Kinesin: world's tiniest biped | |
|
Kinesin, an essential motor protein that moves intracellular cargo along microtubules, walks like a person. When we walk, our feet exchange roles with each step, one moving and one remaining stationary. The moving foot travels twice as far as our torso during a single step, and our body alternates between two configurations (left vs. right leg leading). Recent work shows that kinesin shares all three of these hallmarks of bipedal walking. The challenge now is to determine how the gait of this lilliputian biped is coordinated.
Рис.1. | The structure of a kinesin molecule. Two identical polypeptides (red and blue) dimerize to form a coiled-coil stalk, with a cargo-binding tail at one end, and twin globular heads at the other. Each head is a catalytically active АТФase that attaches to microtubules with nucleotide-dependent affinity. Short (not, vert, similar15 amino acid) polypeptide segments, called neck-linkers, join each head to the stalk. Рис.2. | Candidate models for kinesin. Hand-over-hand models (a and c) predict that the heads are functionally equivalent, alternating in microtubule attachment, movement and hydrolysis of АТФ. Рис.3. | Possible forms of cooperativity between the two heads of kinesin. One clear example of negative cooperativity is АТФ-dependent АДФ release. |
Kinesin моторный белок, который транспортирует груз в клетке, перемещаясь вдоль микротубулярных филамент. В общем кинезин служит в качестве важной модели того, как структура белка предопределяет его динамику и функцию. Молекула состоит из двух идентичных полипептидных субъединиц, которые димеризуются, формируя палочкообразную суперскрученный стебель (stalk) со связывавшим груз хвостом на одном конце и с двумя глобулярными доменами, обычно наз.головками, на другом (Рис. 1) [1]. Каждая головка является каталитически активной АТФase, которая прикрепляется к микротрубочке с нуклеотид-зависимым сродством. Будучи прикрепленным, kinesin ступенчато передвигается по поверхности микротрубочки шажками в 8-nm [2], гидролизуя один АТФ на каждый шажок3,4,5. Одна молекула может генерировать сотни шажков во время одной встречи с микротрубочкой [6], даже с грузом [7]. Это чрезвычайно высокая производительность указывает на то, что, по крайней мере, одна головка остается соединенной с микротрубочкой всё время. Чтобы объяснить, как кинезин перемещается без отсоединения, два класса моделей было предложено: hand-over-hand, когда две головки меняются ролями с каждым шажком, и гусеничная (inchworm), когда одна головка всегда остаётся ведущей.
Coordination is required for highly processive motion
Движение кинезина указывает на то, что его две головки действуют не независимо. Чтобы перемещаться вдоль микротрубочки без отсоединения6,7, мотор нуждается, по крайней мере, в двух местах присоединения, так что одно может поддерживать захват, тогда как другое смещается. Каждая кинезиновая головка имеет один сайт для прикрепления к микротрубочке [8], и обе головки необходимы для высоко производительного перемещения9,10. (но см. также [11]). Более того, шажки мотора однонаправлены12,13 и следуют по пути параллельно протофиламентам в решетке микротрубочки14,15. Чтобы достигнуть такого регулярного движения, первая головка не может освобождать собственный захват до тех пор, пока вторая головка не закрепится в определенном положении на микротрубочке. Т.о., головка должна каким-то образом сообщать о своем состоянии другой, чтобы скоординировать свои соединения и отсоединения.
Популярная гипотеза согласуется с большинством экспериментальных наблюдений, согласно ей две головки кинезина работают hand-over-hand, чередуя прикрепления к микротрубочке и гидролиз АТФ. В модели hand-over-hand головки меняются ведущей и подтягиваемой ролями с каждым шажком. Находящаяся сзади головка отсоединяется от микротрубочки, движется вперед и затем снова прикрепляется. Вместе с этим механическим чередованием головки также, по-видимому, меняются каталитическими ролями. Неукоснительное каталитическое и механическое чередование является в модели hand-over-hand ключевым свойством, называемым 'head equivalence', которое очень хорошо соответствует гомодимерной структуре кинезина. Структурно идентичные головки функционально эквивалентны в смысле того, что они следуют одному и тому же циклу биохимических событий, но отличаются др. от др. по фазе. Т.е. головки проделывают одни и те же вещи, но не в одно и то же время. Точная последовательность событий является предметом споров, но предположительно цикл индивидуальной головки заключается в следующем: стадия один, связывание АТФ; стадия два, гидролиз; стадия три, высвобождение фосфата; стадия четыре, отсоединение от микротрубочки; стадия пять, перемещение вперед (на 16 nm); стадия шесть, прикрепление к микротрубочке; и стадия семь, высвобождение AДФ (за чем снова следует стадия один)16-18). Координация д. нарушаться, если головки осуществляют свои циклы независимо одна от другой, так что дополнительные влияния необходимы для гарантии, что они будут чередовать прикрепление к микротрубочке, перемещения и гидролиз АТФ. С этими дополнительными влияниями модель корректно предсказывает, что каждый гидролиз АТФ соответствует перемещению на 8-nm молекулы3-5. Движущаяся головка проходит 16 nm при каждом гидролизе АТФ, когда др. головка остается прикрепленной. Стержень приобретает среднее положение для двух головок, перемещаясь только на 8 nm.
Step equivalence implies rotation in hand-over-hand models
Помимо функциональной эквивалентности головок, модель hand-over-hand также включает 'step equivalence', когда все шажки генерируются точно одним и тем же способом. Эквивалентность шажков означает, что молекула кинезина перемещается посредством идентичных последовательностей конформаций во время каждого перемещения вперед на 8-nm. В модели hand-over-hand с эквивалентностью шажков движущиеся головки всегда проходят с одной и той же стороны от прикрепленной головки (Рис. 2a, вид вверху), при этом вся молекула ротирует во время каждого шага на 180° [1]. Ротация в одном и том же направлении каждый раз или по часовой стрелке или против часовой стрелки. После каждого шага трехмерная структура молекулы оказывается идентичной за исключением того, что полипептидные субъединицы, а следовательно, и две головки, меняются местами (Рис. 2a). Такой порядок в модели hand-over-hand назввается 'symmetric', означая симметричность перемещения головок [19]. Предположение, что кинезин ротирует, когда он движется, может выглядеть неожиданным, но этому имеются прецеденты. Ротирующее движение генерируется и др. mechanoenzymes, такими как bacterial flagellar motor [20], и F1Fo-АТФ synthase [21]. Подобно этим моторам структура кинезина обладает ротационной симметрией [22].
Если используются подходы скользящих филамент или кусочков, чтобы наблюдать перемещение одиночных кинезиновых молекул, то филаменты или кусочки не ротируют, но это не устраняет симметричных hand-over-hand механизмов. При подходе скользящих филамент, микротрубочки в растворе проталкиваются вдоль с помощью моторов, связанных посредством своих стеблей или хвостов с покровным стеклом [6]. При использовании кусочков моторы вместо того, чтобы связывать кусочки микронных размеров, которые они переносят вдоль микротрубочками, связанным с покровным стеклом [7]. Несмотря на отсутствие ротации в этих одно-молекулярных подходах, симметричные hand-over-hand механизмы рассматривались как вероятные вплоть до недавнего времени [19o], т.к. motor-to-coverslip или motor-to-bead прикрепления позволяют повороты на шарнирах1,19. Благодаря шарнирным сцеплениям кинезин может осуществлять симметричное hand-over-hand перемещение без передачи вращающего момента грузу. Др. словами, кинезин может kinesin крутиться, а кусочек или филамента нет. Учитывая неопределенности с motor-to-cargo сцеплениями в живых клетках, шарнирные повороты могут происходить и in vivo.
Rigid linkages show that kinesin does not rotate
Простая модификация к подходу скользящих филамент подвигла исследователей кнезина рассмотреть вопрос симметрии и пересмотреть догму hand-over-hand dogma. Hua et al показали, что biotin-avidin сцепление между стеблем кинезина и покровным стеклом создает устойчивое соединение мотора с поверхностью, которое делает невозможным шарнирные повороты [19]. Они измерили ориентацию скользящих филамент, двигающихся за счет одиночных, ригидно прикрепленных моторов. Жесткое прикрепление гарантирует, что если кинезин будет производить симметричные hand-over-hand движения, то вращение стебля д. будет передавать вращающий момент филаменте и будет заставлять её ротировать на 180° при каждом шаге. Они работали с низкими концнетрациями нуклеотидов, так что шагание происходило очень медленно, приводя к увеличению времени между шагами для того, чтобы филамента ротировала в ответ на вращающий момент. Но ротаций не было отмечено. Ориентация филаменты никогда не менялась каким-либо систематическим образом; она лишь флюктуировала случайным образом не более чем на 30°. На основании этих результатов авт. исключили симметричную hand-over-hand модель и вместо неё предложили inchworm модель [19o]. (Асимметричная hand-over-hand модель при этом не была исключена).
Модель гусеницы позволяет сделать не ортодоксальные предположения, что головки ведут себя очень по-разному по сравнению др. с др., но сохраняется эквивалентность шажков, одним из привлекательных признаков симметричной hand-over-hand модели. В модели гусеницы одна головка всегда ведущая и каждое продвижение на 8-nm вперед мотора состоит из двух быстрых полу-шажков. Ведущая головка перемещается на 8 nm и соединяется с микротрубочкой, а затем перемещается подтягиваемая головка на то же самое расстояние (Рис. 2b, вид вверху). Только одна головка предположительно является активной АТФase, чтобы объяснить находку, что один АТФ потребляется на 8-nm продвижение. Др. головка является некаталитической, головкой 'passenger'. Головки не меняются ролями после каждого продвижения на 8-nm, inchworm модель предсказывает отсутствие переориентации стержня. Даже хотя головки определенно не эквивалентны, механизм все равно сохраняет эквивалентность шагов. Вся молекула кинезина проходит через идентичную последовательность переходов во время каждого 8-nm продвижения и трехмерная структура молекулы остается неизменной после каждого продвижения (Рис. 2b).
Эксперимент Hua et al [19] формально не исключает всех hand-over-hand механизмов, но он заставляет делать выбор между эквивалентностью головок и эквивалентностью шагов. Отсутствие ротации стержня может быть обусловлено с помощью класса hand-over-hand механизмов, названных 'asymmetric', с функционально эквивалентными головками, но не эквивалентными шагами. Обе головки могут всё ещё подвергаться одной и той же основной последовательности биохимических переходов и движений большой шкалы (e.g. the hypothetical sequence above). Но движение головки д. происходить на чередующихся сторонах по отношению к прикрепленной головке в последовательных шагах (Рис. 2c, вид вверху), a структурные элементы, соединяющие головки со стержнем, д. производить компенсаторные движения для супрессии 180° реориентации, которая д. происходить помимо прочего, когда две головки меняются местами (Рис. 2c, вид сбоку). Имеются семейные признаки нашего собственного хождения на двух ногах, так что это может выглядеть естественным для описания с его помощью кинезина. Наши ноги меняются местами, но наши бедра соединены суставами так, что тело не меняет ориентации при каждом шаге. В отличие от нашего тела, однако структура кинезина не обладает зеркальной (балатеральной) симметрией [22]. Кинезин не имеет одной левой и одной правой ноги; он имеет две левые ноги. Следовательно, для кинезина хождение подобно нам д. происходить двумя разными типами шагов и молекула д. переключаться между двумя фундаментально отличными конфигурациями после каждого шага (Рис. 2c). Итак, демонстрация, что кинезин не ротирует, поставило исследователей перед лицом выбора. Некоторые предпочли эквивалентность головок, постулируемую асимметричной hand-over-hand моделью, тогда как др. предпочли эквивалентность шагов, постулируемую inchworm механизмом.
New evidence for an asymmetric hand-over-hand mechanism
Недавние эксперименты, осуществленные в трех независимых лаб. и опубликованные почти одновременно, предоставили строгие доказательства, что кинезин перемещается с помощью асимметричного hand-over-hand механизма. Некоторые характерные признаки этого класса механизмов были подтверждены. Во-первых, головки чередуются в отношении гидролиза АТФ [23]. Во-вторых, молекулы переключаются между двумя разными конформациями после каждого шага [24]. В-третьих, головки продвигаются на 16-nm расстояние, вдвое большее, чем передвигается стержень при каждом шаге [25]. Все ти эксперимента базировались на отслеживании с высоким разрешением перемещения одиночных молекул кинезина или с помощью оптической ловушки23,24 или с помощью флюоресцентной техники одиночных молекул [25].
Оптическая ловушка очень существенно меньше, очень широкая световая точка, которая улавливает объекты микронной величины, такие как стеклянные или полистиреновые кусочки и осуществляет восстановление сил force всякий раз, когда объект уходит из центра фокуса. В подходе kinesin bead ловушка может быть использована для захвата и помещения кусочка вблизи иммобилизованной микротрубочки [7]. Когда кинезин прикрепляется к микротрубочке, то он начинает двигаться и тянуть за собой кусочек. Натяжение, прикладываемое ловушкой, редуцирует индуцируемое теплом (Броуновское) движение до nanometer уровня, так что кусочек следует пошаговому перемещению моторного стебля (motor stalk), продвигаясь на дискретные приросты и занимая хорошо определяемые положения между продвижениями [2].
Используя оптические ловушки для записи движения нативного и мутантных кинезинов две группы независимо установили, что некоторые молекулы плетутся (хромают) вдоль микротрубочек, обнаруживая различия во времени каждого следующего шага. Наиболее тяжелой хромотой страдали гетеродимеры с одной мутантной головкой, которая гидролизовала АТФ более медленно, чем др. [23]. Строгое чередование во времени шагов у этих гетеродимеров указывает на то, что головки чередуются в отношении гидролиза АТФ, это исключает гусеничный (inchworm) механизм, где одна головка каталитически неактивна. Серьёзная хромота обнаруживалась и у гомодимеров, несмотря на идентичность их головок24,26. Хромота этих гомодимеров не может быть объяснена каким-либо механизмом с эквивалентными шажками, т.к. идентичные конформации д. возникать за идентичное время. Чтобы вызывать различия во времени, молекулы д. переключаться между двумя разными конформациями после каждого шага, как предсказывает асимметричная hand-over-hand модель.
Используя флюоресценную технику отдельных молекул третья группа исследователей показала, что движущаяся головка кинезина перемещается на вдвое большее расстояние, чем её стержень во время каждого шага [25]. Чтобы проследить такое движение молекулу флюоресцентной окраски прикрепляли к выступающему цистеину на поверхности одной из головок. Положение краски затем отслеживали, т.к. меченный мотор двигался вдоль микротрубочки иммобилизованной на покровном стекле. Положение краски можно было локализовать с нанометровой точностью за долю секунд [27]. С помощью этого метода движения кинезиновой головки отслеживали при низких концентрациях АТФ , когда шажки происходили примерно один шаг в сек. Индивидуальные головки продвигались на расстояние 16 nm, а не на 8 nm подобно стержню, эта находка не согласуется с гусеничным механизмом. Также время передвижений головки подтвердило, что меченная головка делает паузу после каждого продвижения, по-видимому, пережидая продвижение немеченной головки.
Каждый из этих экспериментов внёс существенный и самостоятельный вклад в общее заключение, что кинезин перемещается, используя асимметричный hand-over-hand механизм. Эксперименты с ловушками осуществляли при высоких концентрациях АТФ и при наличии внешнего груза, прикрепленного к мотору, тогда как работа с флюоресценцией осуществлялась при низкой концентрации АТФ, в режиме без нагрузки. Механизм, следовательно, работает независимо от того, ограничена ли скорость мотора скоростью связывания нуклеотидов или от др. механохимических событий. Кроме того, эксперименты использовали разыне белковые конструкции от нескольких видов, так что заключение скорее всего приложимо ко всем высоко processive, димерным кинезинам.
Puzzling results to consider
Сегодня имеются существенные доводы, что кинезин путешествует hand-over-hand. Но всё ещё имеются неожиданные результаты, требующие рассмотрения, а фундаментальный вопрос о механизме так и остаётся без ответа. Во-первых, что заставляет хромать (limping) гомодимерные кинезины? Хромание ожидается для гетеродимеров, которые были изучены23,28, т.к. эти молекулы были искусственно изменены, чтобы иметь одну медленную и др. нормальную головку. Гомодимеры, однако, не имеют очевидной структурной асимметрии, так что такая легкая хромота д. иметь резоны. Имеющиеся доказательства указывают на то, что механическая жёсткость суперскрученного стержня влияет на тяжесть хромоты. Структурный переход, связанный с перемещением стержня, выявляется чётко, т.к. степень хромоты варьирует в зависимости от величины силы, прикладываемой к стержню [26], и от длины стержня [24]. Оба эти эффекта может быть объяснены зависимостью от жесткости стержня. Более короткие филаменты более жестки, чем более длинные, если все они равноценны, a прикрепленный груз также увеличивает жесткость молекулы, как показывает снижение термальных флюктуаций у увеличением груза2,29.
Свойства стержня могут влиять на время шага разными способами. Во-первых, при bead подходе, жесткий стержень д. эффективно передавать любую асимметрию в motor-to-bead сцеплении на одном конце к головкам на др. конце. При асимметричном сцеплении, напр., одна головка может обнаруживать тенденцию к проекции прочь от поверхности кусочка, тогда как др. проецируется в его направлении. Головка, проецирующаяся в направлении кусочка, д. требовать больше времени для достижения своего места прикрепления к микротрубочке, обусловливая тем самым различия во времени каждого следующего шага. Более поддатливые стержни делают возможными большие термальные флюктуации головок относительно кусочков, снижая тем самым любые асимметричные эффекты motor-to-bead сцепления и понижая степень хромоты.
По второму сценарию хромота обусловливается избыточной и недостаточной закрученностью стержня во время hand-over-hand движения [24]. Суперскрученность, как полагают, обладает асимметричной торсионной гибкостью из-за их скрученной (i.e. chiral) структуры. Хотя энергетический барьер для избыточной и недостаточной скрученности стержня д. отличаться в зависимости от направления (handedness) скручивания. Поддатливость стержня д. представлять низкие торсионные барьеры. Если такие барьеры влияют на скорость продвижения головки, то они д. вызывать кинетическое чередование, которое д. оказаться менее тяжелым для гибких стержней.
В третьей модели хромание индуцируется с помощью аксиальной неправильной регистрации ?-спиралей суперскрученного стержня [24]. Две спирали взаимодействуют посредством периодических из семи (heptad) повторов гидрофобных аминокислот, которые упакованы вместе в аккуратное 'knobs-in-holes' расположение. Они обычно, как предполагается, димеризуются in register, но это предположение не было проверено. Др. суперскрученные белки могут адоптировать разной формы упаковки [30], открывая тем самым возможность того, что неправильная регистрация (misregistration) происходит также и в стволе кинезина. Неправильная регистрация с помощью одного heptad повтора д. сдвигать головку относительно другой, эффективно увеличивая максимум neck-linker длины для одной головки, но не наоборот, порядка 1 nm (т.е. от 3 до 4 nm). Этот сдвиг д. обусловливать то, что одна головка нуждается в большем времени для достижения своего места прикрепления на микротрубочке в diffusional исследованиях, по сравнению с др. головкой. В некоторых случаях уменьшение хромоты с увеличением длины стебля может быть объяснено, если более длинные стебли менее склонны к неправильной регистрации.
Др. интересным наблюдением может быть проблема гипотезы эквивалентности головок. Кинезиновые конструкции с точковыми мутациями в обеих головках, которые снижают АТФазную активность в 700 раз или более, не поддерживают движения в подходах с кусочками. Неожиданно гетеродимеры с мутацией только одной из двух головок, способны к перемещениям на длительные расстояния [31]. Этот результат кажется парадоксальным и он может указывать на то, что высоко processive движение возможно без чередующегося катализа. Однако, альтернативной гипотезой является то, что дефектная АТФазная активность мутантной головки нормализуется при димеризации с головкой дикого типа. Некий дефект д.б. устранен, чтобы объяснить подвижность гетеродимеров. Нормализация АТФase кажется возможной, по крайней мере, из-за структурных изменений, вызываемых этими мутациями, которые являются очень легкими, и из-за того, что функциональный дефект является очень ограниченным в масштабах. Мутация не нарушает ассоциации с микротрубочками, высвобождение АДФ или координацию между головками [32]. Восстанавливается или нет АТФазная активность, но этот результат ставит важные вопросы о том, как одна головка может влиять на активность др.
Fundamental questions remain unanswered
Вопрос о том, как две головки кинезина координируются др. с др. является наиболее фундаментальным пробелом в нашем понимании механизма перемещения кинезина. Достаточно ясно, что одна головка м. влиять на некоторые аспекты поведения др. Задача в том. чтобы расшифровать, как эти влияния передаются между головками и как они обеспечивают hand-over-hand перемещение.
Наиболее очевидной демонстрацией того, что одна головка влияет на др., является пример негативной кооперативности, при которой одна головка задерживает высвобождение АДФ в др. В отсутствие микротрубочек АДФ крепко связывается с обеими головками (Рис. 3, состояние 0). После первого контакта с микротрубочкой одна головка прикрепляется к филаменте и немедленно высвобождает АДФ , а др. остается отсоединенной от филаменты или прикреплена очень слабо, вплоть до того момента, пока первая головка не свяжет АТФ33-35. Это АТФ-зависимое высвобождение АДФ может управляться с помощью конформационного изменения в области шейка-линкер (neck-linker) кинезина. Эксперименты с одно-головчатыми конструкциями показали, что neck-linker подвергается нуклеотид зависимому от беспорядка к порядку переходу [36]. В присутствии АДФ, или когда нуклеотид отсутствует, neck-linker находится в неупорядоченном состоянии, флексибельная связь исходит из точки позади головки. Когда головка прикреплена к микротрубочке в присутствии аналогов АТФ (AMPPNP, АДФ-AlFx), то её linker становится иммобилизованным на поверхности головки, а дистальный конец линкера оказывается направленным на фронтальную часть головки. На основании этой находки предложена модель для полного двуголовочного мотора, согласно которой иммобилизация neck-linker на одной головке движет стебель кинезина и, следовательно, вторую головку, в направлении и на место следующего присоединения на решетке микротрубочки [36] (Рис. 3, состояние 2). Это, в свою очередь, способствует прикреплению к микротрубочке второй головки, которое запускак высвобождение АДФ (Рис. 3, состояние 3). Согласуются с этой моделью и точковые мутации, которые нарушают динамику neck-linker , предупреждая тем самым АТФ-зависимое высвобождение АДФ [36].
Днамика neck-linker может управлять АТФ-зависимым высвобождением АДФ, когда кинезин впервые сталкивается с микротрубочкой, но роль neck-linker во время processive шагания неясна. Динамика этой области наблюдалась непосредственно только при использовании конструкций, которые лишены стебля и второй головки, что делает невозможным поступательное движение. В полном двухголовчатом моторе положение neck-linker и его взаимоотношение с определенными нуклеотидами в активном сайте может быть иным по сравнению с тем, что обнаружено в одноголовчатых конструкциях [16]. Кроме того, изменения свободной энергии, ассоциированные с neck-linker иммобилизацией, малы [37], так что даже средний груз, прикрепленный к стеблю, д. предупреждать иммобилизацию. Kinesin всё ещё генерирует шаги под таким грузом, указывая тем самым, что neck-linker docking не может быть существенной частью этого механизма. С др. стороны, поперечное связывание neck-linker с головкой оказывает драматический эффект на подвижность [38], указывая тем самым, что движения neck-linker в чем-то важны.
Additional forms of cooperativity must occur
Само по себе, АТФ-зависимое высвобождение АДФ несущественно для координации головок. Напр., рассмотрим ситуацию после АТФ-индуцированного высвобождения АДФ из второй головки, которая д. быть впереди (Рис. 3, состояние 3). Без дальнейших принуждений передняя головка будет связывать АТФ, так что обе головки содержат АТФ. Если происходит гидролиз и высвобождается фосфат, то он происходит в обеих головках, и обе они одновременно д. отсоединиться, не завершив 8-nm шаг. Некоторые дополнительные влияния необходимы для гарантии, что отсоединение задней головки будет происходить после прикрепления передней головки.
По крайней мере, предположены две др. формы кооперативности и они могут оказывать дополнительные влияния, необходимые для полной координации головок. После АТФ-индуцированного высвобождения АДФ свободная от нуклеотида фронтальная головка задерживается со связыванием АТФ [39], это указывает на существование др. типа негативной кооперации. Задержка связывания АТФ сохраняется, по крайней мере, у одного мутанта, даже после гидролиза и высвобождения фосфата в др. головке [18]. На основании этого предложена модель, согласно которой связывание АТФ фронтальной головкой является следствием отсоединения задней головки от микротрубочки18,39. Эта гипотеза в комбинации с гипотезой АТФ-запускаемого прикрепления передней головки, описанная ранее, может полностью координировать мотор. АТФ присоединяется к прикрепленной головке только тогда, когда др. головка отсоединена, это вызывает перемещение отсоединенной головки во фронтальное положение, где она прикрепляется к микротрубочке и высвобождает АДФ. С мотором в этом состоянии прикрепления обеих головок фронтальная головка не может связывать АТФ, даже если её активный сайт пуст. Когда гидролиз и высвобождение фосфата происходят в тыльной головке, то она отсоединяется, это приводит к блоку форонтальной головки и к завершению цикла. Если необходимо полное отсоединение тыльной головки, чтобы вызывать блок, то при значительно более низких концентрациях АТФ мотор будет пребывать в состоянии, когда только одна головка присоединена к микротрубочке. Это предположение очевидно находится в конфликте с доказательствами, подтверждающими состояние ожидания с прикреплением обеих головок [25], но расхождение может быть разрешено за счет одного изменения в модели: полное отсоединение тыльной головки не обязательно, а существенен скорее переход от строгой связи к состоянию слабого связывания, чтобы сделать возможным связывание АТФ фронтальной головкой, это может затем запускать полное отсоединение тыльной головки и движение её во фронтальное положение. АТФ-запускаемое отсоединение тыльной головки является примером позитивной кооперации, которая также подтверждается экспериментами с одноголовчатыми кинезинами. Для некоторых производных одноголовчатого кинезина спонтанное отсоединение от микротрубочки происходит слишком медленно, чтобы объяснить скорость отсоединения во время поступательного движения двуголовчатого мотора [40]. Если та же самая спонтанная скорость приложима к тыльной головке во время поступательного движения, то отсоединение этой головки д. каким-то образом ускоряться за счёт фронтальной головки10,16,40,41.
Механическое натяжение д. вызывать сигналы, посредством которых головки влияют др. на др., но доказательства этому косвенные. Головки могут быть отсоединены от микротрубочек с помощью внешних сил, сила отсоединения ниже для переносимого вперед груза (т.е. в направлении плюс-конца микротрубочки) чем для переносимого назад (в направлении минус-конца) [42]. Также, АДФ соединяется более крепко с головками, когда переносится груз вперед [43]. Эти находки ведут к предположению, что фронтальная головка вызывает отсоединение тыльной головки и предупреждает тыльную головку от высвобождения АДФ, благодаря тяге её вперед. Более того, сродство головок к АДФ может быть редуцировано с помощью приложения backward груза [43]. Исходя из предположения, что сродство к АТФ затрагивается одинаково, можно предположить, что тыльная головка предупреждает связывание АТФ с фронтальной головкой путем оттягивания её кзади. Натяжение между головками ожидается, когда молекула принимает состояние прикрепления обеих головок, т.к. значительное искажение кристаллической структуры необходимо для одновременного прикрепления к микротрубочке [44]. К сожалению велична натяжения трудно определима. Координация посредством стерео-специфических взаимодействий между головками, как это происходит и в др. аллостерических энзимах (напр., hemoglobin), вряд ли имеет место у кинезина, т.к. головки обладают минимумом точек контакта в кристаллической структуре [22], a neck-linkers, которые соединяют их часто нарушены.
Conclusions
Our understanding of kinesin continues to advance very rapidly. To some extent, progress is driven by technological improvements. The motion of single kinesin molecules and sub-domains within these molecules can now be followed in real time using advanced microscopy techniques. Specific amino acid substitutions and fluorescent tags are also easily added using modern methods of molecular biology and protein engineering. These methods have allowed us to determine many details about the mechanism of kinesin, including the recent confirmation that its two heads probably work hand-over-hand. We do not understand how the heads are coordinated, but new techniques may help uncover the salient details. Techniques allowing simultaneous observation of mechanical and biochemical events at the single molecule level [21] will be particularly useful.
Apart from technological improvements, the study of kinesin and other motor proteins has advanced because of the widespread interest these molecules inspire. Motor proteins are interesting not only to cell biologists and biophysicists, but also to engineers, nanotechnologists and even televangelists (!) [45]. Kinesin is especially fascinating because of its small size, its very high processivity, and now, because its motion bears a resemblance to the way we walk. More importantly, kinesin and kinesin-like proteins are involved in fundamental cell processes, including mitotic spindle formation, chromosome dynamics, and vesicle and organelle movement. By elucidating how kinesin moves, we gain insight into the exquisite dynamics of living cells. Taking a broader view, the study of kinesin offers rare, direct insight into fundamental questions about how a protein's structure determines its dynamics and function.
|
Сайт создан в системе uCoz