Cytokines регулируют лимфоидные клетки на всех стадиях их развития, их дифференцировку и активацию. Некоторые, такие как IL-2 необъходимы для контроля и поддержания гомеостаза иммунной системы. Др. ответственны за раннее развитие лимфоцитов и дифференцировку naive CD4⁺ helper T (T_H) клеток, с IL-12 и IL-4 способствующими поляризации T_H1 и T_H2, соотв. T_H1 клетки секретируют IFN-γ, который повышает клеточный иммунитет против внутриклеточных патогенов, тогда как T_H2 клетки продуцируют IL-4 и др. cytokines, которые способствуют antihelminthic иммунитету и аллергическим заболеваниям. Клетки из T_H1 и T_H2 клонов отличаются не только по своей способности продуцировать различные цитокины, но и имеют отличия в экспрессии рецепторов и транскрипционных факторов и даже фундаментальные отличия в организации их плазматических мемран.

Microarray эффективно используется для выявления различий между субтипами клеток. Т.к. IL-12 важен для дифференцировки naive CD4⁺ T клеток в T_H1 клетки, поэтому авт. использовали этот подход для изучения его эффектов на экспрессию генов. Было идентифицировано более 200 генов, которые быстро индуцировались в ответ на IL-12, включая и такие как IFN-γ, Socs-1, IL-12Rβ2, IL-18R, IRF-1, CCR5, и GADD45, как известно, регулируемые этим цитокином. Среди генов с неизвестной функцией, индуцируемых IL-12, привлекли наибольшее внимание, это идентифицированный в базе данных белок B3-1/36.3K, содержащий zipper, cytohesin-связывающий белок HE и pleckstrin homology, Sec7, and Coiled-coil Domains-binding protein (PSCDBP).

Cytohesins это семейство guanine nucleotide-exchange proteins (GEPs) для 20-kDa ADP ribosylation factor (ARF) GTPases, которые ассоциируют также с интегринами и регулируют адгезию клеток. Cytohesin-1 выделен из дрожжей с помощью внутриклеточного домена интегрина CD18 в качестве наживки (bait), он участвует в регуляции адгезии лимфоцитов посреством LFA-1. Предполагаемые аминокислотные последовательности распознаются как идентичные с таковыми у ранее изолировнных клонов с помощью subtractive hybridization [natural killer (NK) cells minus T_H Jurkat cells]. Избыточная экспрессия cytohesin-1 в клетках Jurkat увеличивает их способность связывать ICAM-1, тогда как избыточная экспрессия мутантного белка без GEP активности снижает адгезию и блокирует его стимуляцию с помощью phorbol myristoyl acetate.

В работе приводятся некоторые характеристики cytohesin-1-связывающего белка, экспрессия которого регулируется цитокинами. Его мРНК наиболее обильна в гематопоэтических тканях и увеличивается заметно при инкубации peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) с IL-2 и IL-12. Рекомбинантный белок, связывающий cytohesin-1, и coiled-coil домены двух белков были идентифицированы как отвечающие за это взаимодействие. Этот вновь идентифицированный связывающий белок, модифицирующий активацию ARF cytohesin-1, авт. назвали Cybr как cytohesin binder and regulator. Discussion

Cytokines являются критическими для развития и дифференцировки лимфоцитов, но контролируют также и др. события, такие как адгезия. перестройка цитоскелета и поляризация клеток. Известно как сигнал, инициированный связыванием цитокинов с их рецепторами, передается в ядро. Однако, какие в точности гены цитокинов регулируют и как они контролируют дифференцировку лимфоцитов и эффекторные функции все еще неясны. С помощью microarray технологии сравнивали регуляцию экспрессии генов после инкубации клеток цитокинами. Описана и частично охарактеризована идентифицированная кДНК , мРНК которой остро увеличиваются в NK клетках и PBMCs с помощью стимуляции IL-2 и IL-12 и конститутивно экспрессируются в T_H1, но не в T_H2 CD4⁺ T cells, которая обозначена Cybr.

Эта кдНК выделена первоначально из NK/T клеточной библиотеки и была названа B3-1/36.3K leucine zipper-содержащим белком, который как предположили является транскрипционным фактором из-за leucine-zipper домена. Он был также обнаружен в GenBank как cytohesin-связывающий белок HE, или PSCDBP, без информации о его функции. Известно было о его преимущественной экспрессии в T_H1 субнаборе. Для выяснения функции Cybr начат поиск родственных белков и было найдено, что Cybr сходен с GRASP, др. недавно описанным белковым продуктом. GRASP экспрессируется в головном мозге, сердце и легких, тогда как мы обнаружили высокие количества мРНК Cybr в PBLs, селезенке, тимусе и лимфатических узлах.

Cytohesins являются семейством GEPs, которые активируют 20-kDa ARF GTPases, катализируя замещение связей GDP с GTP. Хотя это продемонстрировано только для 4-х cytohesins, их очевидное сходство по структуре доменов, а также аминокислотных последовательностей, согласуется с предположением о сходстве их функции. ARF GEP активность располагается в домене Sec7 (так во всех ARF GEPs), который на >77% идентичен среди cytohesins. Эта часть молекулы безусловно не участвует во взаимодействии с Cybr, не делает этого и pleckstrin homology домен, который скорее всего является высоко законсервированным у cytohesins и отвечает за специфичность их ассоциации с polyphosphoinositides. Наиболее отличающаяся область C-терминальная область, которая у cytohesin-1 и -2 содержит потенциально регуляторные сайты фосфорилирования, также, по-видимому, не связана со взаимодействием с Cybr, для которого, по-видимому, необходим только суперскрученный (coiled-coil) домен в первых 55 остатках N конца cytohesin-1.

Показано, что взаимодействие вовлекает и coiled-coil домен Cybr. Домен PDZ у Cybr не обязателен, он, по-видимому, не обеспечивает гомодимеризацию. Домены PDZ, как известно, участвуют в межбелковых взаимодействиях и в образовании мультибелковых комплексов. Идентификация белков, с которыми Cybr PDZ домен взаимодействует, позволит понять его внутриклеточную функцию и/или локализацию. После делеции N-терминальной области, включая и PDZ домен GRASP, белок начинает распределяться диффузно по цитоплазме скорее, чем локализоваться в плазматической мембране.

Cytohesin-1 участвует в адгезии лимфоцитов за счет своего взаимодействия с β2 chain (CD18) интегрина LFA-1. И IL-2, и IL-12, как известно, играют роль в адгезии и миграции Т клеток, и это очевидно связано с их эффектами на экспрессию белка, который взаимодействует с cytohesin-1. Авт. установили, что мРНК Cybr необнаружима в Jurkat клетках, которые постоянно экспрессируют cytohesin-1. Необходимо определить, зависит ли LFA-1-опосредованная адгезия от Cybr-cytohesin-1 взаимодействия и является ли усиление активности Cybr необходимым для активности cytohesin-1.

Др. cytohesins также присутствуют в клетках и тканях гематопоэтической системы. Cytohesin-4 обнаруживается преимущественно в PBLs, селезенке, тимусе и культивируемых линиях клеток миэлоидного ростка. Сytohesin-3 выявлен в anergic T_H1 клетках и , как полагают, важен для стабильности anergic клеток и LFA-1-опосредованной адгезии. Т.к. множественные члены семейства cytohesin экспрессируются в гематопоэтических тканях, то важно сравнить эффекты Cybr на все иммунологически экспрессирующиеся cytohesins.

ARFs являются малыми GTPases, которые участвуют в многочисленных путях переноса пузырьков. Они активируют также phospholipase D и phosphatidylinositol-4 phosphate 5-kinase, продукты реакции которых, phosphatidic acid и phosphatidylinositol4-5-bisphosphate, м. регулировать актин-связывающие белки и , следовательно, перестройку цитоскелета. Среди многочисленных путей, которые активируют цитокины, те, которые используют phosphoinositide 3-kinase, являются наиболее важными. Хотя не выявлено прямой связи между ARFs и эффектами цитокинов на экспрессию Cybr, эффекты Cybr на активацию ARF м. на самом деле указывать на такую связь. Индукция цитокинами Cybr указывает на потенциальную связь между этими иммунорегуляторными молекулами и действием ARF, др. механизмом. с помощью которого цитокины м. регулировать функцию лимфоцитов. Важно помнить, что не все действия cytohesin-1 нуждаются в активности GEP, а эффекты Cybr на др. cytohesin еще надо определить.