Семейство Dlx у млекопитающих состоит из 6 генов, родственных Drosophila Distal-less (Dll). Гены млекопитающих формируют бигенные кластеры. Пары генов, обозначеные Dlx2-1, Dlx5-6 и Dlx3-7, организованы инвертированным, конвергентно транскрибируемым образом. Было предположено, что одиночный ген Dlx был удвоен и сформирровал родоначальный инвертированный бигенный кластер во время эволюции у ранних хордовых и затем удвоения дали множественные бигенные кластеры. Предполагается, что три Dlx кластера подверглись удвоению вместе с кластерами Hox генов, т.к. Dlx2-1,5-6, и3-7 тесно сцеплены с Hox D, A и B кластерами, соответственно. Имеется определенная степень перекрывания пространственной и временной экспрессии между сцепленными Dlx генами на эмбриональной стадии (E) E10.5. Предложены модели для объяснения этих перекрывающихся паттернов, включая общие цис-регуляторные последовательности между спаренными генами. В работе анализировался Dlx3-7 бигенный кластер на предмет обнаружения общего энхансера, контролирующего экспрессию биогена.

Ген Dlx3 мыши впервые экспрессируется слабо в ростральной эктодерме, кпереди от нервной пластинки во время стадии головной складки. Dlx3 экспрессируется на ст. E8.5 в эктоплацентном конусе и хориональной пластинке, достигая высокого уровня экспрессии на E10.5 в лабиринтном слое эмбриональной плаценты. Dlx3 экспрессируется в первой и второй висцеральных дугах и фронто-назальной эктодерме на ст. E9.5. Позднее Dlx3 экспрессируется также наружном респираторном эпителии ноздрей, в фолликулах усов, зачатках вкусовых почек, зубном и молочных желез эпителии, apical ectodermal ridge (AER) зачатков конечвностей, зачатках гениталий и некоторых дополнительных сайтах эпителиально-мезенхимных взаимодействий. В конце эмбрионального развития активность Dlx3 подавляется за исключением кожи, где он транскрибируется в многослойном жпидермисе и в матричных клетках волосяных фолликулов. Паттерн экспрессии Dlx3 отличается в некоторых отношениях при сравнении и биогенными кластерами Dlx2-1 и Dlx5-6 тем, что Dlx3 не экспрессируется в ЦНС а в основном экспрессируется в редавно приобретенных структурах, общим для млекопитающих. Dlx7 имеет перекрывающийся паттерн экспрессии с Dlx3 в висцеральных дугах и в зачатках конечностей до E10.5.

Гены Dlx представляют собой интересную модель регуляции кластрированных генов благодаря их расположению в виде пар. Факт, что все кластеры млекопитающих имеют одно и то же геномное расположение , указывает на то, что кластеры не подвергаются экстенсивным перестройкам. Кластер Dlx3-7 представляет для нас специальный интерес благодаря паттерну своей экспресcии, не осложненной экспрессией в ЦНС.

Genomic Organization of the Dlx3-7 Bigene Cluster.

Получены P1/PAC клоны человека и мыши, перекрывающие весь двугенный кластер Dlx3-7, включая фланкирующие области. Клоны полностью секвенированы: клон человека hP1-1490 соответствует 75,022 nt, тогда как клон мыши mP1-972 соответствует 78,651nt. Dlx7 и Dlx3 гены у обоих видов транскрибируются конвергентно и содержат три экзона. Следовательно, м. подразделить бигенный кластер на три домена: межгенная 3' область, общая обоим генам, фланкирующая 5' вышестоящая область, уникальная для Dlx7 гена, и фланкирующая 5' область, уникальная для Dlx3 гена (Рис. 1 и 2). Межгенные области у обоих видов занимают 17 kb. По крайней мере 7 kb последовательностей выше места старта трансляции Dlx3 и по крайней мере 37 kb последовательностей выше стартовой точки трансляции Dlx7 в обоих клонах.

Сравнение бигенного кластера Dlx3-7 с его паралогами у человека, а именно, с DLX2-1 и DLX5-6 выявило общее сходство геномной организации этих кластеров. Все обнаруживают конверогентную трансляцию, имеют три экзона, 5'-фланкрирующие и 3'-межгенный домены. Сходство последовательностей обнаружено только в гомеодоменах.

Подсчет synonymous и nonsynonymous замен для кодирующих областей Dlx7 и Dlx3 генов у мышей и человека в каждом экзоне по Nei and Gojobori показал, что кодирующие последовательности гена Dlx3 боле сильно законсервированы, чем гена Dlx7 во всех трех экзонах. (Табл. 1). Отношение nonsynonymous к synonymous (d_N/d_S) равное 1 одно из предсказуемых для neutrally evolving генов. Во всех трех экзонах отношение значений достоверно ниже единицы, это говорит о том, что Dlx3 и Dlx7 находятся под функциональным ограничением. Однако, все три экзона Dlx7 имеют тношение значительно более высокое, чем Dlx3, следовательно, Dlx7 белок развивается быстрее, чем Dlx3

Noncoding Genomic Domain Comparisons Between the Mouse and Human Dlx3-7 Bigene Clusters.

Во-первых, осуществлен plot анализ некодирующих последовательностей мыши и человека (Рис. 1) и обнаружены сходства в ольшинстве областей за исключением области 12- - 21-kb мыши (Рис. 2), эквивалентной позиции 8-15 kb карты человека. Во-вторых, использовали процент идентичности plot анализ, чтобы сравнить геномные последовательности (reference sequence) мыши и человека и наити общие законсервированые мотивы (Рис. 2).

Выявлена высокая консервация области в 30-kb карты мыши в позиции 44-74 kb , которая включает Dlx7 и Dlx3 гены(Рис. 2). Выявлено три области высокого сходства (~85%) во фланкирующих доменах (Рис. 2; red color code). Имеется также 5 законсервированных некодирующих регионов в Dlx3-7 межгенной области (Рис. 1, orange color code, и Рис. 3). Элемент I37-1 наиболее сильно законсервирован с 90% идентичности. Элемент I37-5, по-видимому, является частичной дупликацией I37-1 идентичен на 80% >40 bp (Рис. 3). Элемент I37-1обнаруживает также сходство с элементом межгенного домена dlx3-7 у рыбок данио. Элементы I37-2, I37-3, и I37-4 идентичны на 88%, 82%, и 87%, соотв., у человека и мыши (Рис. 3).

Functional Properties of Intergenic Domain Conserved Elements.

Перенос большой инсерции в pClasper и его последующая модификация в репортерную конструкцию осуществлена без существенных перестроек (Рис. 4). Репортреная конструкция Dlx37-lacZ-79-kb вырезалась из pClasper и инъецировалась в пронуклеусы мышиных зигот для получения трансгенных животных. Проанализировано 4 transient эмбриона и 5 независимо полученных стабильно трансформированные линии.

Экспрессия репортерного гена обнаружена в зачатках кончностей и хвоста (Рис. 5 bB) на ст. E9.5 , а также в перыой и второй висцеральных дугах. Экспрессия наблюдалась в AER зачатков конечностей и в некоторых клетках вентральной эктодермы зачатков конечностей на ст. E10.5.Высокий уровень экспрессии обнаружен в мезенхиме дистальных, каудальных частей мандибулярных отростков первой висцеральной дуги и дистальных латеральных частях второй бранхиальной дуги (Рис. 5bE).Сходные паттерны экспрессии по сравнению с таковыми эндогенных генов (Рис. 5 bA указывают на воспроизведение Dlx37-lacZ-79-kb репортерной конструкцией обычного паттерна экспрессии и на наличие в ней соотв. критических контролирующих элементов.

Экспрессия в фронтоназальной эктодерме и эктодерме ростральной срединной линии первой дуги выявляется при гибиридизации in situ (Рис. 5> bA и bD), но не у трансгенных животных (Рис. 5 bB и bE). Во вторых, некоторые трансгенные эмбрионы обнаруживают экспрессию LacZ по дорсальной срединной линии, которая не выявляется при гибридизации in situ. В некоторых случаях выявляется выраженная экспрессия по дорсальной срединной линии и в черепно-лицевой области. У стабильных трансформантов по этой линии обнаруживаютя дефекты закрытия нервной трубки с 50% пенетрантностью. Причина этой аномалии невыяснена; это м.б. результатом over- или misexpression Dlx7, который не выключен в конструкции.

Тестировали субконструкцию Dlx37-lacZ-19kb, в которой отсутствует Dlx7 и его фланкирующие элементы. Эта конструкция сожержит Dlx3-кодирующие экзоны с lacZ инсерцией и межгенные законсервированные элементы I37-1 и I37-3 (Рис. 5a). Паттерны экспрессии от независимых основателей линий были сходны (Рис. 5 bC и bF). Экспрессия обнаруживалась в AER зачатков передних и задних конечностей га ст. E9.5 и E10.5. Причем паттерны экспрессии очень сходны с теми, что наблюдались с конструкцией Dlx37-lacZ-79kb. Однако, не обнаружено экспрессии Dlx3 репортера в первой и второй висцеральных дугах. Это указывает на то, что законсервированные элементы проксимальнее Dlx7 необходимы для экспрессии Dlx3 в висцеральных дугах.

Discussion

Двугенный Dlx3-7 кластер один из трех кластеров Dlx у млекопитающих. Эти кластеры обнаруживают общую конвергентную транскрипционную ориентацию и сцеплены с Hox кластерами, указывая тем самым, что они все возникли в результате последовательных удвоений кластера.

Nonsynonymous to synonymous rate анализ между белковыми последовательностями человека и мыши показали, что Dlx3 является наиболее эволюционно законсервированным, чем Dlx7 (Табл. 1). Имеется два возможных объяснения. Во-первых, Dlx3 сохранил больше своих оригинальных функций из двух удвоенных егнов, тогда как Dlx7 развивался более свободно от функциональных ограничений. Во-вторых, Dlx7 развивался в условиях направленного отбора. Некоторые доказательства подчеркивают важность различий в функциях двух генов, несмотря на частичные паттерны перекрывания экспресиии. Во-первых, Dlx7, по-видимому, играет важну роль в гематопоэзе, которая не выявлена для Dlx3. Оба гена, с др. стороны, экспрессируются в плаценте, но Dlx7 не м. компенсировать потерю функции мутаций Dlx3? которые вызывают эмбриональную гибель из-за нарушений плаценты. Дивергенция белковых потребностей Dlx7 между мышью и человеком м.б. связана с неизвестными изменениями функции белка.

Сравнение двугенных кластеров Dlx3-7 выявляет существенную консервацию последовательностей в некодирующих областях, включая 5' стоящие выше промотора области обоих генов и 3' стоящую ниже межгенную область, общую обоим. Последняя м.б. сайтом критических общих энхансеров, возниших в тандемной дупликации, создавшей бигенный кластер. Имеется пять предполагаемых контрольных элементов, которые обнаруживают высокий уровень сходства последовательностей в межгенной области мыши и человека. (Рис. 3). Более того, элемент IG73-1 обнаруживает последовательности, сопоставимые с элементов в соотв. двугенном кластере dlx3-7 рыбок данио. Последние имеют дополнительный Dlx7 ген, названный dlx8, который действительно является ортоголом гена Dlx7 у млекопитающих. Следовательно, возможно, что дополнительные законсервированные элементы м. существовать между кластером Dlx3-7 млекопитающих и геном dlx8 у рыбок данио как следствие cis-element subfunctionalization между кластерами удвоенных генов.

Сравнивали последовательности inter se среди трех Dlx бигенных кластеров внутривидов млекопитающих. Было выявлено значительное сходство только в гомеодоменах, но не в др. кодирующих или некодирующих областях. Авт. находят это аномальным, т.к. все кластеры произошли из общего предшественника и паттерны экспрессии всех генов частично перекрываются. Как м.б. паттерны экспрессии частично законсервированы, тогда как контрольные последовательности подверглись существенным модификациям после удвоения кластеров? Предполагается существование двух взаимосвязанных процессов. Первый назван тонкой регулировкой ("fine-tuning"), элементы связывающие транскрипционный фактор, которые сами себя кластрируют в модули или enhanceosomes, испытывают потери, добавления или модификации случайным образом, но некоторые из этих изменений дают преимущества и отбираются или дрефуют, чтобы быть зафиксированными, в результате образуются новые адаптивные паттерны экспресии. Второй процесс назван "compensation", последовательности изменений происходят случайно и непосредственно не элиминируются с помощью очищающей селекции из-за избыточности или буферизации во всем энхансерном модуле. Устойчивые паттерны экспресии поддерживаются с помощью балансирующего отбора по последующим компенсаторным изменениям. Авт. полагают, что оба эти процесса происходят в бигенных кластерах Dlx. Т.о., последовательные модификации постоянно вносятся, стирая сходство последовательностей. Тонкая настройка контролирующих элементов дает в результате функционально важные изменения в паттерне экспрессии индивидуального гена или кластера , тогда как процесс компенсации поддерживает общее сходство перекрывающихся паттернов экспресии между генами.

Предпринята попытка определить функцию некодирующих законсервированных элементов. Репортерная конструкция, содержащая геномный фрагмент в 79-kb с LacZ инсерцией в экзоне 1 гена Dlx3 способна воспроизводить экспрессию в хвостовой почке, конечностях и висцеральных дугах, очень напоминающую эндогенную экспрессию Dlx3 на ст. E9.5 и E10.5 (Рис. 5). Это подтверждает мнение, что большинство цис-элементов необходимое для собственно экспресии Dlx3 содержится в этой конструкции. В висцеральных дугах Dlx37-lacZ-79kb конструкция м. инициировать мезенхимную экспрессию в дистальных кончиках дуг на ст. E9.5, где находятся постмиграторные клетки нейрального гребня. На ст. E10.5, экспрессия репортерного гена ограничивается каудальной частью мандибулярных отростков в соответствии с эндогенной экспрессией. В зачатках передних и задних конечностей экспресия выявляется на ст. E9.5. На этой ст. развития репортерный ген экспрессируется в широкой области латерального эпителия и слабо в AER. Экспрессия ограничивается AER позднее на ст. E10.5. Экспрессия репортера отсутствует в фронто-назальном отростке, хотя транскрипты Dlx3 обнаруживаются с помощью гибиридизации in situ. Это м.б. объяснено отсутствием определенных контролирующих элементов в используемой конструкции. В частности, Dlx3 5'-фланкирующая часть Dlx37-lacZ-79kb относительно коротка, всего 7 kb в длинну.

Бигенные кластеры Dlx интересны тем, что два гена имеют перекрывающиеся паттерны экспрессии ~ E10.5. Некоторые авт. полагают, что сходство паттернов экспрессии внутри кластера обусловлено энхансером, общим между двумя сцепленными генами, выдвинуто три гипотетические модели удвоения исходных тандемных генов для объяснения сходства паттернов экспрессии. В модели A, одиночный контролирующий элемент выше одного из генов м регулировать оба гена сходным образом. В модели B, Одиночный контролирующий элемент, локализованный в межгенной области регулирует оба гена сходным образом. В модели C, отдельные элементы локлизованы выше каждого из генов и регулируют оба сходным образом. Модели A и B are согласуются с идеей общего энхансера для Dlx7 и Dlx3. Трансгенная конструкция Dlx37-LacZ-19kb исключает модель C, т.к. экспрессия в висцеральных дугах Dlx3 теряется, если цис-элементы проксимальнее Dlx7 делетированы. Это говорит в пользу общего энхансера.

				M. J. Depew, T. Lufkin, and J. L. R. Rubenstein Specification of Jaw Subdivisions by Dlx Genes Science, October 11, 2002; 298(5592): 381 - 385. [Abstract] [Full Text] [PDF]

				G. Panganiban and J. L. R. Rubenstein Developmental functions of the Distal-less/Dlx homeobox genes Development, January 10, 2002; 129(19): 4371 - 4386. [Abstract] [Full Text] [PDF]