|
|
---|---|
Granzymes: a family of lymphocyte granule serine proteasesJoseph A Trapani http://genomebiology.com/2001/2/12/reviews/3014 G e n o m e B i o l o g y 2001 2(12): reviews3014.1-3014.7 | |
Granzymes, семейство сериновых протеаз, экспрессирующихся исключительно
в цитотоксических Т лимфоцитах и natural killer (NK)
клетках, компонентах иммунной системы,
которая защищает высшие организмы против
вирусной инфекции и клеточной
трансформации. В результате образования
рецептором-опосредовнного конъюгата
между клетками, содержащими granzyme и
инфицированными или тарнсформированными
клетками-мишенями индуцируется апоптоз.
Granzyme B наибольее мощный про-апоптический
член семейства granzyme. Подобно caspases, cysteine
proteases , которые играют важную роль в
апоптозе, он м. расщеплять белки после
кислых остатков, особенно после aspartic
кислоты. Др. granzymes м. выполнять
дополнительные функции, а некоторые м. и не
индуцировать апоптоз. Granzymes хорошо
охарактеризованы у человека и грызунов и м.б.
сгруппированы в 3 подсемейства в соотв. с
субстратной специфичностью: члены
семейства granzyme, обладающие ферментативной
активностью, сходной с серин протеазой
chymotrypsin, кодируются кластером генов,
названным 'chymase locus'; granzymes с trypsin-подобной
специфичностью, кодируются 'tryptase locus'; а
третье подсемейство расщепляет после
неразветвленных гидрофобных остатков,
особенно после метионина, и подируется 'Met-ase
locus'. Все granzymes синтезируются как zymogens и
после отрезания лидерного пептида
приобретают максимальную ферментативную
аетивность путем удаления N-терминального
дипептида. Они м. блокироваться серин
протеазными ингибиторами и serpins, некоторые
из которыз специфичны для granzymes.
| Gene organization and evolutionary history'Granule enzymes' или 'granzymes' составляют около 90% массы цитолитических гранул, специализированных 'секреторных' лизосом, в cytotoxic T lymphocytes (CTLs) и natural killer (NK) клетках. Гранзимы очень сходны по структуре с chymotrypsin, с триадой ключевых остатков - histidine, aspartic acid и serine - законсервированным каталитическим сайтом, и они генетически связаны с др. лейкоцитарными серин протеазами, особенно с теми, что в mast клетках и моноцитах. Всего 8 granzymes (A-G и M) идентифицировано у мышей и только 5 у человека(A, B, H, M и tryptase-2, известная также как granzyme 3). У человека не обнаружены эквиваленты мышиным granzymes C-G , а granzyme H, по-видимому. специфичен для человекаВсе гены granzyme организованы сходно, их
транскрипты состоят из 5 экзонов,
первый кодирует лидерные
последовательности, тогда как экзоны 2, 3
и 5 кодируют индивидуальные аминокислоты каталитической триады
(Рис.1.) Большинство granzyme генов копируют только один транскрипт, но две мРНК granzyme A возникают в результате альтернативного сплайсинга разных экзонов 1. Подсемейства гранзимов у человека и мыши
картируются в трех соотв. локусах, каждае
имеет одинаковую широкую субстратную
специфичность Гранзимы B человека, крысы и мыши
примерно на 70% идентичны на аминокислотном
уровне, тогда как гранзимы внутри любого
подсемейства (напр., granzymes B и C у мыши)
идентичны на 55-70%. Идентичность
аминокислот гранзимов разных подсемейств
составляет 30-40% , напр., у granzymes A и B 37%) .
Гранзимные последовательности обнаружены только у млекопитающих.
Characteristic structural featuresКаталитическая активность granzymes
зависит от серинового остатка в активном
сайте, одного из триадных остатков His57, Asp102
и Ser195 в chymotrypsin. Др. свойством является oxyanion hole
для стабилизации переходного состояния
энзим-субстратного комплекса, и субстрат-связывающий
карман, форма которого предопределяет
протеазную специфичность. Установлено,
что выемка для субстрата в granzyme B довольно
вместительная и в нее входят 8 остатков
субстрата. Ключевым остатком для
контакта с P1 остатком субстрата (который
является аминокислотой с N-терминальным
cleaved bond, обычно aspartic acid) является Arg226 (Рис.2.) Зимогены гранзимов подвергаются
процессингу во время упаковки в
цитолитические гранулы. Отщепление
лидерного пептида оставляет две
аминокислоты, прикрепленные к зрелому N-концу,
которые затем отрезаются с помощью dipeptidyl peptidase I (DPPI, называемой также cathepsin C), пептидазы
постоянно экспрессируются в лизосомах.
Granzymes становятся ферментативно активными
как только N-терминальный дипептид
отщепляется; оптимум pH granzymes
приблизительно 7.5, так что они максимально
активны после высвобождения в цитоплазму (pH
около 7). DPPI является ключевым регулятором
функции гранзимов, а DPPI-дефицитные мыши
имеют мало или не имеют гранзимной
активности. Экспрессия гранзимов
дикого типа в клетках, лишенных DPPI,
вызывает продукцию неактивного
гранзимнго белка.
Granzymes A и B, украшенные mannose-6-phosphate половинкой для упковки с помощью mannose-6-phosphate рецепторного пути, выявлены и у человека и грызунов. Меньшинство гранзимных белков пакуется с помощью mannose-6-phosphate-независимого процесса. Гранзимы кроме того подвергаются выраженной в разной степени N-сцепленной glycosylation. Гранзим C мыши имеет мало гликозилированных остатков, тогда как др. имеют чрезвычайно много, половина молекулярной массы гранзима D представлена углеводами, добавленными к 5 местам. Granzymes сходны с др. chymotrypsin-подобными энзимами, но имеют также и некоторые отличительные особенности. Остатки в положении 1-4 (обычно Ile-Ile-Gly-Gly) и 9-16 сильно законсервированы во всех гранзимах человека и грузунов. Эти последовательности обычно Gly-Glu или Glu-Glu. Они обычно имеют 3 законсервированных дисульфидных мостика, хотя granzymes A и M и tryptase-2 имеют 4. Granzyme A единственный granzyme, который является димером в результате связывания цепочек дисульфидными мостиками. Localization and functionЭкспрессия granzymes ограничена
активированными T лимфоцитами, незрелыми T
клетками в тимусе (тимоциты), γδ
T клетками (небольшая популяция
специализировнных T клеток, в основном
обнаруживаемых в кишечнике ) и NK клетками.
Из них, NK клетки и γδ
T клетки постоянно экспрессируют и
накапливают гранзимы, тогда как Т
лимфоциты для продукции гранзимных мРНК и
белков д.б. индуцированы воздействием
антигенов или др. типами стимуляции. Granzymes
экспрессируются большинством CD8+ и
небольшой пропорцией CD4+ T клеток,
сенсибилизированных in vitro с помощью
антигенов или лектинов. Ген для granzyme M
экспрессируется только в NK клетках, тогда
как др. члены подсемейства
экспрессируются более широко.
Цитотоксические гранулы имеют две зоны,
различимые на ультраструктурном уровне.Каждая
имеет плотную центральную сердцевину,
которая содержит гранзимы , гранулярный
токсин perforin и кислый протеогликан chondroitin sulphate
(CS). Сеть негативно заряженных CS облегчает
их комплексование с гранзимами, которые
являются щелочными (basic) и позитивно
заряженными в granule pH. Наружная зона каждой
гранулы имеет состав более типичный для
ординарных лизосом. Гранулф, по-видимому,
распределены случайно в цитоплазме, но они
быстро перемещаются в место контакта с
клеткой-мишенью, когда происходит
конъюгация, в результате процесс,
известного как поляризация.
Apoptotic function of granzyme BПринципиальной функцией гранзимов является индукция
гибели клеток, инфицированных вирусом и др.
потенциально вредных клеток. Они
осуществляют это получая доступ к
ключевому субстрату внутри клетки-мишени
perforin-зависимым способом. Perforin-дефицитные
мыши имеют полную нехватку всех путей
клеточной гибели, обеспечиваемых
гранзимами, и оказываются чувствительными
к широкому спектру вирусных патогенов и др.
внутриклеточных патогенов, таких как Listeria monocytogenes. Granzyme B обладает наиболее сильной апоптической
активностью, в результате его каспаза-подобной
способности расщеплять субстрат по
ключевому остатку aspartic кислоты. Но мыши,
дефицитные по granzyme B имеют средней
выраженности иммунный дефицит по
сравнению с perforin-null мышами, указывая на то.
что имеется определенная степень функционального перекрывания
индуцируемого гранзимами апоптоза. In vitro,
CTLs granzyme B-дефицитных мышей вызывают
фрагментацию ДНК в клетках-мишенях более
слабуд, чем CTLs дикого типа . Granzymes др., чем B
обладают более слабой апоптической
активностью. Granzyme A м. индуцировать
каспазную активацию значительно менее
эффективно, чем гранзим В и вызывает др.
про-апоптические эффекты благодаря своей
способности расщеплять нижестоящий
каспазный субстрат.
Granzyme B м. расщеплять, а следовательно,
активировать некоторые прокаспазы
непосредственно и м. также
непосредственно расщеплять нижестоящие
каспазные субстраты, включая ингибитор inhibitor of caspase-activated DNase (ICAD). Он м. также вносить вклад в основной путь
фрагментации ДНК в клетках мишенях.
Избыточная экспрессия анти-апоптического Bcl-2
белка в митохондриях ингибирует гранзим B
полностью, однако, это указывает на то,
что разрушение митохондрий является
обязательным свойством granzyme-обусловленной
гибели клеток. Член Bcl-2-семейства Bid у
мышей и человека расщепляется специфически и быстро гранзимом В,
дистальнее аспаратиковой кислоты в
положении 75, и укороченная молекула Bid
вставляется в митохондриальную мембрану,
чтобы вызывать высвобождение про-апоптических
медиаторов, включая цитохром с и Smac/Diablo.
Помимо каспаза-зависимых механизмов
имеются и каспаза-независимые пути: клетки,
в которых активность каспазы устранена,
убиваются гранзимами Non-apoptotic granzyme functionsТrypsin-like granzyme A, м. участвовать в регуляции пролиферации В-клеток. Он митогенен в В-клетках в отсутствие
антигена и более похож на др. 'tryptases', такие
как thrombin и trypsin. Granzyme A м. расщеплять ряд
белков внеклеточного мотрикса и тем самым
облегыать миграцию T и NK клеток во
внеклеточных тканях. Granzymes м. также
индуцировать секрецию цитокинов и прямо
активировать некоторые цитокины и м.
усиливать некоторые формы воспаления. Granzyme A
м. расщеплять тромбиновые рецепторы после
последовательности Leu-Asp-Pro-Arg , чтобы
индуцировать высвобождение interleukins IL-6 и IL-8
из monocytoid клеток и ретракцию нейритов в
олигодендроцитах. Роль granzymes A и B в прямом
контроле вирусной инфекции выявляется у
мышей с целенаправленным разрушением
генов для granzymes A and B , у которых выявляются
выраженная чувствительность к инфекции к
цитопатическому orthopox вирусу, ectromelia .
Несмотря на это, granzyme A-дейицитные мыши
способны нормально отвечать на
нецитопатический lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) и
внутриклеточный бактериальный патоген Listeria monocytogenes,
и они м. искоренять некоторые сингенные
опухоли с нормальной кинетикой.
Substrate specificity and inhibitors of granzymesGranzymes имеют очень специфические субстратные
предпочтения, согласующиеся с их ролью
скорее как processing, чем дегративные энзимы.
Переваривающие протеазы, такие как trypsin, chymotrypsin
и elastase, имеют очень широкий круг
субстратов и аминокислотный контекст P1
остатка субстрата далек от критического,
по сравнению с гранзимами, у которых
свыше 5 остатков, соседствующих с P1
позицией м. влиять на распознавание и
расщепление. Субстратное предпочтение
выявлено для granzymes A и D и tryptase-2 (все они tryptases;
ои часто определяются по их
способностирасщеплять Na-CBZ-L-lysine thiobenzyl
эфир) и для granzyme B ( 'Asp-ase', расщепляющего поt aspartic
кислоте и возможно по glutamic кислоте), granzyme M ( 'Met-ase'
и расщепляет по methionine) и granzyme H ( chymase). Granzyme B
единственная у млекопитающих серин
протеаза, которая предпочитает кислую
сторону цепи, эта ее роль как про-апоптического
энзима позволяет ей расщеплять Bid и pro-caspases.
Различные синтетические соединения,
включая пептиды thiobenzyl эфира, 7-amino-4-methylcoumarin
и paranitroanilide (pNA) производные, тестированы,
чтобы определить оптимальный субстрат и
условия расщепления с помощью гранзимов.
Оптимальными paranitroanilide субстратами
являются D-Pro-Phe-Arg-pNA для мышиных granzyme A и tosyl-Gly-Pro-Arg-pNA для granzyme A человека. Оба granzymes A
ингибируются ингибиторами сериновых
протеаз, такими как di-isopropylfluorophosphate,
phenylmethylsulfonylfluoride, bezamidine, aprotinin, leupeptin и soybean trypsin ингибитор. Кроме того granzyme A у мыши и
человека м.б. блокированы рядом
физиологических ингибиторов, таких как
α2-macroglobulin, antithrombin III и C1 esterase
ингибитор, которые м защищать окружающие
ткани от побочных повреждений вследствие
degranulation. Многие ингибиторы granzyme A
ингибируют granzyme B только marginally. Лучшим
ингибитором оказался человечьий α1-protease
ингибитор, который вызывает 85% подавление,
если используется 10µg/ml.
Granzyme serpinsЦитотоксические
лимфоциты синтезируют свои собственные
ингибиторы (serpins), которые действуют в
цитозоле, связывая и нейтрализуя
неправильно хранимые или неправильно
сложенные гранзимы. Serpin PI-9,
экспрессируется в CTLs и NK клетках, он имеет
глюмаминовую кислоту в качестве P1 остатка
и этот выбор (преобладающий над aspartic acid)
влияет на его способность ингибировать granzyme B
специфически. Установлено, что мутантный P1
остаток для aspartic acid вызывает ослабление
формирования комплекса с granzyme B и что
мутантная молекуластановится способной
ингибировть каспазы в отличие от дикого
типа PI-9. Показано, что замена aspartic
кислоты на glutamic кислоту обусловливает то,
что мутантная PI-9 молекула становится
намного лучшим субмтратом для granzyme B, со
значительно более высокой скоростью. Т.к.
серпины действуют как псевдосубстраты и
осуществляют свои ингибирующие эффекты
необратимо связываясь с протеазами после
расщепления их ингибиторной петли, то
замена aspartic кислоты на глюаминовую дает
парадоксальный результат слабое
образование комплекса и слабое
игибирование. В клетках, PI-9 отсутствует
в цитотоксических гранулах, но
присутствует в высоких концентрациях в
цитозоле. Он м, следовательно, блокировать
потенциально токсичные молекулы granzyme B,
которые случайно протекли из CTL гранул, не
ингибируя каспаза-зависимую гибель CTL ,
происходящую на Fas пути. Описано много
новых внутриклеточных serpins, возможно, CTLs и NK
клетки защищают сами себя серпинами,
специфическими к каждому гранзиму.
FrontiersОстается неизвестной природа
синергии между perforin и granzyme - механизма,
с помощью которого гранзимы высвобождаются из клеточных эндосом.
Caspase-независимые пути клеточной гибели
очень важны , т.к. они позволяют CTLs убивать
клетки, в которых каспазы блокировны
вирусными ингибиторами, такими как cytokine response modifier A (crmA), экспрессируемый poxviruses. Эти пути изучены
недостаточно. Гранзимы, иные чем A и B
без сомнения имеют больше функций помимо
апоптоза. Недостаточно исследована также
геруляция гранзимов с помощью новых
серпинов. Неизвестно, как регулируется
количество CTL в ответ на инфекцию и каковы
ответы на вирусные заболевания и cancer. |