Granzymes
ГРАНЗИМЫ

Granzymes: a family of lymphocyte granule serine proteases

Joseph A Trapani
G e n o m e B i o l o g y 2001 2(12): reviews3014.1-3014.7
http://genomebiology.com/2001/2/12/reviews/3014

Granzymes, семейство сериновых протеаз, экспрессирующихся исключительно в цитотоксических Т лимфоцитах и natural killer (NK) клетках, компонентах иммунной системы, которая защищает высшие организмы против вирусной инфекции и клеточной трансформации. В результате образования рецептором-опосредовнного конъюгата между клетками, содержащими granzyme и инфицированными или тарнсформированными клетками-мишенями индуцируется апоптоз. Granzyme B наибольее мощный про-апоптический член семейства granzyme. Подобно caspases, cysteine proteases , которые играют важную роль в апоптозе, он м. расщеплять белки после кислых остатков, особенно после aspartic кислоты. Др. granzymes м. выполнять дополнительные функции, а некоторые м. и не индуцировать апоптоз.  Granzymes хорошо охарактеризованы у человека и грызунов и м.б. сгруппированы в 3 подсемейства в соотв. с субстратной специфичностью: члены семейства granzyme, обладающие ферментативной активностью, сходной с серин протеазой chymotrypsin, кодируются кластером генов, названным 'chymase locus'; granzymes с trypsin-подобной специфичностью, кодируются 'tryptase locus'; а третье подсемейство расщепляет после  неразветвленных гидрофобных остатков, особенно после метионина, и подируется 'Met-ase locus'. Все granzymes синтезируются как zymogens и после отрезания лидерного пептида приобретают максимальную ферментативную аетивность путем удаления N-терминального дипептида. Они м. блокироваться серин протеазными ингибиторами и serpins, некоторые из которыз специфичны для granzymes.

Gene organization and evolutionary history

'Granule enzymes' или 'granzymes' составляют около 90% массы цитолитических гранул, специализированных  'секреторных' лизосом, в cytotoxic T lymphocytes (CTLs) и natural killer (NK) клетках. Гранзимы очень сходны по структуре с  chymotrypsin, с триадой ключевых остатков  - histidine, aspartic acid и serine - законсервированным каталитическим сайтом, и они генетически связаны с др. лейкоцитарными серин протеазами, особенно с теми, что в mast клетках и моноцитах.  Всего 8 granzymes (A-G и M) идентифицировано у мышей и только 5 у человека(A, B, H, M и tryptase-2, известная также как granzyme 3). У человека не обнаружены эквиваленты мышиным granzymes C-G , а  granzyme H, по-видимому. специфичен для человека

(Табл.1) Properties of granzymes in humans and rodents

Все гены granzyme организованы сходно, их транскрипты состоят из 5 экзонов,  первый кодирует лидерные последовательности, тогда как экзоны  2, 3 и 5 кодируют индивидуальные аминокислоты каталитической триады


(Рис.1.)
 |  Organization of the human granzyme B gene

Большинство  granzyme генов копируют только один транскрипт, но две мРНК granzyme A возникают в результате альтернативного сплайсинга разных экзонов 1. 

Подсемейства гранзимов у человека и мыши картируются в трех соотв. локусах, каждае имеет одинаковую широкую субстратную специфичность

(Табл.2) Mouse and human granzymes grouped according to their chromosomal localization

Гены, кодирующие granzymes A (HFSP) и tryptase-2 (TRYP2) человека  картируются в 5q11-q12. Granzymes B и H картируются в кластере серин протеазных генов в 14q11, который включает ген для протеазы cathepsin G, который специфичен для миэлоидных клеток. Ген granzyme M локализуется с генами, кодирующими azurocidin (AZU), neutrophil elastase (NE) и proteinase-3 (PR3) на хромосоме 19p13.3. У мышей соотв. локусы находятся на хромосомах 10 для granzyme A и др. tryptases, 14D (для granzymes B-F) и 10C (для granzyme M, AZU и NE) (Табл. 2). У мыши и человека гены  M, AZU и PR3 каждый имеет   интрон 1, расположенный между остатками  -7 и -6 лидерной последовательности, это указывает на  тесное эволюционное родство. У человека гены, кодирующие granzymes B и H и cathepsin G очень тесно сцеплены, картируются внутри 50 kb .Ген granzyme H расположен между двумя остальными и, по-видимому. возник как 'hybrid' состоящий из первых трех экзонов и интронов между ними гена granzyme B и остальная часть из др серин протеазного гена.

Гранзимы B человека, крысы и мыши примерно на 70% идентичны на аминокислотном уровне, тогда как гранзимы внутри любого подсемейства (напр., granzymes B и C у мыши) идентичны на 55-70%. Идентичность аминокислот гранзимов разных подсемейств составляет 30-40% , напр., у granzymes A и B 37%) . Гранзимные последовательности обнаружены только у млекопитающих.

Characteristic structural features

Каталитическая активность granzymes зависит от серинового остатка в активном сайте, одного из триадных остатков  His57, Asp102 и Ser195 в chymotrypsin. Др. свойством является oxyanion hole для стабилизации переходного состояния энзим-субстратного комплекса, и субстрат-связывающий карман, форма которого предопределяет протеазную специфичность.  Установлено, что выемка для субстрата в granzyme B довольно вместительная и в нее входят 8 остатков субстрата. Ключевым остатком для контакта  с P1 остатком субстрата (который является аминокислотой с N-терминальным  cleaved bond, обычно aspartic acid) является Arg226


(Рис.2.)
 |  Molecular determination of substrate specificity in the granzyme B crystal structure

Зимогены гранзимов подвергаются процессингу во время упаковки в цитолитические гранулы. Отщепление лидерного пептида оставляет две аминокислоты, прикрепленные к зрелому N-концу, которые затем  отрезаются с помощью dipeptidyl peptidase I (DPPI, называемой также cathepsin C), пептидазы постоянно экспрессируются в лизосомах.  Granzymes становятся ферментативно активными как только N-терминальный дипептид отщепляется; оптимум pH granzymes приблизительно 7.5, так что они максимально активны после высвобождения в цитоплазму (pH около 7). DPPI является ключевым регулятором функции гранзимов, а DPPI-дефицитные мыши имеют мало или не имеют гранзимной активности.  Экспрессия гранзимов дикого типа в клетках, лишенных DPPI, вызывает продукцию неактивного гранзимнго белка.  

Granzymes A и B, украшенные  mannose-6-phosphate половинкой для упковки с помощью mannose-6-phosphate рецепторного пути, выявлены и у человека и грызунов.  Меньшинство гранзимных белков пакуется с помощью mannose-6-phosphate-независимого процесса. Гранзимы кроме того подвергаются выраженной в разной степени N-сцепленной glycosylation. Гранзим C мыши имеет мало гликозилированных остатков, тогда как др. имеют чрезвычайно много, половина молекулярной массы  гранзима  D представлена углеводами, добавленными к 5 местам.

Granzymes сходны с др. chymotrypsin-подобными энзимами, но имеют также и некоторые отличительные особенности. Остатки в положении 1-4 (обычно Ile-Ile-Gly-Gly) и 9-16 сильно законсервированы во всех гранзимах человека и грузунов. Эти последовательности обычно Gly-Glu или Glu-Glu. Они обычно имеют 3 законсервированных дисульфидных мостика, хотя  granzymes A и M и tryptase-2 имеют 4. Granzyme A единственный granzyme, который является димером в результате связывания цепочек дисульфидными мостиками.

Localization and function

Экспрессия granzymes ограничена активированными T лимфоцитами, незрелыми T клетками в тимусе (тимоциты), γδ T клетками (небольшая популяция специализировнных T клеток, в основном обнаруживаемых в кишечнике ) и NK клетками. Из них, NK клетки и γδ T клетки постоянно экспрессируют и накапливают гранзимы, тогда как Т лимфоциты для продукции гранзимных мРНК и белков д.б. индуцированы воздействием антигенов или др. типами стимуляции. Granzymes экспрессируются большинством CD8+ и небольшой пропорцией  CD4+ T клеток, сенсибилизированных in vitro с помощью антигенов или лектинов. Ген для granzyme M экспрессируется только в NK клетках, тогда как др. члены подсемейства экспрессируются более широко.
Цитотоксические гранулы имеют две зоны, различимые на ультраструктурном уровне.Каждая имеет плотную центральную сердцевину, которая содержит гранзимы , гранулярный токсин perforin и кислый протеогликан chondroitin sulphate (CS). Сеть негативно заряженных CS облегчает их комплексование с гранзимами, которые являются щелочными (basic) и позитивно заряженными в granule pH. Наружная зона каждой гранулы имеет состав более типичный для ординарных лизосом. Гранулф, по-видимому, распределены случайно в цитоплазме, но они быстро перемещаются в место контакта с клеткой-мишенью, когда происходит конъюгация, в результате процесс, известного как поляризация.

Apoptotic function of granzyme B

Принципиальной функцией гранзимов является индукция гибели клеток, инфицированных вирусом и др. потенциально вредных клеток.  Они осуществляют это получая доступ к ключевому субстрату внутри клетки-мишени perforin-зависимым способом. Perforin-дефицитные мыши имеют полную нехватку всех путей клеточной гибели, обеспечиваемых гранзимами, и оказываются чувствительными к широкому спектру вирусных патогенов и др. внутриклеточных патогенов, таких как Listeria monocytogenes. Granzyme B обладает наиболее сильной апоптической активностью, в результате его каспаза-подобной способности расщеплять субстрат по ключевому  остатку aspartic кислоты. Но мыши, дефицитные по granzyme B имеют средней выраженности иммунный дефицит по сравнению с perforin-null мышами, указывая на то. что имеется определенная степень функционального перекрывания индуцируемого гранзимами апоптоза. In vitro,  CTLs  granzyme B-дефицитных мышей вызывают фрагментацию ДНК в клетках-мишенях более слабуд, чем CTLs дикого типа . Granzymes др., чем B обладают более слабой апоптической активностью. Granzyme A м. индуцировать каспазную активацию значительно менее эффективно, чем гранзим В и вызывает др. про-апоптические эффекты благодаря своей способности расщеплять нижестоящий каспазный субстрат. 

Granzyme B м. расщеплять, а следовательно, активировать некоторые прокаспазы непосредственно и м. также непосредственно расщеплять нижестоящие каспазные субстраты, включая ингибитор inhibitor of caspase-activated DNase (ICAD). Он м. также вносить вклад в основной путь фрагментации ДНК в клетках мишенях. Избыточная экспрессия анти-апоптического Bcl-2 белка в митохондриях ингибирует гранзим B полностью, однако,  это указывает на то, что разрушение митохондрий является обязательным свойством granzyme-обусловленной гибели клеток. Член Bcl-2-семейства  Bid у мышей и человека расщепляется специфически и быстро гранзимом В, дистальнее аспаратиковой кислоты в положении 75, и укороченная молекула Bid вставляется в митохондриальную мембрану, чтобы вызывать высвобождение про-апоптических медиаторов, включая цитохром с и Smac/Diablo. Помимо каспаза-зависимых механизмов имеются и каспаза-независимые пути: клетки, в которых активность каспазы устранена, убиваются гранзимами


(Рис.3.)
 |  A schematic model of granzyme-B-mediated apoptosis

Non-apoptotic granzyme functions

Тrypsin-like granzyme A, м. участвовать в регуляции пролиферации В-клеток. Он митогенен в В-клетках в отсутствие антигена и более похож на др. 'tryptases', такие как  thrombin и trypsin. Granzyme A м. расщеплять ряд белков внеклеточного мотрикса и тем самым облегыать миграцию T и NK клеток во внеклеточных тканях.  Granzymes м. также индуцировать секрецию цитокинов и прямо активировать некоторые цитокины  и м. усиливать некоторые формы воспаления. Granzyme A м. расщеплять тромбиновые рецепторы после последовательности Leu-Asp-Pro-Arg , чтобы индуцировать высвобождение interleukins IL-6 и IL-8 из monocytoid клеток и ретракцию нейритов в олигодендроцитах. Роль granzymes A и B в прямом контроле вирусной инфекции выявляется у мышей с целенаправленным разрушением генов для granzymes A and B , у которых выявляются выраженная чувствительность к инфекции к цитопатическому orthopox вирусу, ectromelia . Несмотря на это, granzyme A-дейицитные мыши способны нормально отвечать на  нецитопатический lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) и внутриклеточный бактериальный патоген Listeria monocytogenes, и они м. искоренять некоторые сингенные опухоли с нормальной кинетикой.

Substrate specificity and inhibitors of granzymes

Granzymes имеют очень специфические субстратные предпочтения, согласующиеся с их ролью скорее как processing, чем дегративные энзимы. Переваривающие протеазы, такие как trypsin, chymotrypsin и elastase, имеют очень широкий круг субстратов и аминокислотный контекст P1 остатка субстрата далек от критического, по сравнению с гранзимами, у которых  свыше 5 остатков, соседствующих с  P1 позицией м. влиять на распознавание и расщепление. Субстратное предпочтение выявлено для granzymes A и D и tryptase-2 (все они tryptases; ои часто определяются по их способностирасщеплять  Na-CBZ-L-lysine thiobenzyl эфир) и для granzyme B ( 'Asp-ase', расщепляющего поt aspartic кислоте и возможно по  glutamic кислоте), granzyme M ( 'Met-ase' и расщепляет по methionine) и granzyme H ( chymase). Granzyme B единственная у млекопитающих серин протеаза, которая предпочитает кислую сторону цепи, эта ее роль как про-апоптического энзима позволяет ей расщеплять  Bid и pro-caspases.
Различные синтетические соединения, включая пептиды thiobenzyl эфира, 7-amino-4-methylcoumarin и paranitroanilide (pNA) производные, тестированы, чтобы определить оптимальный субстрат и условия расщепления с помощью гранзимов. Оптимальными paranitroanilide субстратами являются D-Pro-Phe-Arg-pNA для мышиных granzyme A и tosyl-Gly-Pro-Arg-pNA для granzyme A человека. Оба granzymes A ингибируются ингибиторами сериновых протеаз, такими как di-isopropylfluorophosphate, phenylmethylsulfonylfluoride, bezamidine, aprotinin, leupeptin и soybean trypsin ингибитор. Кроме того granzyme A у мыши и человека м.б. блокированы рядом физиологических ингибиторов, таких как  α2-macroglobulin, antithrombin III и C1 esterase ингибитор, которые м защищать окружающие ткани от побочных повреждений вследствие  degranulation. Многие ингибиторы granzyme A ингибируют granzyme B только marginally. Лучшим ингибитором оказался человечьий α1-protease ингибитор, который вызывает 85% подавление, если используется 10µg/ml.

Granzyme serpins

Цитотоксические лимфоциты синтезируют свои собственные ингибиторы (serpins), которые действуют в цитозоле, связывая и нейтрализуя неправильно хранимые или неправильно сложенные гранзимы. Serpin PI-9, экспрессируется в CTLs и NK клетках, он имеет глюмаминовую кислоту в качестве P1 остатка и этот выбор (преобладающий над aspartic acid) влияет на его способность ингибировать granzyme B специфически. Установлено, что мутантный P1 остаток для aspartic acid вызывает ослабление формирования комплекса с granzyme B и что мутантная молекуластановится способной ингибировть каспазы в отличие от дикого типа  PI-9. Показано, что замена  aspartic кислоты на glutamic кислоту обусловливает то, что мутантная PI-9 молекула становится намного лучшим субмтратом для granzyme B, со значительно более высокой скоростью. Т.к. серпины действуют как псевдосубстраты и осуществляют свои ингибирующие эффекты необратимо связываясь с протеазами после расщепления их ингибиторной петли, то замена aspartic кислоты на глюаминовую дает парадоксальный результат слабое образование комплекса и слабое игибирование.  В клетках, PI-9 отсутствует в цитотоксических гранулах, но присутствует в высоких концентрациях в цитозоле. Он м, следовательно, блокировать потенциально токсичные молекулы granzyme B, которые случайно протекли из CTL гранул, не ингибируя каспаза-зависимую гибель CTL , происходящую на Fas пути. Описано много новых внутриклеточных serpins, возможно, CTLs и NK клетки защищают сами себя серпинами, специфическими к каждому гранзиму.

Frontiers

Остается неизвестной природа синергии между  perforin и granzyme - механизма, с помощью которого гранзимы высвобождаются из клеточных эндосом. Caspase-независимые пути клеточной гибели очень важны , т.к. они позволяют CTLs убивать клетки, в которых каспазы блокировны вирусными ингибиторами, такими как cytokine response modifier A (crmA), экспрессируемый poxviruses. Эти пути изучены недостаточно. Гранзимы, иные чем  A и B без сомнения имеют больше функций помимо апоптоза. Недостаточно исследована также геруляция гранзимов с помощью новых серпинов.  Неизвестно, как регулируется количество CTL в ответ на инфекцию и каковы ответы на вирусные заболевания и cancer.


Сайт создан в системе uCoz