Гены, белки и мутации
CRX


Microarray analysis of the transcriptional network controlled by the photoreceptor homeobox gene Crx Livesey F.J, Furukawa T, Steffen M.A, Church G.M, Cepko C.L. Curr.Biol. 2000. V.10. N 6. P.301-310 В развивающейся сетчатке позвоночных член paired-типа семейства ген Chx10 участвует в дифференцировке биполярных нейронов, а POU-доменовый транскрипционный фактор Brn-3b - субтипа ганглиолярных клетокю Транскрипционный фактор Crx (Cone, Rod homeoboX) играет важную роль в морфологической дифференцировке как палочек, так и колбочек Мутации Crx у человека обусловливают недостаточность роста свет-воспринимающего наружного сегмента фоторецепторов и отсутствие фототрансдукции.	Crx обычно экспрессируется в колбочках и палочках после прекращения их предшественниками клеточного цикла, но до морфологической дифференцировки. Он экспрессируется в этих двух типах клеток и пинеалоцитах в течение всей жизни. Crx является paired-типа гомеодоменовым белком, он способен связываться фоторецептор-специфичным промоторным фрагментом из вышестоящей области родопсинового и аррестинового гена. Идентифицировано 17 генов, которые диффренциално экспрессируются в нормальной и мутатной Crx сетчатке, 10 из которых являются специфичными для фоторецепторов или встречаются в фотороцепторах в больших количествах. Анализ промоторных последовательностей этих Crx генов мишеней выявил новый мотив, состоящий из расположенных голова-хвост Crx binding elements (CBEs), которые очень сходны с консенсусом связывающего сайта для димеров гомеодоменовых белков. Транскрипционная сеть, контролируемая Crx Crx контролирует экспрессию различных групп фоторецептор-специфичных и фоторецептор-обогащенных генов. Эти гены распадются на 2 категории по степени их подавления в отсутсвие Crx генов: гены, активность которых подавляется более чем в 2.5 раза при array измерении (в 5 и более раз при нозерн блотинге) и гены, которые подавляются менее чем 2.5 раза (1.5-4 при нозерн блотинге). Транскрипция генов последней группы м.б. компенсирована за счет других факторов. Подобно регуляции фоторецептор-специфичного гена IRBP геном Otx2, тем более что суть связывающих последовательностей для Otx2 и Crx очень сходна. Возможно, что эти гены ко-регулируются Otx2. Исходя из низкого уровня экспрессии в сетчатке мутантных Crx мышей некоторые предполагаемые влиятельные фотороцептор-специфичные гены не были идентифицированы. Например, β-субъединица фосфодиэстеразы палочек и различные опсины колбочек подавлялись в 1.3 раза и свыше 25 раз, соответственно, при нозерн блот анализе. Возможно это обусловлено размерами используемой библиотеки клонов, не содержащей всех генов-мишеней. Crx гены-мишени содержат новые специфичные регуляторные последовательности Помимо поиска консенсуса СВЕ путем гомологии последовательностей в 5' регуляторной области Crx генов-мишеней, использовали также поиск последовательностей законсервированного моива в промоторной области регулируемых генов. Идентифицирован новый мотив в промоторных областях предполагаемых Crx генов-мишеней. Этот мотив состоит из расположения голова-хвост одной строгой СВЕ-подобной последовательности (СТААТ), сопровождаемой второй комплементарной частичной СВЕ-подобной последовательностью (GATTN), отделенной двумя основаниями. Этот сайт обнаруживается внутри 5--150 н.п. от транскрипционной или трансляционной стартовой точк во всех доступных 5' регуляторных областях генов, подавляемых у мутантов Crx. Помимо генов, идентифицированных в данном исследовании известны два других гена, которые также подавляются в мутантной Crx сетчатке, ген, кодирующий α-трансдуцин колбочек, и ген, кодирующий голубой опсин. У человека промоторы обих этих генов содержат этот же мотив. Этот мотив законсервирован также в промоторах родопсина кур и телят и расположен в ВАТ-1 сайте промотора телят. Этот мотив был также выявлен внутри или по соседству с контролирующей областью локуса красно-зеленого опсина колбочек человека. Однако очень слабо походий мотив обнаружен в промоторе красно-зеленого опсина мыши и не обнаружен в голубом опсине мыши, в генах более чем в 20 раз снижающих свою активность у Crx мутантов. Отдаленно напоминающий мотив обнаружен в фоторецепторном гене IRBP, который не подавляется в отсутствие функции Crx, не обнаружен мотив в ROM1 промоторе. гене, чья экспрессия не меняется в Crx мутантной сетчатке. Проксимальные 123 п.н. промотора IRBP могут трансактивироваться с помощью Crx в клеточных линиях. однако они связываются специфически с Otx2. Это подтверждает, что экспресия IRBP in vivo не регулируется с помощью Crx. Итак, показано, что Crx связывается и трансактивирует сайты, содержащие консенсус СВЕ последовательностей Т/СЕААТС/Т, что присутствие, по крайней мере, одной строгой СВЕ последовательности в этом мотиве обязательно, что специфичность этого сайта в 5' области генов подавляется в отсуствие фунеции Crx и что консервация Crx мотива по последовательности и положению обнаруживается в генах мышей и человека. Расположение CBEs внутри мотива указывает на то, что Crx м. связываться с промторной областью генов-мишеней как гомодимер или гетеродимер с другим белком, таким как Otx2. Связываение гомеодоменовых транскрипционных факторов с ДНК в виде димеров является обычным. Сайт связывания гомеодоменового димера обычно содержит палиндромную последовательность ТААТ, разделенную фиксированным пробелом в 3 основания, где белок содержит лизиновый остаток в положении 50 гомеодомена. Это очень сходно с консенсусом, выявленным в промоторах. Хотя эти последовательности асимметричны, гомодимеры гомеодоменовых белков связываются как обычно с этими последовательностями промоторов генов-мишенй. Мутации в большинстве генов, идентифицированных как мишени для Crx, вызывают дегенерацию фоторецепторов. Напр., мутации в родопсине или в RP-1 гене вызывают пигментный ретинит. Очевидно, что снижение экспрессии всех Скч генов-мишеней делает невозможным конструкцию морфологически дифференцированных фоторецепторов. Итак, Crx контролирует экспрессию базового набора фоторецепторных генов, участвующих в ряде различных функций, характерных для диффренированных фоторецептров. Они имеют мотив в 11 оснований, сходный со стандартным сайтом связывания гомеодоменовых димеров. Табл. Гены, дифференциально экспрессирующиеся в нормальной и Crx сетчатке ___________________________________________________________________ Ген Тип клеток Функция СВЕ Crx мотив ______________________________________________________________________ Rod transducin Палочки Фототрансдукция + + Spots 265,433 ? Recoverin RhR,bipolar Фототрансдукция ? ? XLRS1 RhR Межклеточн.сигнализация + ? Spot 678 ? Rhodopsin Палочки Фототрансдукция + + Spot 501 PhR/INL ? Spot 54 INL ? AIP INL/GC Передача сигналов ? PDE gamma Палочки Фототрансдукция + + Spot 77 ? Spot 491 ? Spot 140 Палочки ? Arrestin Палочки Фототрансдукция + + Peripherin PhR Интеграция фоторецеп.диска ? ? Phosducin Палочки Фототрансдукция + + Retinitis pigmentosa-1 PhR ? + ? T-type calcium channel Биполярные ? _______________________________________________________________________ PhR - палочковидные и конусовидные фоторецепторы, bipolar - биполярные нейроны

Crx обычно экспрессируется в колбочках и палочках после прекращения их предшественниками клеточного цикла, но до морфологической дифференцировки. Он экспрессируется в этих двух типах клеток и пинеалоцитах в течение всей жизни. Crx является paired-типа гомеодоменовым белком, он способен связываться фоторецептор-специфичным промоторным фрагментом из вышестоящей области родопсинового и аррестинового гена.

Идентифицировано 17 генов, которые диффренциално экспрессируются в нормальной и мутатной Crx сетчатке, 10 из которых являются специфичными для фоторецепторов или встречаются в фотороцепторах в больших количествах. Анализ промоторных последовательностей этих Crx генов мишеней выявил новый мотив, состоящий из расположенных голова-хвост Crx binding elements (CBEs), которые очень сходны с консенсусом связывающего сайта для димеров гомеодоменовых белков.

Транскрипционная сеть, контролируемая Crx

Crx контролирует экспрессию различных групп фоторецептор-специфичных и фоторецептор-обогащенных генов. Эти гены распадются на 2 категории по степени их подавления в отсутсвие Crx генов: гены, активность которых подавляется более чем в 2.5 раза при array измерении (в 5 и более раз при нозерн блотинге) и гены, которые подавляются менее чем 2.5 раза (1.5-4 при нозерн блотинге). Транскрипция генов последней группы м.б. компенсирована за счет других факторов. Подобно регуляции фоторецептор-специфичного гена IRBP геном Otx2, тем более что суть связывающих последовательностей для Otx2 и Crx очень сходна. Возможно, что эти гены ко-регулируются Otx2.

Исходя из низкого уровня экспрессии в сетчатке мутантных Crx мышей некоторые предполагаемые влиятельные фотороцептор-специфичные гены не были идентифицированы. Например, β-субъединица фосфодиэстеразы палочек и различные опсины колбочек подавлялись в 1.3 раза и свыше 25 раз, соответственно, при нозерн блот анализе. Возможно это обусловлено размерами используемой библиотеки клонов, не содержащей всех генов-мишеней.

Crx гены-мишени содержат новые специфичные регуляторные последовательности

Помимо поиска консенсуса СВЕ путем гомологии последовательностей в 5' регуляторной области Crx генов-мишеней, использовали также поиск последовательностей законсервированного моива в промоторной области регулируемых генов. Идентифицирован новый мотив в промоторных областях предполагаемых Crx генов-мишеней. Этот мотив состоит из расположения голова-хвост одной строгой СВЕ-подобной последовательности (СТААТ), сопровождаемой второй комплементарной частичной СВЕ-подобной последовательностью (GATTN), отделенной двумя основаниями. Этот сайт обнаруживается внутри 5--150 н.п. от транскрипционной или трансляционной стартовой точк во всех доступных 5' регуляторных областях генов, подавляемых у мутантов Crx.

Помимо генов, идентифицированных в данном исследовании известны два других гена, которые также подавляются в мутантной Crx сетчатке, ген, кодирующий α-трансдуцин колбочек, и ген, кодирующий голубой опсин. У человека промоторы обих этих генов содержат этот же мотив. Этот мотив законсервирован также в промоторах родопсина кур и телят и расположен в ВАТ-1 сайте промотора телят. Этот мотив был также выявлен внутри или по соседству с контролирующей областью локуса красно-зеленого опсина колбочек человека. Однако очень слабо походий мотив обнаружен в промоторе красно-зеленого опсина мыши и не обнаружен в голубом опсине мыши, в генах более чем в 20 раз снижающих свою активность у Crx мутантов.

Отдаленно напоминающий мотив обнаружен в фоторецепторном гене IRBP, который не подавляется в отсутствие функции Crx, не обнаружен мотив в ROM1 промоторе. гене, чья экспрессия не меняется в Crx мутантной сетчатке. Проксимальные 123 п.н. промотора IRBP могут трансактивироваться с помощью Crx в клеточных линиях. однако они связываются специфически с Otx2. Это подтверждает, что экспресия IRBP in vivo не регулируется с помощью Crx.

Итак, показано, что Crx связывается и трансактивирует сайты, содержащие консенсус СВЕ последовательностей Т/СЕААТС/Т, что присутствие, по крайней мере, одной строгой СВЕ последовательности в этом мотиве обязательно, что специфичность этого сайта в 5' области генов подавляется в отсуствие фунеции Crx и что консервация Crx мотива по последовательности и положению обнаруживается в генах мышей и человека.

Расположение CBEs внутри мотива указывает на то, что Crx м. связываться с промторной областью генов-мишеней как гомодимер или гетеродимер с другим белком, таким как Otx2. Связываение гомеодоменовых транскрипционных факторов с ДНК в виде димеров является обычным. Сайт связывания гомеодоменового димера обычно содержит палиндромную последовательность ТААТ, разделенную фиксированным пробелом в 3 основания, где белок содержит лизиновый остаток в положении 50 гомеодомена. Это очень сходно с консенсусом, выявленным в промоторах. Хотя эти последовательности асимметричны, гомодимеры гомеодоменовых белков связываются как обычно с этими последовательностями промоторов генов-мишенй.

Мутации в большинстве генов, идентифицированных как мишени для Crx, вызывают дегенерацию фоторецепторов. Напр., мутации в родопсине или в RP-1 гене вызывают пигментный ретинит. Очевидно, что снижение экспрессии всех Скч генов-мишеней делает невозможным конструкцию морфологически дифференцированных фоторецепторов.

Итак, Crx контролирует экспрессию базового набора фоторецепторных генов, участвующих в ряде различных функций, характерных для диффренированных фоторецептров. Они имеют мотив в 11 оснований, сходный со стандартным сайтом связывания гомеодоменовых димеров.


Табл.
Гены, дифференциально экспрессирующиеся в нормальной и Crx сетчатке
___________________________________________________________________
Ген                    Тип клеток        Функция       СВЕ   Crx мотив
______________________________________________________________________
Rod transducin         Палочки       Фототрансдукция    +      +
Spots 265,433                                            ?
Recoverin            RhR,bipolar      Фототрансдукция    ?     ?
XLRS1                   RhR      Межклеточн.сигнализация +     ? 
Spot 678                                                 ?
Rhodopsin              Палочки        Фототрансдукция    +     +
Spot 501               PhR/INL                           ?
Spot 54                   INL                            ?
AIP                    INL/GC       Передача сигналов    ?
PDE gamma                Палочки       Фототрансдукция   +     +
Spot 77                                                  ?
Spot 491                                                 ?
Spot 140                 Палочки                         ?
Arrestin                 Палочки       Фототрансдукция   +     +
Peripherin                 PhR    Интеграция фоторецеп.диска ? ?
Phosducin                Палочки        Фототрансдукция  +     +
Retinitis pigmentosa-1     PhR               ?           +     ?
T-type calcium channel   Биполярные                      ?
_______________________________________________________________________

PhR - палочковидные и конусовидные фоторецепторы, bipolar - биполярные нейроны

Гены, белки и мутации

Транскрипционная сеть, контролируемая Crx

Crx гены-мишени содержат новые специфичные регуляторные последовательности