Subcellular localization и tissue biology of human CHK2.

В противополжность, в  др. типах клеток и тканей и CHK2 имеет преимущественно цитоплазматическую локализацию в нейрональных клетках человека in situ (Рис. 6). Эта локализация напоминает ту, что имеет выше расположенный регулятор  Chk2, ATM. Это указывает на то, что ATM–Chk2 путь м. иметь специализированую цитоплазматическую ролью которая, аозможно связана с защитой чувствительных нейронов от оксидативных стрессов. Эта возможность согласуется с тем фактом, что нейроны, которые подверглись воздействию усиленных реактивных видов кислорода, подвергаются апоптической гибели. Кроме того, пациенты с ataxia-telangiectasia, у которых отсутствует функциональная ATM, страдают от тяжелой  нейродегенерации, которая, по-видимому, отражает повышеннце оксидативные стрессы и прогрессивную гибель нейрональных клеток.
Ранние исследования экспрессии мРНК Chk2 были ограничены немногоми тканями и обнаруживали широкое, и варьиабельное распределение Chk2 с наивысшими уровнями в тестисах. Учитывая преимущественную роль Chk2 в регуляции мейоза у C. elegans и Drosophila, это не удивительно, что в яичках человека CHK2 белок более обилен в митотически делящихся SPERMATOGONIA скорее, чем в SPERMATOCYTES , которые подвергаются мейотическим клеточным делениям. Т.к. функциональный аналог Chk1 киназа локализуется в мейотических хромосомах сперматоцитов мыши, то мейотическая рекомбинация м. подвергаться мониторингу с помощью Chk1 у млекопитающиъх, возможно, вместе с Chk2, которая также экспрессируется в зародшевых клетках самцов  (хотя и на более низких уровнях).
Наблюдение обилия и локализации CHK2 в тканях человека и в дифференцирующихся клеточных моделях in vitro проливает свет на дальнейшие различия между Chk1 и Chk2 ( Box 2). За небольшими исключениями, Chk2 экспрессируется в клетках пролиферирующих, а также в терминально дифференцированных, не-прлиферирующих тканевых компартментах. Тогда как Chk1 ограничена S и G2 фазами пролиферирующих клеток, умножение сигналов о ДНК-повреждении в большинстве G1 фаз и в покоящихся клетках м.б. избирательно связано с Chk2.

CHK2 as a tumour suppressor

Идея, что геномная нестабильность топливо для развития опухолей, хорошо известна. Идентификация гена CHK2 у человека позволяет исследовать потенциальные ассоциированные с опухолями аберрации. На самом деле, первые мутации CHK2 были выделены из спорадических и наследуемых опухолей человека. Это показало. что дефекты CHK2 м. объяснить склонные к опухолям фенотипы, по крайней мере у некоторых из семей с LI-FRAUMENI SYNDROME , которые не связаны с мутациями в  p53 супрессоре опухолей.
Однако, позднее в исследованиях мутаций CHK2 обнаружена западня на уровне геномной ДНК из-за присутствия очень близких не-транскрибируемых последовательностей в геноме человека. Это задержало анализ статуса CHK2 человека в озлокачествлении. Подтверждено, что CHK2 мутантен в субнабре семей с раком груди и идентифицированы редкие дефекты CHK2 при спорадических легочных и лимфоидных опухолях. Положение и типы опубликованных CHK2 мутаций относительно структуры  белка CHK2 показано на Рис. 7а).

(Рис.7.)  |  CHK2 as a tumour suppressor.

Полученные результаты согласуются с идеей, что CHK2 м.б. опухолевым супрессором. С др. стороны,  все опубликованные мутации были гетерозиготными, говорит в пользу того, что вовлечены мутантные CHK2 белки. Подтверждено, что как укороченные, так и миссенс мутации CHK2 теряют свою способность взаимодействовать с и эффективно фосфорилировать субстраты, такие как CDC25A или p53. Эктопическая экспрессия миссенс мутации нарушает функцию и CHK2 дикого типа в клетках человвека, что согласуется с их доминантно-негативным эффектом. Итак, идентифицированные гетерозиготные мутации CHK2 м. подрывать геномную стабильность или за счет частичной потери функции (haploinsufficiency), доминантно-негативных эффектов некоторых мутаций, или  комбинации обоих эффектов. В целом, эти результаты подтверждают природу потери функции ассоциированных с опухолями мутаций CHK2 и строго подтверждают кандидатуру этой checkpoint киназы на роль супрессора опухолей.
Относительная бедность мутаций CHK2 м.б. объяснена альтернативными cancer-promoting дефектами, которые затрагивают др. регуляторы checkpoint клетоного цикла, которые действуют на общих путях с CHK2 (Рис. 7b). С др. стороны, сопутствующие обстоятельства  мутациям потери функции CHK2 и ее субстрата, p53, были идентифицированы в линии клеток спорадической карциномы толстого кишечника.  Эта комбинация мутаций вCHK2 и TP53 (гене, кодирующем p53у человека) м. дать дополнительные селективные преимущества опухолевым клетками, по сравнению с клетками, которые обладют дефектами или  только CHK2 или p53.
Такой кооперативный эффект м.б. объясрнен тем фактом, что помимо их общей функции в одном и том же checkpoint пути, CHK2 и p53 по-видимому, обладют и независимыми функциями. Более того, эти результаты указывают на то, что м.б. одновременные дефекты CHK2 с p53 или с др. checkpoint регуляторами у человека при озлокачествлении. Эпигенетические механизмы, как известно, также м. подрывать экспрессию некоторых опухолевых супрессоров и остается посмотреть, м. ли быть задейстованы в онкогенезе  молчание за счет метилирования, или дефекты путей, которые регулируют транскрипцию или оборот CHK2. Идентифицированы субнаборы тестикулярных опухолей  человека с редукцией CHK2 , и редуцированной стабильностью белков при некотрых идентифицированных CHK2 мутациях.
Нaконец, CHK2 м. в свою очередь б. привлекательной мишенью для открытия лекарств и некоторые формакацепт. компании ищут низко-молекулярные ингибиторы этой киназы.  Т.к. в опухолевых клетках часто отсутствует одна или более genome-integrity checkpoints, то ингибирование оставшихся checkpoint(s) м. делать опухолевые клетки избирательно более чувствительными к противоопухолевой терапии, такой как γ-облучение  или ДНК-повреждающие хим. в-ва. В то время как нормальные клетки будут все еще активировать свои др. checkpoint(s) и выходить из под временного ареста  клетоыного цикла, вызванного лечением, опухолевые клетки будут иметь большинство или все checkpoints подавленными и скорее всего погибнут. would be more likely to die. Напр., блокирование активности ATM/ATR с помощью кофеина, ингибирование CHK1 с помощью UCN-01 или конкуренция за субстрат CHK1/CHK2 с CDC25C-производными пептидами, будет давать в результате отмену checkpoint и преимущественную гибель опухолевых клеток после обработки ДНК-повреждающими воздействиями, особенно опухолевых клеток, уже дефицитных по p53-зависимому checkpoint пути.


Сайт создан в системе uCoz