Divalent interaction of the GGAs with the Rabaptin-5-Rabex-5 complex.
Mattera, R. et al. EMBO J.22, 78-88 (2003) | |
FURTHER READING Boman, A. L. GGA proteins: new players in the sorting game. J. Cell Sci.114, 3413-3418 (2001) |
WEB SITE
В клтках функцию транспортировки, по-видимому, выполняют GGA (Golgi-localized, γ-ear-содержащие, ADP-ribosylation factor (Arf)-связывающие) белки. GGAs ассоциируют с цитозольной стороной trans-Golgi network (TGN) и сортируют mannose 6-phosphate рецепторы (MPRs) на - и GGA-покрытые носители, которые затем транспортируются в эндосомы. Взаимодействия, которые осуществляют эти носители с эндосомами, неясны.
Мономерные GGA белки содержат 4 домена: (который связывает MPRs); GAT домен (который связывает активрованные ГТФ-связывающие белки семейства Arf; шарнирная область (которая связывает clathrin); и GAE домен, который как полагают, связывает акцессорные факторы, которые м. регулировать функцию GGA-содержащих оболочек или GGA-покрытые носители.
Bonifacino с сотр. анализировали взаимодействие селевеческих GGAs (, и ) с , белком, который является важным для в эндосомном слиянии. Было известно, что GGA-GAE–Rabaptin-5 взаимодействия слабые и считалось, возможно не имеют физиологического значения.
В экспреименте использовали различные glutathione-S-transferase (GST)–GGA домены и Rabaptin-5 из цитозоля головного мозга телят и было установлено, что GGA-GAE домены взаимодействуют с Rabaptin-5 в комплексе Rabaptin-5– (комплекс, который регулирует эндосомное слияние), и что эти взаимодействия сильнее, чем это предполагалось ранее. Они подтвердили, что GGA–Rabaptin-5 взаимодействие происходит in vivo в результате иммунопреципитации эндогенных белков.
C помощью дрожжевой двугибридной системы авт. анализировали структурно детерминанты взаимодействия GGA–Rabaptin-5. Было показано, что остатки 428–455 Rabaptin-5, которые, как полагают, скручиваются случайно, содержат минимальные последовательности, необходимые для взаимодействий с GAE доменами у GGA1–3. Кроме того было показано, что взаимодействие GGA–Rabaptin-5 является двухсоставным для GGA1 и GGA2, т.к. С-терминальный coiled-coils у Rabaptin-5 взаимодействует с GAT доменами этих GGAs.
Используя alanine-scanning мутагенез авт. смогли определить предполагаемый GGA-GAE-связывающий мотив в Rabaptin-5. Это мотив FGXLV из остатков 439–443, где X любая из аминокислот.
Что же происходит, когда Rabaptin-5 соединяется с GGAs? Авт. изучали влияние His6-нагруженных фрагментов Rabaptin-5 на связывание клатрина с GST–GGA-hinge+GAE конструкцией in vitro и нашли, что Rabaptin-5 оказывает влияние на взаимодействия clathrin–GGA.
Наконец, изучали изменения в локализации GGA1 и ассоциированного с ним груза MPR в клетках HeLa после того каек эти клетки были трансфицированы –Rabaptin-5. Пред трансфекцией они обнаруживали GGA1 и его груз в TGN, тогда как после трансфекции, эндогенный GGA1 и MPR обнаруживались в Rabaptin-5-стабилизированных больших эндосомах.
Эти результаты выявляют "...a functional link between proteins regulating TGN cargo export and endosomal tethering/fusion events". Было предположено, что GGA–Rabaptin-5–Rabex-5 взаимодействия заставляют клатрин высвобождаться из GGA-покрытых промекжуточных образований или предупреждают посторное связывание клатрина, которое м.б. позволить TGN-производным носителям сливаться с эндосомами и высвобождать свой груз MPR.