|
Saneela Anwar, Rashid Minhas, Shahid Ali et al. Identification and functional characterization of novel transcriptional enhancers involved in regulating human GLI3 expression during early development Development, Growth & Differentiation Volume 57, Issue 8, October 2015, Pages 570-580
The zinc-finger transcription factor GLI3 acts as a primary transducer of Sonic hedgehog (Shh) signaling in a context-dependent combinatorial fashion. GLI3 participates in the patterning and growth of many organs, including the central nervous system (CNS) and limbs. Previously, we reported a subset of human intronic cis-regulators controlling many known aspects of endogenous Gli3 expression in mouse and zebrafish. Here we demonstrate in a transgenic zebrafish assay the potential of two novel tetrapod-teleost conserved non-coding elements (CNEs) docking within GLI3 intronic intervals (intron 3 and 4) to induce reporter gene expression at known sites of endogenous Gli3 transcription in embryonic domains such as the central nervous system (CNS) and limbs. Interestingly, the cell culture based assays reveal harmony with the context dependent dual nature of intra-GLI3 conserved elements. Furthermore, a transgenic zebrafish assay of previously reported limb-specific GLI3 transcriptional enhancers (previously tested in mice and chicken limb buds) induced reporter gene expression in zebrafish blood precursor cells and notochord instead of fin. These results demonstrate that the appendage-specific activity of a subset of GLI3-associated enhancers might be a tetrapod innovation. Taken together with our recent data, these results suggest that during the course of vertebrate evolution Gli3 expression control acquired a complex cis-regulatory landscape for spatiotemporal patterning of CNS and limbs. Comparative data from fish and mice suggest that the functional aspects of a subset of these cis-regulators have diverged significantly between these two lineages.
|
Экспрессия Gli обнаруживается в развивающейся ЦНС. На ст Е8.5 в задней части эмбрионов мышей 3 Gli экспрессируются во всей нейральной пластинке за исключением Gli3, экспрессия которого отсутствует в вентральной средней линии. В более передних и потому более зрелых областях нервной трубки этот паттерн экспрессии сохраняется Транскрипты однако отсутствуют в донной пластинке. В соответствии с Shh экспрессией в донной пластинке экспрессия Gli генов становится в дальнейшем ограниченной. На Е9.5 Gli1 транскрипты обнаруживаются в вентрикулярной зоне нервной трубки рядом с Shh доменом, тогда как Gli2 и Gli3 экспрессируются дорсальной вентрикулярной зоне. Gli2 обнаруживает низкий уровень экспрессии в вентральной вентрикуляной зоне. Этот паттерн экспрессии охраняется в течение всего развития спинного мозга.
Мутация GLI3 в синдромах у человека
Greig cephalopolysyndactyly syndrome (GCPS) редкая аутосомно доминантная аномалия, затрагивающая развитие черепно-лицевое и конечностей.
Цитогенетический анализ выявил, что GCPS связан с 7р13 хромосомой.
Мутации Gli3 выявлены также в 2-х других нарушениях у человека. Pallister-Hall synd. (PHS) редкое аутосомно доминантное нарушение с гипоталамической hamartoma и центральной, иногда постаксиальной, полидактилией. Дисфункция гипофиза, а также черепно-лицевые и висцеральные нарушения также обычны (Biesecker and Graham 1996).
Делеции вызывают сдвиг рамки считывания и преждевременное окончание трансляции Gli3 белка в С-терминальной области цинковых пальчиков после одной и той же аминокислоты (аа691. Эти белки все еще содержат ДНК-связывающий домен.
РАР-А картирован также в Gli3 локусе как делеция одиночной пары (2358delA) в кодирующей области. Укорочение белка с позиции аа777, т.е. сохраняется область цинкового пальчика.
Экспрессия Gli генов во время развития конечностей
Theil et al. 1999
На всех стадиях Gli гены экспрессируются в мезенхиме, хотя транскрипты могут обнаруживаться и в эктодерме. У мышей на 9.5 день эмброгенеза Gli2 и Gli3 экспрессия обнаруживается вдоль всей передне-задней оси вновь сформированной почки конечности, тогда как Gli1 транскрипты обнаруживаются в задней половине зачатка. Этот паттерн коррелирует с расширением и усиленем экспрессии Shh в задней части зачатка конечности. На Е10.5 Gli2 и Gli3 транскрипты остаются связаны с передней часть почки конечности, но из задней части они исчезают. Экспресссия Gli1 также затухает в самом заднем домене. Наконец на Е 11.5 почка конечности подразделяется на 3 домена вдоль передне-задней оси в отношении экспрессии Gli генов. Задняя область, которая соответствует ЗПА и экспрессии Shh лишена каких-либо Gli транскриптов и окружена Gli1-позитивным, но Gli3-негативным доменом. Передняя часть почки экспрессирует Gli2 и Gli3.
На Е12.5 Gli1 транскрипты обнаруживаются в конденсирующейся мезенхиме, тогда как окружающая мезенхима экспрессирует Gli2 и Gli3, последний экспрессируется на более высоком уровне.
Экспрессия Gli генов в других тканях эмбриона следует тому же правилу. Напр., как только возникает источник Shh, Gli гены никогда больше не экспрессируются в этих клетках. Gli транскрипты обычно обнаруживаются по соседству с Shh, что согласуется с ролью транскрипционного медиатора Shh сигнала. Напротив Gli3 экспресссруется в клетках, располагающихся оппозитно сигнальным центрам, указывая тем самым, что его функция м.б. оппозитной этим сигналам и ограничивать их пределы.
Анализ мышей, мутантных по Gli генам
Развитие конечности можно подразделить на 2 фазы: раннее формирование паттерна, сопровождаемое выростом и дифференцировкой конечности. Только ген Gli3 играет существенную роль в раннем развитии конечности. Одна функция Gli3 состоит в репрессии экспрессии Shh в переднем крае почки конечности. Потеря функции Gli3 вызывает эктопическую экспрессию Shh и индукцию Gli1 в соседних клетках. В результате преаксиальная полидактилия.
У extra-toes (Xt) мышей мутация в Gli3 гене. У гомозигот хорошо выраженная полидактилия до 9 пальцев на передних и задних лапах, Дистальные фаланги эктопических пальцевудвоены или отсутствуют. Однако stylo- и zeugopod мешьше затронуты, чем futopod. Редко имеет место потеря длинных костей (тибия и радиус). Помимо высокой частоты дефектов нейрвной трубки наблюдаются тяжелые черепно-лицевые аномалии, часто с гидро- или экзэнцефалией.
Две аллельные мутации, затрагивающие Gli3 локус. Полудоминантная Pdn, которая фенотипически сходна с Xt и обусловлена интеграцией ретротранспозона 5' в область цинкового пальца, что дает разные сплайс варианты дикого и мутантного типа, которые или содержат вставку или укорочены. В обоих случаях белки нефункциональны. Пенетрантность 25%.
Аллель add результат инсерции трансгена в промоторную область Gli3. Фенотип гомозигот add значительно слабее, чем у других 3-х мутантов.
Делеция мотива цинковых пальчиков в гене Gli2 не давала эффекта у гетерозигот, гомозиготные эмбрионы имели тяжелые скелетные аномалии, включая отсутствие тел позвонков и межпозвонковых дисков, укорочение грудины и конечностей. Показана функциональная вырожденность Gli2 и Gli3. Чьи синергичные эффекты выявлены и в других частях скелета, таких как грудина, позвоночный столб и нижняя челюсть (Mo et al. 1997) и развитие зубов (Hardcastle et al., 1998)
Делеции области цинкового пальчика в гене Gli1 не вызывали каких-либо аномалий конечностей и других частей эмбриона.
Мутации с потерей функции Gli1 и Gli2 указывают на то, что оба гена необходимы для формирования паттерна конечости, несмотря на их экспресссию в определенных регионах почки конечности. Это м. объяснить избыточностью функции между двумя генами. Или может существовать Gli1/2-независимый путь в обеспечении Shh сигналов.
Предположение о роли Gli3 в контроле передне-задней асимметрии наталкивается на противоречие при рассмотрении PHS и РАР-А синдромов. Здесь центральная и постаксиальная полидактилия не может быть объяснена репрессией Shh. Их мутантные белки все еще могут связываться с Gli-связывающими сайтами. Репрессия Shh этими мутантными белками в передней части конечности осуществляется нормально, тогда как пальцы-индуцирующая активность Shh в задних частях конечности возрастает, приводя к постаксиальной полидактилии. Можно предположить, что РАР-А или PHS белки обнаруживают некоторую активность в ответ на Shh, причем или функция Gli1 усиливается (медиатор Shh сигналов) или конкуренция менее эффективна за Gli-связывающие сайты в Shh генах мишенях.
|