HOX
HOX гены

У мышей и человека Antp класс Нох генов имеет значительное сходство в их организации и экспрессии с комплексом генов НОМ-С дрозофилы. 38 человеческих НОХ генов кластированы в 4-х хромосомных областях НОХ1-НОХ4, локализованных соответственно в хромосомах 7, 17,12 и 2. 38 Нох генов мыши также кластированы в 4-х хромосомных областях Нох1-Нох4, локализованных в хромосомах 6, 11, 15 и 2. Известно, что максимальное число гомеогенов в хромосомном локусе или кластере равно 13, пока в каждом кластере выявлено по крайней мере 9 гомеогенов, при этом сходные по своим нуклеотидным последовательностям гомеогены расположенны в одном и том же порядке в разных хромосомах и образуют так называемые кластеры гомеогенов. Гены разных кластеров, занимающие одинаковое положение в этих 4-х кластерах, образуют субсемейство или группу максимум из 4-х гомологичных генов, названных генами-паралогами. В настоящее время предложена новая унифицированная номенклатура Нох генов у позвоночных [25], которой уже начинают пользоваться авторы последних публикаций. Согласно ей кластеры получают буквенное обозначение (A-D), а гены в них порядковые номера от 1 до 13. В этом случае все гены-паралоги будут иметь одинаковые по- рядковые номера.	Тот факт,что сходство обнаруживается не только между генами паралогами, но и между генами НОМ-С комплекса дрозофилы и класте- рами Нох генов позвоночных [26] позволяет предположить, что ис- ходный кластер НОМ-С генов насекомых и позвоночных подвергся ряду удвоений в ходе эволюции у позвоночных [27,28]. Установлено, что гомеобоксные гены в кластерах транскрибируются в одном и том же направлении, причем передние границы экспрессии Нох генов в сегментах у эмбрионов позвоночных вдоль передне-задней оси находятся в том же порядке, что и порядок расположения этих генов вдоль соответствующих хромосом, причем 3' гены имеют более ростральные передние границы экспрессии [24,28,29]. На рисунке схематически представлена пространственная экспрессия изученных гомеобоксных генов в нейромерах, сомитомерах и производных клеток нервного гребня, видно что 3' Нох гомеогены действительно имеют более ростральные передние границы экспрессии в ЦНС и сомитах, причем в последних начало экспрессии, по-видимому, несколько сдвинуто кзади. Специфичность связывания гомеодоменов с ДНК регулируемых генов предопределяется различиями в аминокислотных остатках в определен ных частях гомеодоменов (Isaac et al., 1995) нейроэктодерме заднего мозга наблюдается следующая картина. Все гены-паралоги, составляющие группу 4 (Deformed), начинают экспрессироваться в одном и том же ромбомере (r7), паралоги группы 3 (zerknult) начинают экспрессироваться в r5, а паралоги груп- пы 2 (proboscipedia) - в r3. Но гены паралоги группы 1 (labial) экспрессируются неодинаково (Hunt et al., 1991a). Вернее они име- ют одинаковый временной и пространственный патерн экспрессии на ранних этапах эмбриогенеза мыши (7,5-8 день), когда домены экс- прессии этих генов идентичны как в нейроэктодерме,так и мезодерме и имеют одну и ту же четкую переднюю границу экспрессии в заднем мозге [30]. Однако позднее область экспрессии этих генов начинает уменьшаться в заднем мозге, но активность гена Нох-2.9 сохраняет- ся в специфическом регионе заднего мозга (r4), иллюстрируя спо- собность этого гена отвечать на дополнительный регуляторный сиг- нал. По-видимому, сходная ситуация имеет место и в случае гомео- генов Нох-3.3 и некоторых других. Экспрессия этих групп Нох генов в заднем мозге совпадает с их экспрессией в мигрирующих клетках нервного гребня, демонстрируя их ромбомерную сегментацию [30,31]. С окончанием формирования Нох метка на уровнях, соответствующих происхождению клеток нервного гребня (уровень заднего мозга), и начинается экс- прессия этих генов в поверхностной эктодерме бранхиальных дуг, причем в последней наблюдается сдвиг передней границы экспрессии на один ромбомер в каудальном направлении, как предполагается, из-за отсутствия вклада в формирование бранхиальных дуг клеток нервного гребня из района ромбомеров r3 и r5 [31]. Итак, гены-паралоги групп 1-4 экспрессируются в заднем мозге в идентичных ромбомерах, краниальных ганглиях и бранхиальных дугах, т.е. имеют,по-видимому, не только структурное, но и функцио- нальное сходство и регулируются очевидно одними и теми же или сходными сигналами. Различия между членами групп генов-паралогов имеются, по-видимому, лишь в уровнях экспрессии генов. Следует отметить, что на поздних стадиях развития мыши Нох гены, которые экспрессировались в идентичных ромбомерах и бранхиальных дугах, теперь начинают обнаруживать четкие различия в доменах экспрессии. Однако гены-паралоги все еще сохраняют сходство общих границ экспрессии вдоль передне-задней оси,т.е. различающиеся теперь домены экспрессии разных уровней, тканей и клеточных типов в конечном итоге накладываются на ранний домен экспрессии Очевидно, что детерминация сегментов нейроэктодермы заднего мозга осуществляется за счет совместной активности Нох генов-паралогов групп 1-4 [24,29]. Причем в создании Нох кода для каждого сегмента участвуют гены-паралоги разных групп, так как экспрессия Нох генов, начавшись в одном ромбомере, обнаруживается и во всех более каудальных ромбомерах и нейромерах спинного мозга, хотя и на более низких уровнях. Реципрокные трансплантации ромбомеров r2 и r4 у эмбрионов кур на стадиях 6-11 сомитов, т.е. перед или во время определения границ ромбомеров, показали, что r4 на месте r2 дает дополнительную полосу экспрессии Нох-2.9 гена, а r2 на месте r4 не обнаруживает обычной для этого сайта экспрессии гена Нох-2.9 [20]. Эктопический r4 формирует ядро лицевого (VII) нерва, а эктопический r4 - ядро тройничного (V) нерва. Следовательно, детерминация сегментов заднего мозга имеет стабильный характер во время формирования границ ромбомеров и это состояние детерминации поддерживается ав- тономно. Так, активность гена Нох-2.9 уже независит от его поло- жения в нейроэктодерме и от влияния окружающей мезодермы.Поддер- жание состояния детерминации, по-видимому, связано с наличием в гомеогенах ауторегуляторных нуклеотидных последовательностей Имеется обширная литература по определению доменов экспрессии Нох генов по отношению к границам сомитов или их производных в туловище позвоночных [34]. Самым интересным,пожалуй, оказалось то, что в отличие от их поведения в головных структурах гены-паралоги в туловище обнаруживают различия границ своей экспрессии в сомитах (см.рис.). Это особенно заметно для генов-паралогов 5-11 групп, причем сходные различия, по-видимому, имеют место и в спинном мозге [35]. Очевидно в туловище детерминация сомитов специфицируется также Нох кодом, но в отличие от ситуации в бранхиальной области головы паралоги могут играть независимую роль в спецификации сомитов.Правда не каждый сомит имеет уникальный Нох код,т.к. некоторые члены группы паралогов экспрессируются в идентичных сомитах. Избыточность Нох кода при кодировании головных сегментов Нох генами-паралогами в случае их функционального сходства позволяет предположить, что функция мутантного Нох гена может целиком или частично выполняться другими генами-паралогами и мутантный фенотип или не проявится или не будет давать гомеозисных трансформаций подобно гомеозисным мутациям у дрозофилы. Причем в этом плане можно ожидать различных эффектов от нарушений экспрессии Нох генов в голове и туловище. Кооперативное действие гомеодоменовых белков Продукты гена млекопитающих Pbx и дрозофилы exd способны взаимодействовать специфически с Hox белками и увеличивать тем самым их сродство и селективность связывания с ДНК . Показано, что Pbx белки существуют в виде стабильных гетеродимеров с новым гомеодоменовым белком, Prep1. Взаимодействие Prep1-Pbx белок-белок существенно для связывающей активности ДНК . Prep1-Pbx компелексы обнаруживаются у ранних эмбрионов мыши, когда Pbx взаимодействует с Hox белками. Использование разных поверхностей для взаимодействия позволяет Pbx взаимодействовать с Prep1 и Hox белками одновременно . Обнаружено образование комплекса Prep1-Pbx1-HOXB1 на HOXB1-отвечающей мишени in vitro. Взаимодействие Prep1 усиливает способность HOXB1-Pbx1 комплекса активировать транскрипцию кооперативным способом с одной и той же мишени (Berthelsen et al., 1998) . HOXА-1 ген Было установлено, что cadherin-6 (K-cadherin, cad6) временно экспрессируется в ограниченном числе ромбомеров и других подразделениях нервной пластинки и трубки. В среднем мозге и передней2 части заднего мозга у эмбрионов E8.0-8.5 , cad6 экспрессируется толькло в областях, дающиех Клетки НГ. В каудальных частях заднего мозга и спинном мозге этих эмбрионов cad6 обнаруживается во всей нервной пластинке, образуя четкую переднюю границу на месте границы между будущими ромбомерами 4 и 5 . Постепенно эта экспрессия в нервной пластинке распростраянется на 6 ромбомер , однако большинстиво из областей, генерирюущих НГ, остается позитивным во всем теле. Клетки НГ, мигрирующие из нервной трубки постепенно накапливаются преимущественно вдоль периферических нервов. У мутантов ( E8.0-8.5) Hoxa-1 , cad6 экспрессия подавлена в областях ромбомеров 4-6, однако остальные области нарушены несущественно. Позднее однако cad6-позитивные клетки НГ появляются и мигрируют из ромбомеров 4 - 6,указывая тем самым, что супрессия cad6 временная и ограничена ранними стадиями (Inoue et al.,1997). Воздействие на стадии средней гаструлы на эмбрионы мыши ретиноевой кислотой индуцирует сдвиг вперед экспрессии Hoxa-1 (Hox-1.6) и Hoxb-1 (Hox-2.9) генов. HOXB-1 ген Hoxb-1 гены наиболее эффективно активировались комбинацией лигандов TTNPB и LG69, указывая на то, что активация этих генов усиливается в присутствии связанных лигандами RAR и RXR рецепторов, соответственно. (Lu et al.,1997).Hoxa-1 и Hoxb-1 гены мыши имеют 3' энхансеры (RAIDR5 enhancer, включающий DR5 RARE, conserved element (CE) 1, и CE2, ) со сходными последовательностями, экспрессия и реактивность (responsiveness) которых контролируется эндогенными ретиноидами. Так, CE2 последовательности TATTTACTCA связывают RA-индуцируемый фактор, который является белком в 170-kDa. Сходные последовательности в гомологе Ноха-1 человека. Retinoic acid response elements (RAREs), расположенные в 3' энхансере и 5' промотор гена Hoxb-1 ,могут функционировать соответственно как позитивный и негативный регуляторы,которые обеспечивают как диффузную (early positive)так и сегментно специфицированную и ограниченную (late negative) эксперссию гена . Такое действие ретиноевой кислоты позволяет понять нормальный эмбриогенез и влияние на этот процесс эктопической ретиноевой кислоты, ведущее к тератогенезу. При целенаправленном разрушение гена Hoxb-1 мутантные мыши характеризовались неспособностью формировать соматический двигательный компонент VII (facial) нерва,возможно из-за неспособности специфицировать эти нейроны . Фенотип hoxb-1 мутантных гомозигот сильно напоминает клинические проявления у людей с Bell's Palsy или Moebius Syndrome(Goddard et al., 1998) Воздействие на стадии средней гаструлы на эмбрионы мыши ретиноевой кислотой индуцирует сдвиг вперед экспрессии Hoxa-1 (Hox-1.6) и Hoxb-1 (Hox-2.9) генов. HOXA-2 ген Hoxa-2 имеет ростральную границу экспрессии в нервной трубке в точности между ромбомерами (r)1 и 2; это наиболее ростральная граница из всех нох генов. Клетки НГ,мигрируют из r2 в первую бранхиальную дугу, однако ни в появляющихся клетках НГ, ни в первой бранхиалной дуге не обнаруживается экспрессия Hoxa-2. На уровне же r4, и нервная трубка и клетки НГ , мигрирующие во вторую бранхиальную дугу, экспрессируют Hoxa-2. Hoxa-2 , следовательно, имеет разные передние границы экспрессии в нервной трубке и клетках НГ. Трансплантации ромбомеров до образования границ показали, что в клетках НГ сформирован препаттерн в отношении экспрессии Hoxa-2. Решение о подавлении экспрессии Hoxa-2 в НГ, происходящем из r2, и в поддержании экспрессии Hoxa-2 в НГ r4-производном является внкутренне присущим свойством популяции премиграторных клеток НГ. При взаимных трансплантациях r4 и r2 , экспрессия Hoxa-2 поддерживается в клетках НГ, происходящего из r4, но теряется в НГ, происходящем из r2. The Hoxa-2 ген разрушали с помощью гомологичной рекомбинации. Гомозиготные мутанты погибали при рождении. Дефект обнаруживался в бранхиальной области головы, которая соответствовала ростальному домену экспрессии Hoxa-2. Так как сегментация на заднего мозга на ромбомеры и клеток НГ не нарушена, однако мезенхимные производные клеток НГ во второй дуге отсутствовали и состояние детерминации мезенхимных клеток НГ было изменено в состояние, характерное для первой дуги(Gendron-Maguire., 1993). Имела место гомеозисная трансформация скелетных элементов второй дуги в элементы первой дуги. Появление атавистического птеригоквадратного ( pterygoquadrate) элемента рептилий у мутантов Hoxa-2 указывает на то, что это основополагющий паттерн является промежуточным у рептилий и млекопитающих. The ground pattern program appears to be modified in the mouse first arch by a Hox-independent process, whereas Hoxa-2 acts as a selector gene in the second arch (Rijliet al., 1993).Ген Ноха-2 контролирует направление пути миграции двигательных аксонов от ромбомеров r2-r3 )(Gavalas al., 1997). Показано, что ген Ноха-2 находится под контролем вышестоящего гена Krox-20 и обеспечивает ромобер-специфическую экспресиию подчиненного гена тирозинкиназного рецептора мыши (MDK1)(Taneja al., 1996). HOXA-3 ген Изучали паттерн и регуляцию экспрессии Hoxa-3 в заднем мозге и ассоциированных клетках НГ у эмбрионов кур. Hoxa3 экспрессируется в нервной пластинке, позднее в нервной трубке с ростральной границей экспрессии, соответствующей границе между ромбомерами (r) 4 и 5. Первоначально экспрессия диффузна и становится четкой после образования границ. Hoxa3 обнаруживает униформную экспрессию в r5 после образования границ между ромбомерами. Установлено, что клетки НГ, мигрирующие каудально, но не рострально, от r5 и каудально от r6 экспрессируют Hoxa3 у нормальных эмбрионов. Результаты экспериментов по переносу показали, что экспрессия Hoxa3 в r5 клетках НГ не является строго клеточно-автономной. Когда r5 перемещается вместе с r4 с помощью ростро-каудальной ротации ромбомеров, то Hoxa3 экспрессируется в клетках, мигрирующих латерально по отношению к транспозированному r5 и в течение короткого времени,в конденсирующиеся ганглии, но не с помощью НГ во вторую бранхиальную дугу. Так как меченные клетки от транспозированного r5 присутствуют во второй дуге, Hoxa3-экспрессирующие клетки НГ от r5, по-видимому, подавляют свою Hoxa3 экспрессию в новом окружении (среде). Напротив, когда r6 перемещается в положение r4 после образования границ, то Hoxa3 экспрессия сохраняется как в мигрирующих клетках нервного гребня , так и в тех, что расположены внутри второй бранхиальной дуги и ассоцированных ганглиях. Эти результаты указывают на то, что Hoxa3 экспрессия явлется клеточно-автономной в r6 и в ассоциированном с ним НГ . Следовательно, клетки НГ, экспрессирующие один и тот же ген Hox не эквивалентны ; они отвечают по разному на средовые сигналы и обладают разной степенью клеточной автономии в зависимости от происхождения их ромбомеров (Saldivar et al., 1996). Тимус, щитовидная и паращитовидные железы у позвоночных развиваются из глоточной области, со вкладом в бранхиальные дуги как глоточной энтодермы, так и клеток НГ. Мутантные гомозиготы мыши по гену Hoxa3 имеют нарушения в развитии всех трех органов. Изучали роль паралогов Hoxa3 , Hoxb3 и Hoxd3, путем исследования различных комбинаций мутаций. Дефекты щитовидной железы, обнаруживаемые у одиночных Hoxa3 мутантов, усиливаются у двойных мутантов с любым из паралогов, однако ни одна комбинация мутантов не приводила к агенезу щитовидной железы . Результаты указывают на то, что первичная роль этих генов в развитии щитовидной железы заключается в их эффекте на развитие и миграцию ultimobranchial телец,которые вносят свой вклад в парафолликулярные или С-клетки щитовидной железы. Hoxb3, Hoxd3 двойные мутанты не обнаруживали явных дефектов в тимусе и паращитовидных железах. Однако удаление одной из функциональных копий Hoxa3 из Hoxb3, Hoxd3 двойных мутантов (Hoxa3 +/-, Hoxb3-/-, Hoxd3-/-) обусловливает неспособность тимуса и паращитовидных желез мигрировать в их обычное положение в in the throat. Полученные результаты указывают на то, что Hoxa3, Hoxb3 и Hoxd3 имеют высоко перекрывающиеся функции в обеспечении миграции зачатков фарингеальных органов. Кроме того Hoxa3 обладает уникальной функцией по отношению к свои паралогам в развитии тимуса, паращитовидных и щитовидной желез . Эта уникальная функция м.б. скорректирована экспрессией Hoxa3, но не Hoxb3 или Hoxd3, в энтодерме фарингеальных карманов (Manley , Capecchi,1998). HOXD-3 ген Получены мыши с разрушенным homeobox-containing gene Hoxd-3 (Hox-4.1). У мышей, гомозиготных по данной мутации существенно модифицировано craniocervical соединение. Пердняя дуга атланта трансформирована в расширение базиокципитальной кости черепа. Латеральные массы атланта также морфологически больше напоминают exoccipitals и в разной степени слиты с exoccipitals. Образование второго шейного позвонка , the axis, также нарушено. The dens and the superior facets делетированы,а axis обнаруживает 'atlas-like' характеристики. Разные части одного и того же позвонка по разному затрагиваются потерей функции гена Hoxd-3 . Некоторые части делетируются другие гомеотически трансформируются в более передние структуры. Следовательно, ген Hox может по-разному контролировать скорость пролиферации мезенхимных конденсатов , которые дают позвонковые хрящи. У мышей в Hox комплексе, паралогичные гены не только кодируют очень сходные белки , но также часто обладают очень сходными паттернами экспрессии. Следовательно,можно постулировать, что паралоги выполняют сходные роли. Однако не обнаружено нарушений в исследованных тканях или структурах у мутантов по паралогичным генам Hoxa-3 и Hoxd-3 (Condie , Capecchi , 1993). HOXB-4 ген Установлено, что временная передача сигналов от параксиальной мезодермы индуцирует экспрессию Hoxb4 в заднем мозге. Индукция происходит при участии ретиноидного пути, нуждающегося в рецепторах ретиноевой кислоты RAR, функционирующих в нейральной пластинке. Анализ преромбомерного энхансера из Hoxb4 показал, что элемент, реагирующий на ретиноевую кислоту, является обязательным компонентом ранней нейральной реакции на сигналы от сомитов и может интепретировать позиционную информацию для закладки передней границы экспресси. Предполагается, что экспрессия Hoxb4 инициируется внешними сигналами и поддерживается петлей обратной связи Нох. Анализ временной и пространственной регуляции Hoxb4 в ЦНС эмбрионов кур выявил два различных механизма функционирования во время преромбомерной и сегментной стадии и что каждый из них связан с отдельным энхансером. Преромбомерный энхансер (Early NE) обеспечивает ЦНС-ограниченную экспрессию, которая распространяется над будущей границей r6/7. В течение слудующих 48 ч передняя часть экспрессии Hoxb4 регрессирует и устанавливается передняя граница его экспрессии r6/7. Активность раннего NE индуцируется сигналами de novo от параксиальной мезодермы. Поздний NE в точности маркирует границу r6/7 окончательно, но после того как формирование ромбомеров становится видимым. Этот ромбомерный энхансер содержит Нох-отвечающий элемент. Сомитами-индуцируемая продукция HOXB4 с помощью раннего NE запускает актиность подзднего NE и стабильно поддерживает экспрессию вплоть до r6/7 границы с помощью Нох петли обратной связи. Эта петля нуждается также в подпитке сигналами от параксиальной мезодермы для поддержания экспресси Hoxb4. Природа мезодермального сигнала пока неясна. Активация раннего NE может осуществляться как непосредственно ретиневой кислотой, так и хаперонами для ретиноевой кислоты, так и отдельными сигналами. HOXD-4 ген Показано, как экспрессия куриного гомеобоксного гена Hoxd-4 начинается в задней части примитивной полоски и затем распространяется вперед , покрывая большую часть примитивной полоски на стадии 2-х сомитов, покрывая всю примитивную полоску на стадии 5 сомитов и достигая уровня somite 1/somite 2 в нервной трубке на стадии 9 сомитов и достигая границы rhombomere 6/rhombomere 7 в заднем мозге на стадии 15 сомитов. Это распространение не зависит от миграции клеток. Более того это распространение , по-видимому,не нуждается в непрерывности ткани, так как оно не блокируется непроницаемым стекляным барьером , имплантированным в эмбриональную ткань. По мере увеличения домена экспрессии Hoxd-4 он подразделяется на стадии поздней примитивной полоски на "anterior" и "posterior zones," с "intermediate zone" слабой экспрессии или отсуствием экспрессии. Четкие передняя и задняя зоны обнаружены также для экспрессии генов Hoxa-3 и a-4 у эмбрионов мыши на стадии поздней примитивной полоски. Получены доказательства, что передняя зона соответствует "дефинитивному" домену экспрессии Hox генов, ранее охарактеризованных для midgestation эмбрионов. Задняя зона является преходящей , очевидно существует только в течение существования примитивной полоски и является областью интенсивной экспрессии Нох в ткани примитивной полоски , Hensen's node, и соседних областях нейроэктодермы и мезодермы. Предполагается, что задняя зона маркирует источник морфогена , который является первичным активатором экспрессии Hox генов (Gaunt , Strachan, 1994). HOXC-8 ген Ген Нохс-8 экспрессируется в гематопоэтических органах мыши, в печни плодов и взрослом костном мозге. HOXB13 ген Охарактеризован гомеобелок, регулятор экспрессии гена инсулина, НОХВ13. Он содержит элемент для связи с промотором гена инсулина, он модулируется Са++-зависмой СаМ киназой IV, и меет гомологию с нуклеотидными последовательностями, кодирующими Нох генный комплекс. Он связывается с FLAT элементом промотора гена инсулина; он действует синергично с другими регуляторми экспрессии гена инсулина, а именно, с Pan-1; его активная область в или вблизи N-конца белка; он картирован в длинном плече хромосомы 17 человека, 17q21. Изучали экспрессию НохВ13 на стадии Е13-17 эмбриогенеза мыши. Его экспрессия обнаруживалась в эпидермисе плодов, но не в волосяных фолликулах или дерме. Его экспрессия обнаруживалась в слизистой рта, но не в эпителии языка. НохВ13 экспрессируется во всей поперечно-полосатой мускулатуре, но не в гладких мышцах. В легких его экспрессия ограничена воздушными путями и отсутствует в респираторном эпителии. Слабая экспрессия обнаруживается в собирающих канальцах почек. Интенсивное НохВ13 окрашивание обнаруживается в хороидном сплетении, но не ЦНС. Т.обр., НохВ13 экспрессируется в основном в органах эктодермального и мезодермального происхождения ( эпидермис, поперечно-полосатые мышцы) и отсутствует в органах, происходящих из энтодермы ( ЖКТ, пищеварительные железы).

Тот факт,что сходство обнаруживается не только между генами паралогами, но и между генами НОМ-С комплекса дрозофилы и класте- рами Нох генов позвоночных [26] позволяет предположить, что ис- ходный кластер НОМ-С генов насекомых и позвоночных подвергся ряду удвоений в ходе эволюции у позвоночных [27,28].

Установлено, что гомеобоксные гены в кластерах транскрибируются в одном и том же направлении, причем передние границы экспрессии Нох генов в сегментах у эмбрионов позвоночных вдоль передне-задней оси находятся в том же порядке, что и порядок расположения этих генов вдоль соответствующих хромосом, причем 3' гены имеют более ростральные передние границы экспрессии [24,28,29].

На рисунке схематически представлена пространственная экспрессия изученных гомеобоксных генов в нейромерах, сомитомерах и производных клеток нервного гребня, видно что 3' Нох гомеогены действительно имеют более ростральные передние границы экспрессии в ЦНС и сомитах, причем в последних начало экспрессии, по-видимому, несколько сдвинуто кзади.

Специфичность связывания гомеодоменов с ДНК регулируемых генов предопределяется различиями в аминокислотных остатках в определен ных частях гомеодоменов (Isaac et al., 1995)

нейроэктодерме заднего мозга наблюдается следующая картина. Все гены-паралоги, составляющие группу 4 (Deformed), начинают экспрессироваться в одном и том же ромбомере (r7), паралоги группы 3 (zerknult) начинают экспрессироваться в r5, а паралоги груп- пы 2 (proboscipedia) - в r3. Но гены паралоги группы 1 (labial) экспрессируются неодинаково (Hunt et al., 1991a). Вернее они име- ют одинаковый временной и пространственный патерн экспрессии на ранних этапах эмбриогенеза мыши (7,5-8 день), когда домены экс- прессии этих генов идентичны как в нейроэктодерме,так и мезодерме и имеют одну и ту же четкую переднюю границу экспрессии в заднем мозге [30]. Однако позднее область экспрессии этих генов начинает уменьшаться в заднем мозге, но активность гена Нох-2.9 сохраняет- ся в специфическом регионе заднего мозга (r4), иллюстрируя спо- собность этого гена отвечать на дополнительный регуляторный сиг- нал. По-видимому, сходная ситуация имеет место и в случае гомео- генов Нох-3.3 и некоторых других.

Экспрессия этих групп Нох генов в заднем мозге совпадает с их экспрессией в мигрирующих клетках нервного гребня, демонстрируя их ромбомерную сегментацию [30,31]. С окончанием формирования Нох метка на уровнях, соответствующих происхождению клеток нервного гребня (уровень заднего мозга), и начинается экс- прессия этих генов в поверхностной эктодерме бранхиальных дуг, причем в последней наблюдается сдвиг передней границы экспрессии на один ромбомер в каудальном направлении, как предполагается, из-за отсутствия вклада в формирование бранхиальных дуг клеток нервного гребня из района ромбомеров r3 и r5 [31].

Итак, гены-паралоги групп 1-4 экспрессируются в заднем мозге в идентичных ромбомерах, краниальных ганглиях и бранхиальных дугах, т.е. имеют,по-видимому, не только структурное, но и функцио- нальное сходство и регулируются очевидно одними и теми же или сходными сигналами. Различия между членами групп генов-паралогов имеются, по-видимому, лишь в уровнях экспрессии генов.

Следует отметить, что на поздних стадиях развития мыши Нох гены, которые экспрессировались в идентичных ромбомерах и бранхиальных дугах, теперь начинают обнаруживать четкие различия в доменах экспрессии. Однако гены-паралоги все еще сохраняют сходство общих границ экспрессии вдоль передне-задней оси,т.е. различающиеся теперь домены экспрессии разных уровней, тканей и клеточных типов в конечном итоге накладываются на ранний домен экспрессии

Очевидно, что детерминация сегментов нейроэктодермы заднего мозга осуществляется за счет совместной активности Нох генов-паралогов групп 1-4 [24,29]. Причем в создании Нох кода для каждого сегмента участвуют гены-паралоги разных групп, так как экспрессия Нох генов, начавшись в одном ромбомере, обнаруживается и во всех более каудальных ромбомерах и нейромерах спинного мозга, хотя и на более низких уровнях.

Реципрокные трансплантации ромбомеров r2 и r4 у эмбрионов кур на стадиях 6-11 сомитов, т.е. перед или во время определения границ ромбомеров, показали, что r4 на месте r2 дает дополнительную полосу экспрессии Нох-2.9 гена, а r2 на месте r4 не обнаруживает обычной для этого сайта экспрессии гена Нох-2.9 [20]. Эктопический r4 формирует ядро лицевого (VII) нерва, а эктопический r4 - ядро тройничного (V) нерва. Следовательно, детерминация сегментов заднего мозга имеет стабильный характер во время формирования границ ромбомеров и это состояние детерминации поддерживается ав- тономно. Так, активность гена Нох-2.9 уже независит от его поло- жения в нейроэктодерме и от влияния окружающей мезодермы.Поддер- жание состояния детерминации, по-видимому, связано с наличием в гомеогенах ауторегуляторных нуклеотидных последовательностей

Имеется обширная литература по определению доменов экспрессии Нох генов по отношению к границам сомитов или их производных в туловище позвоночных [34]. Самым интересным,пожалуй, оказалось то, что в отличие от их поведения в головных структурах гены-паралоги в туловище обнаруживают различия границ своей экспрессии в сомитах (см.рис.). Это особенно заметно для генов-паралогов 5-11 групп, причем сходные различия, по-видимому, имеют место и в спинном мозге [35]. Очевидно в туловище детерминация сомитов специфицируется также Нох кодом, но в отличие от ситуации в бранхиальной области головы паралоги могут играть независимую роль в спецификации сомитов.Правда не каждый сомит имеет уникальный Нох код,т.к. некоторые члены группы паралогов экспрессируются в идентичных сомитах.

Избыточность Нох кода при кодировании головных сегментов Нох генами-паралогами в случае их функционального сходства позволяет предположить, что функция мутантного Нох гена может целиком или частично выполняться другими генами-паралогами и мутантный фенотип или не проявится или не будет давать гомеозисных трансформаций подобно гомеозисным мутациям у дрозофилы. Причем в этом плане можно ожидать различных эффектов от нарушений экспрессии Нох генов в голове и туловище.

Кооперативное действие гомеодоменовых белков

Продукты гена млекопитающих Pbx и дрозофилы exd способны взаимодействовать специфически с Hox белками и увеличивать тем самым их сродство и селективность связывания с ДНК . Показано, что Pbx белки существуют в виде стабильных гетеродимеров с новым гомеодоменовым белком, Prep1. Взаимодействие Prep1-Pbx белок-белок существенно для связывающей активности ДНК . Prep1-Pbx компелексы обнаруживаются у ранних эмбрионов мыши, когда Pbx взаимодействует с Hox белками. Использование разных поверхностей для взаимодействия позволяет Pbx взаимодействовать с Prep1 и Hox белками одновременно . Обнаружено образование комплекса Prep1-Pbx1-HOXB1 на HOXB1-отвечающей мишени in vitro. Взаимодействие Prep1 усиливает способность HOXB1-Pbx1 комплекса активировать транскрипцию кооперативным способом с одной и той же мишени (Berthelsen et al., 1998) .

HOXА-1 ген

Было установлено, что cadherin-6 (K-cadherin, cad6) временно экспрессируется в ограниченном числе ромбомеров и других подразделениях нервной пластинки и трубки. В среднем мозге и передней2 части заднего мозга у эмбрионов E8.0-8.5 , cad6 экспрессируется толькло в областях, дающиех Клетки НГ. В каудальных частях заднего мозга и спинном мозге этих эмбрионов cad6 обнаруживается во всей нервной пластинке, образуя четкую переднюю границу на месте границы между будущими ромбомерами 4 и 5 . Постепенно эта экспрессия в нервной пластинке распростраянется на 6 ромбомер , однако большинстиво из областей, генерирюущих НГ, остается позитивным во всем теле. Клетки НГ, мигрирующие из нервной трубки постепенно накапливаются преимущественно вдоль периферических нервов. У мутантов ( E8.0-8.5) Hoxa-1 , cad6 экспрессия подавлена в областях ромбомеров 4-6, однако остальные области нарушены несущественно. Позднее однако cad6-позитивные клетки НГ появляются и мигрируют из ромбомеров 4 - 6,указывая тем самым, что супрессия cad6 временная и ограничена ранними стадиями (Inoue et al.,1997). Воздействие на стадии средней гаструлы на эмбрионы мыши ретиноевой кислотой индуцирует сдвиг вперед экспрессии Hoxa-1 (Hox-1.6) и Hoxb-1 (Hox-2.9) генов.

HOXB-1 ген

Hoxb-1 гены наиболее эффективно активировались комбинацией лигандов TTNPB и LG69, указывая на то, что активация этих генов усиливается в присутствии связанных лигандами RAR и RXR рецепторов, соответственно. (Lu et al.,1997).Hoxa-1 и Hoxb-1 гены мыши имеют 3' энхансеры (RAIDR5 enhancer, включающий DR5 RARE, conserved element (CE) 1, и CE2, ) со сходными последовательностями, экспрессия и реактивность (responsiveness) которых контролируется эндогенными ретиноидами. Так, CE2 последовательности TATTTACTCA связывают RA-индуцируемый фактор, который является белком в 170-kDa. Сходные последовательности в гомологе Ноха-1 человека. Retinoic acid response elements (RAREs), расположенные в 3' энхансере и 5' промотор гена Hoxb-1 ,могут функционировать соответственно как позитивный и негативный регуляторы,которые обеспечивают как диффузную (early positive)так и сегментно специфицированную и ограниченную (late negative) эксперссию гена . Такое действие ретиноевой кислоты позволяет понять нормальный эмбриогенез и влияние на этот процесс эктопической ретиноевой кислоты, ведущее к тератогенезу.

При целенаправленном разрушение гена Hoxb-1 мутантные мыши характеризовались неспособностью формировать соматический двигательный компонент VII (facial) нерва,возможно из-за неспособности специфицировать эти нейроны . Фенотип hoxb-1 мутантных гомозигот сильно напоминает клинические проявления у людей с Bell's Palsy или Moebius Syndrome(Goddard et al., 1998)

Воздействие на стадии средней гаструлы на эмбрионы мыши ретиноевой кислотой индуцирует сдвиг вперед экспрессии Hoxa-1 (Hox-1.6) и Hoxb-1 (Hox-2.9) генов.

HOXA-2 ген

Hoxa-2 имеет ростральную границу экспрессии в нервной трубке в точности между ромбомерами (r)1 и 2; это наиболее ростральная граница из всех нох генов. Клетки НГ,мигрируют из r2 в первую бранхиальную дугу, однако ни в появляющихся клетках НГ, ни в первой бранхиалной дуге не обнаруживается экспрессия Hoxa-2. На уровне же r4, и нервная трубка и клетки НГ , мигрирующие во вторую бранхиальную дугу, экспрессируют Hoxa-2. Hoxa-2 , следовательно, имеет разные передние границы экспрессии в нервной трубке и клетках НГ. Трансплантации ромбомеров до образования границ показали, что в клетках НГ сформирован препаттерн в отношении экспрессии Hoxa-2. Решение о подавлении экспрессии Hoxa-2 в НГ, происходящем из r2, и в поддержании экспрессии Hoxa-2 в НГ r4-производном является внкутренне присущим свойством популяции премиграторных клеток НГ. При взаимных трансплантациях r4 и r2 , экспрессия Hoxa-2 поддерживается в клетках НГ, происходящего из r4, но теряется в НГ, происходящем из r2.

The Hoxa-2 ген разрушали с помощью гомологичной рекомбинации. Гомозиготные мутанты погибали при рождении. Дефект обнаруживался в бранхиальной области головы, которая соответствовала ростальному домену экспрессии Hoxa-2. Так как сегментация на заднего мозга на ромбомеры и клеток НГ не нарушена, однако мезенхимные производные клеток НГ во второй дуге отсутствовали и состояние детерминации мезенхимных клеток НГ было изменено в состояние, характерное для первой дуги(Gendron-Maguire., 1993). Имела место гомеозисная трансформация скелетных элементов второй дуги в элементы первой дуги. Появление атавистического птеригоквадратного ( pterygoquadrate) элемента рептилий у мутантов Hoxa-2 указывает на то, что это основополагющий паттерн является промежуточным у рептилий и млекопитающих. The ground pattern program appears to be modified in the mouse first arch by a Hox-independent process, whereas Hoxa-2 acts as a selector gene in the second arch (Rijliet al., 1993).Ген Ноха-2 контролирует направление пути миграции двигательных аксонов от ромбомеров r2-r3 )(Gavalas al., 1997).

Показано, что ген Ноха-2 находится под контролем вышестоящего гена Krox-20 и обеспечивает ромобер-специфическую экспресиию подчиненного гена тирозинкиназного рецептора мыши (MDK1)(Taneja al., 1996).

HOXA-3 ген

Изучали паттерн и регуляцию экспрессии Hoxa-3 в заднем мозге и ассоциированных клетках НГ у эмбрионов кур. Hoxa3 экспрессируется в нервной пластинке, позднее в нервной трубке с ростральной границей экспрессии, соответствующей границе между ромбомерами (r) 4 и 5. Первоначально экспрессия диффузна и становится четкой после образования границ. Hoxa3 обнаруживает униформную экспрессию в r5 после образования границ между ромбомерами. Установлено, что клетки НГ, мигрирующие каудально, но не рострально, от r5 и каудально от r6 экспрессируют Hoxa3 у нормальных эмбрионов. Результаты экспериментов по переносу показали, что экспрессия Hoxa3 в r5 клетках НГ не является строго клеточно-автономной. Когда r5 перемещается вместе с r4 с помощью ростро-каудальной ротации ромбомеров, то Hoxa3 экспрессируется в клетках, мигрирующих латерально по отношению к транспозированному r5 и в течение короткого времени,в конденсирующиеся ганглии, но не с помощью НГ во вторую бранхиальную дугу. Так как меченные клетки от транспозированного r5 присутствуют во второй дуге, Hoxa3-экспрессирующие клетки НГ от r5, по-видимому, подавляют свою Hoxa3 экспрессию в новом окружении (среде). Напротив, когда r6 перемещается в положение r4 после образования границ, то Hoxa3 экспрессия сохраняется как в мигрирующих клетках нервного гребня , так и в тех, что расположены внутри второй бранхиальной дуги и ассоцированных ганглиях. Эти результаты указывают на то, что Hoxa3 экспрессия явлется клеточно-автономной в r6 и в ассоциированном с ним НГ . Следовательно, клетки НГ, экспрессирующие один и тот же ген Hox не эквивалентны ; они отвечают по разному на средовые сигналы и обладают разной степенью клеточной автономии в зависимости от происхождения их ромбомеров (Saldivar et al., 1996).

Тимус, щитовидная и паращитовидные железы у позвоночных развиваются из глоточной области, со вкладом в бранхиальные дуги как глоточной энтодермы, так и клеток НГ. Мутантные гомозиготы мыши по гену Hoxa3 имеют нарушения в развитии всех трех органов. Изучали роль паралогов Hoxa3 , Hoxb3 и Hoxd3, путем исследования различных комбинаций мутаций. Дефекты щитовидной железы, обнаруживаемые у одиночных Hoxa3 мутантов, усиливаются у двойных мутантов с любым из паралогов, однако ни одна комбинация мутантов не приводила к агенезу щитовидной железы . Результаты указывают на то, что первичная роль этих генов в развитии щитовидной железы заключается в их эффекте на развитие и миграцию ultimobranchial телец,которые вносят свой вклад в парафолликулярные или С-клетки щитовидной железы. Hoxb3, Hoxd3 двойные мутанты не обнаруживали явных дефектов в тимусе и паращитовидных железах. Однако удаление одной из функциональных копий Hoxa3 из Hoxb3, Hoxd3 двойных мутантов (Hoxa3 +/-, Hoxb3-/-, Hoxd3-/-) обусловливает неспособность тимуса и паращитовидных желез мигрировать в их обычное положение в in the throat. Полученные результаты указывают на то, что Hoxa3, Hoxb3 и Hoxd3 имеют высоко перекрывающиеся функции в обеспечении миграции зачатков фарингеальных органов. Кроме того Hoxa3 обладает уникальной функцией по отношению к свои паралогам в развитии тимуса, паращитовидных и щитовидной желез . Эта уникальная функция м.б. скорректирована экспрессией Hoxa3, но не Hoxb3 или Hoxd3, в энтодерме фарингеальных карманов (Manley , Capecchi,1998).

HOXD-3 ген

Получены мыши с разрушенным homeobox-containing gene Hoxd-3 (Hox-4.1). У мышей, гомозиготных по данной мутации существенно модифицировано craniocervical соединение. Пердняя дуга атланта трансформирована в расширение базиокципитальной кости черепа. Латеральные массы атланта также морфологически больше напоминают exoccipitals и в разной степени слиты с exoccipitals. Образование второго шейного позвонка , the axis, также нарушено. The dens and the superior facets делетированы,а axis обнаруживает 'atlas-like' характеристики. Разные части одного и того же позвонка по разному затрагиваются потерей функции гена Hoxd-3 . Некоторые части делетируются другие гомеотически трансформируются в более передние структуры. Следовательно, ген Hox может по-разному контролировать скорость пролиферации мезенхимных конденсатов , которые дают позвонковые хрящи. У мышей в Hox комплексе, паралогичные гены не только кодируют очень сходные белки , но также часто обладают очень сходными паттернами экспрессии. Следовательно,можно постулировать, что паралоги выполняют сходные роли. Однако не обнаружено нарушений в исследованных тканях или структурах у мутантов по паралогичным генам Hoxa-3 и Hoxd-3 (Condie , Capecchi , 1993).

HOXB-4 ген

Установлено, что временная передача сигналов от параксиальной мезодермы индуцирует экспрессию Hoxb4 в заднем мозге. Индукция происходит при участии ретиноидного пути, нуждающегося в рецепторах ретиноевой кислоты RAR, функционирующих в нейральной пластинке. Анализ преромбомерного энхансера из Hoxb4 показал, что элемент, реагирующий на ретиноевую кислоту, является обязательным компонентом ранней нейральной реакции на сигналы от сомитов и может интепретировать позиционную информацию для закладки передней границы экспресси. Предполагается, что экспрессия Hoxb4 инициируется внешними сигналами и поддерживается петлей обратной связи Нох.

Анализ временной и пространственной регуляции Hoxb4 в ЦНС эмбрионов кур выявил два различных механизма функционирования во время преромбомерной и сегментной стадии и что каждый из них связан с отдельным энхансером. Преромбомерный энхансер (Early NE) обеспечивает ЦНС-ограниченную экспрессию, которая распространяется над будущей границей r6/7. В течение слудующих 48 ч передняя часть экспрессии Hoxb4 регрессирует и устанавливается передняя граница его экспрессии r6/7. Активность раннего NE индуцируется сигналами de novo от параксиальной мезодермы. Поздний NE в точности маркирует границу r6/7 окончательно, но после того как формирование ромбомеров становится видимым. Этот ромбомерный энхансер содержит Нох-отвечающий элемент. Сомитами-индуцируемая продукция HOXB4 с помощью раннего NE запускает актиность подзднего NE и стабильно поддерживает экспрессию вплоть до r6/7 границы с помощью Нох петли обратной связи. Эта петля нуждается также в подпитке сигналами от параксиальной мезодермы для поддержания экспресси Hoxb4.

Природа мезодермального сигнала пока неясна. Активация раннего NE может осуществляться как непосредственно ретиневой кислотой, так и хаперонами для ретиноевой кислоты, так и отдельными сигналами.

HOXD-4 ген

Показано, как экспрессия куриного гомеобоксного гена Hoxd-4 начинается в задней части примитивной полоски и затем распространяется вперед , покрывая большую часть примитивной полоски на стадии 2-х сомитов, покрывая всю примитивную полоску на стадии 5 сомитов и достигая уровня somite 1/somite 2 в нервной трубке на стадии 9 сомитов и достигая границы rhombomere 6/rhombomere 7 в заднем мозге на стадии 15 сомитов. Это распространение не зависит от миграции клеток. Более того это распространение , по-видимому,не нуждается в непрерывности ткани, так как оно не блокируется непроницаемым стекляным барьером , имплантированным в эмбриональную ткань. По мере увеличения домена экспрессии Hoxd-4 он подразделяется на стадии поздней примитивной полоски на "anterior" и "posterior zones," с "intermediate zone" слабой экспрессии или отсуствием экспрессии. Четкие передняя и задняя зоны обнаружены также для экспрессии генов Hoxa-3 и a-4 у эмбрионов мыши на стадии поздней примитивной полоски. Получены доказательства, что передняя зона соответствует "дефинитивному" домену экспрессии Hox генов, ранее охарактеризованных для midgestation эмбрионов. Задняя зона является преходящей , очевидно существует только в течение существования примитивной полоски и является областью интенсивной экспрессии Нох в ткани примитивной полоски , Hensen's node, и соседних областях нейроэктодермы и мезодермы. Предполагается, что задняя зона маркирует источник морфогена , который является первичным активатором экспрессии Hox генов (Gaunt , Strachan, 1994).

HOXC-8 ген

Ген Нохс-8 экспрессируется в гематопоэтических органах мыши, в печни плодов и взрослом костном мозге.

HOXB13 ген

Охарактеризован гомеобелок, регулятор экспрессии гена инсулина, НОХВ13. Он содержит элемент для связи с промотором гена инсулина, он модулируется Са++-зависмой СаМ киназой IV, и меет гомологию с нуклеотидными последовательностями, кодирующими Нох генный комплекс. Он связывается с FLAT элементом промотора гена инсулина; он действует синергично с другими регуляторми экспрессии гена инсулина, а именно, с Pan-1; его активная область в или вблизи N-конца белка; он картирован в длинном плече хромосомы 17 человека, 17q21.

Изучали экспрессию НохВ13 на стадии Е13-17 эмбриогенеза мыши. Его экспрессия обнаруживалась в эпидермисе плодов, но не в волосяных фолликулах или дерме. Его экспрессия обнаруживалась в слизистой рта, но не в эпителии языка. НохВ13 экспрессируется во всей поперечно-полосатой мускулатуре, но не в гладких мышцах. В легких его экспрессия ограничена воздушными путями и отсутствует в респираторном эпителии. Слабая экспрессия обнаруживается в собирающих канальцах почек. Интенсивное НохВ13 окрашивание обнаруживается в хороидном сплетении, но не ЦНС. Т.обр., НохВ13 экспрессируется в основном в органах эктодермального и мезодермального происхождения ( эпидермис, поперечно-полосатые мышцы) и отсутствует в органах, происходящих из энтодермы ( ЖКТ, пищеварительные железы).

HOX гены