MLC1F/3F
Kelly at al. (2000)

Щелочные или эссенциальные миозиновые легкие цепи myosin light chains (MLC) кодируются двумя молекулаи легких цепей миозинового гексамера, эти субъединицы обеспечивают скорость укорочения миозиновых филамент вдоль актинового влокна. MLC1F/3F ген один из 3-х генов щелочкой MLC у млекопитающих, он кодирует с независимых промоторов две большие изформы взрослых быстрых скелетномышечных волокон MLC1F и MLC3F. 2 других гена из этого семейства кодируютт MLC1A (1emb), который экспрессируется в миокарде предсердий и эмбриорнальных скелетных мышцах и MLC1V(1S), которы экспрессируется в вентрикулярном миокарде и медленных скелетно-мышечных волокнах. Ген MLC1A (1emb) наиболее близок к родоначальной форме позвоночных.	MLC1F и MLC1A (1emb) являются превалирующими изоформами эмбриональных скелетных мышц. Активация транскрипции MLC3F выявляется с Е13 у мышей. Транскрипция MLC1F возрастает вдвое между Е14.5 и Е18.5, а транскрипция MLC3F увеличивается в 14 раз в тот же период. Это скорее усиление, чем активирование, так как низкий уровень транскрипции MLC3F выявляется в скелетных мышцах и до Е13. Во время развития сердца экспресссия MLC3F ограничивается предсердиями на ст Е13.5 в результате подавления его активности сначала в правом, потом левом желудочке. Невзаимосвязанная активность MLC1F и 3F промоторов гена легкой цепи щелочного миозина 1F/3F вместе со сложным паттерном транскрипции в развивающихся скелетных и сердечных мышцах позволили выявить ряд цис-действующих модулей, управляющих паттерном экспрессии двух промоторов. Эти цис-действующие регуляторные модули, включая и MLC1F и 3F промоторные области и два скелетно-мышечных энхансера, контролируют тканеспецифичность, клеточную специфичность и специфичность типа волокон, а также пространственно-веременную регуляцию экспрессии гена, включая позиционную информацию. Эмбриональный и плодный миогенез Помимо MLC3F и ряд других склетномышечных генов селектинво усиливается или активируется во время плoдного миогенеза, включая МСК, perinatal МНС и β-enolase. Эти транскрипционные изменения совпадают с началом вторичного миогенеза и иннервацией. Эмбиональные и плодные миобласты отличаются разными миогенными программами Так как актинвость MLC1F/3F 3' энхансера усиливается при избыточной экспрессии Ski, то этот энхансер может играть дополнительную роль во время плодного миогенеза, альтернативно Ski может активировать также и второй интронный энхансер. В этом втором энхансере имеется MEF2 сайт, сходный с таковым в МСК, который имеет сходный паттерн активации. Дополнительный MEF2 сайт обнаружен и 3' энхансере и MLC3F промоторе. Репрессорная молекула с цинковыми пальчиками, BERF1, экспрессируется в эмбриональных, но не в плодных скелетных мышцах, связываясь с G-богатым боксом энхансера в первом интроне гена β-enolase и может отвечать за репрессию транскрипции β-enolase до наступления плодного периода. Такого П-богатого бокса не выявлено в интронном энхансере гена MLC1/3F, что позволяет предположить, что этот элемент скорее активируется во время плодного миогенеза, чем репрессируется во время эмбрионального миогенеза. В начале плодного периода возникают нервно-мышечные контакты. Было показано, что иннервация необходима для накопления MLC3F белка и не нужна для накопления MLC1F. Предполагается, что нервы высвобождают трофический фактор, необходимый для активации MLC3F. Тем не менее интронный энхансер MLC1F/3F активируется своевременно в мышцах задних конечностей, лишенных иннервации из-за peroneal muscular atrophy. Очевидно спонтанные сокращения в этом случае достаточны для активации интронного энхансера. Рострокаудальный градиент активности трансгена Трансген крысы MLC1F-CAT 3' энхансер обнаруживает рострокаудальный градиент экспресссии. У взрослых мышей экспресссия увеличивается более чем в 100 раз от ростральных к каудальнм мышцам, это касается и мышц со сходным типом волокон, таких как межреберные мышцы. Такая экспрессия регулируется 1.6 т.п.н. MLC1F промотора крысы и 900 п.н. 3э энхансера. Рострокаудальный градиент возникает во время развития и обнаруживается в миотомных мышцах со ст. Е10.5. Однако эндогенная экспрессия MLC1F и 3F не обнаруживает градиента транскриптов или белка. Следовательно, регуляторные элемнты, отвечающие за градент в норме молчат в эндогенном локусе и раскрываются в трансгене. Обнаружение этого градиента - первое молекулярное доказательство, что мышцы отличаются в отношении своей позиции вдоль ростро-каудальной оси, что согласуется с данными по селективной иннервации скелетных мышц нервами того же самого ростро-каудального уровня. Получены данные, указывающие на то, что Нох сайты сами по себе не управляют ростро-каудальным градиентом активности трансгена, но они модулируют транскрипцию во взрослых скелетных мышцах и этот эффект м.б. позитивным или негативным в засимимости от клеточного содержимого. Градиент оказался связанным со степенью метилирования CpG промотора и 3' энхансера, так что ростральные мышцы, в котороых репрессируется экспрессия трансгена, сильнол метилированы. Статус метилирования устанавливается до активаци трансгена. Следовательно, состояние метилирования в первую очередьотражает аксиальное положение мышечных клеток. Это указывает на то, что во время развития метилирование может участвовать в поддержании скорее, чем в создании градированной активности. В противоположность этому профилю деметилирования промотора MLC1F и 3' энхансера, специфичного для скелетных мышц, промотор MLC3F деметилирован посеместно. Однако роль деметилирования как прямого эффектора транскрипционной активности этого локуса остается пока невыясненной. Подтверждается роль 3' энхансера в установлении ростро-каудального градиента трансгенной активности. Мутация BMW Е-бокса, соседнего с гомеобокс-связывающим сайтом в 3э энхансере вызывает исчезновение ростро-каудального градиента метилирования как в 3' энхансере, так и в MLC1F промоторе трансгенных мышей. Это строго подтьверждает взаимодействие BMW сайта с позиционными сенсорами вдоль ростро-каудальной оси. Модули и MLC1F/3F ген Модульная организация цис-действующих элементов является общим свойством онтогенетичеси регулируемых генов. Эти модули обычно содержат сайты связывания для небольшого числа транскрипционных факторов, и хотя они функционально независимы в трансгенных исследованиях, отдельные модули взаимодействуют с другими модулями и проксимальным промотором для кординациии транскрипции в эндогенном сщтеуче. 3' и интронный энхансеры активны как в плодных, так и взрослых скелетномышечных клетках и содержат ДНК-связываюещие сайты для миогенных регуляторов MyoD и MEF2 семейств, общие регуляторным элементам, котролирующим экспресссию группыгенов, специфичных для скелетных мышц. Элементы как 3' энхансера, так и MLC3F промотора, по-видимому, управляют паттернами экспреассии MLC1F и 3F трансгенов, специфичными для субтипов быстрых волкон. Несвязанная транскрипция MLC1F и 3F промоторов в разных популяциях миогенных клеток во время развития контролируется дифференциальной активностью 3' и интронного энхансера в эмбрионаьных мышцах. Активация MLC3F транскрипции в кардиальных исчерченных мышцах зависит от цис-действующих последовательностей внутри промоторной области. Другой, еще неидентифицированный цис-действующий элемент отвечает за пространственный и временной контроль активности MLC3F промотора в сердце. Дополнительные регуляторные элементы в MLC1F промоторе активируются в транскрипционной среде, специфичной для индивидуальных мышц или групп мышц. Во взрослых скелетных мышцах трансгены, содержащие оба энхансера экспрессируются на порядо величин выше, чем трансгены с однм энхансером. Следовательно, эти элементы взаимодействуют синергично. Обсуждается функция этих регуляторных модулей.

MLC1F и MLC1A (1emb) являются превалирующими изоформами эмбриональных скелетных мышц. Активация транскрипции MLC3F выявляется с Е13 у мышей. Транскрипция MLC1F возрастает вдвое между Е14.5 и Е18.5, а транскрипция MLC3F увеличивается в 14 раз в тот же период. Это скорее усиление, чем активирование, так как низкий уровень транскрипции MLC3F выявляется в скелетных мышцах и до Е13. Во время развития сердца экспресссия MLC3F ограничивается предсердиями на ст Е13.5 в результате подавления его активности сначала в правом, потом левом желудочке.

Невзаимосвязанная активность MLC1F и 3F промоторов гена легкой цепи щелочного миозина 1F/3F вместе со сложным паттерном транскрипции в развивающихся скелетных и сердечных мышцах позволили выявить ряд цис-действующих модулей, управляющих паттерном экспрессии двух промоторов.

Эти цис-действующие регуляторные модули, включая и MLC1F и 3F промоторные области и два скелетно-мышечных энхансера, контролируют тканеспецифичность, клеточную специфичность и специфичность типа волокон, а также пространственно-веременную регуляцию экспрессии гена, включая позиционную информацию.

Эмбриональный и плодный миогенез

Помимо MLC3F и ряд других склетномышечных генов селектинво усиливается или активируется во время плoдного миогенеза, включая МСК, perinatal МНС и β-enolase. Эти транскрипционные изменения совпадают с началом вторичного миогенеза и иннервацией. Эмбиональные и плодные миобласты отличаются разными миогенными программами

Так как актинвость MLC1F/3F 3' энхансера усиливается при избыточной экспрессии Ski, то этот энхансер может играть дополнительную роль во время плодного миогенеза, альтернативно Ski может активировать также и второй интронный энхансер. В этом втором энхансере имеется MEF2 сайт, сходный с таковым в МСК, который имеет сходный паттерн активации. Дополнительный MEF2 сайт обнаружен и 3' энхансере и MLC3F промоторе. Репрессорная молекула с цинковыми пальчиками, BERF1, экспрессируется в эмбриональных, но не в плодных скелетных мышцах, связываясь с G-богатым боксом энхансера в первом интроне гена β-enolase и может отвечать за репрессию транскрипции β-enolase до наступления плодного периода. Такого П-богатого бокса не выявлено в интронном энхансере гена MLC1/3F, что позволяет предположить, что этот элемент скорее активируется во время плодного миогенеза, чем репрессируется во время эмбрионального миогенеза.

В начале плодного периода возникают нервно-мышечные контакты. Было показано, что иннервация необходима для накопления MLC3F белка и не нужна для накопления MLC1F. Предполагается, что нервы высвобождают трофический фактор, необходимый для активации MLC3F. Тем не менее интронный энхансер MLC1F/3F активируется своевременно в мышцах задних конечностей, лишенных иннервации из-за peroneal muscular atrophy. Очевидно спонтанные сокращения в этом случае достаточны для активации интронного энхансера.

Рострокаудальный градиент активности трансгена

Трансген крысы MLC1F-CAT 3' энхансер обнаруживает рострокаудальный градиент экспресссии. У взрослых мышей экспресссия увеличивается более чем в 100 раз от ростральных к каудальнм мышцам, это касается и мышц со сходным типом волокон, таких как межреберные мышцы. Такая экспрессия регулируется 1.6 т.п.н. MLC1F промотора крысы и 900 п.н. 3э энхансера. Рострокаудальный градиент возникает во время развития и обнаруживается в миотомных мышцах со ст. Е10.5. Однако эндогенная экспрессия MLC1F и 3F не обнаруживает градиента транскриптов или белка. Следовательно, регуляторные элемнты, отвечающие за градент в норме молчат в эндогенном локусе и раскрываются в трансгене. Обнаружение этого градиента - первое молекулярное доказательство, что мышцы отличаются в отношении своей позиции вдоль ростро-каудальной оси, что согласуется с данными по селективной иннервации скелетных мышц нервами того же самого ростро-каудального уровня.

Получены данные, указывающие на то, что Нох сайты сами по себе не управляют ростро-каудальным градиентом активности трансгена, но они модулируют транскрипцию во взрослых скелетных мышцах и этот эффект м.б. позитивным или негативным в засимимости от клеточного содержимого.

Градиент оказался связанным со степенью метилирования CpG промотора и 3' энхансера, так что ростральные мышцы, в котороых репрессируется экспрессия трансгена, сильнол метилированы. Статус метилирования устанавливается до активаци трансгена. Следовательно, состояние метилирования в первую очередьотражает аксиальное положение мышечных клеток. Это указывает на то, что во время развития метилирование может участвовать в поддержании скорее, чем в создании градированной активности. В противоположность этому профилю деметилирования промотора MLC1F и 3' энхансера, специфичного для скелетных мышц, промотор MLC3F деметилирован посеместно. Однако роль деметилирования как прямого эффектора транскрипционной активности этого локуса остается пока невыясненной.

Подтверждается роль 3' энхансера в установлении ростро-каудального градиента трансгенной активности. Мутация BMW Е-бокса, соседнего с гомеобокс-связывающим сайтом в 3э энхансере вызывает исчезновение ростро-каудального градиента метилирования как в 3' энхансере, так и в MLC1F промоторе трансгенных мышей. Это строго подтьверждает взаимодействие BMW сайта с позиционными сенсорами вдоль ростро-каудальной оси.

Модули и MLC1F/3F ген

Модульная организация цис-действующих элементов является общим свойством онтогенетичеси регулируемых генов. Эти модули обычно содержат сайты связывания для небольшого числа транскрипционных факторов, и хотя они функционально независимы в трансгенных исследованиях, отдельные модули взаимодействуют с другими модулями и проксимальным промотором для кординациии транскрипции в эндогенном сщтеуче.

3' и интронный энхансеры активны как в плодных, так и взрослых скелетномышечных клетках и содержат ДНК-связываюещие сайты для миогенных регуляторов MyoD и MEF2 семейств, общие регуляторным элементам, котролирующим экспресссию группыгенов, специфичных для скелетных мышц. Элементы как 3' энхансера, так и MLC3F промотора, по-видимому, управляют паттернами экспреассии MLC1F и 3F трансгенов, специфичными для субтипов быстрых волкон. Несвязанная транскрипция MLC1F и 3F промоторов в разных популяциях миогенных клеток во время развития контролируется дифференциальной активностью 3' и интронного энхансера в эмбрионаьных мышцах. Активация MLC3F транскрипции в кардиальных исчерченных мышцах зависит от цис-действующих последовательностей внутри промоторной области. Другой, еще неидентифицированный цис-действующий элемент отвечает за пространственный и временной контроль активности MLC3F промотора в сердце. Дополнительные регуляторные элементы в MLC1F промоторе активируются в транскрипционной среде, специфичной для индивидуальных мышц или групп мышц.

Во взрослых скелетных мышцах трансгены, содержащие оба энхансера экспрессируются на порядо величин выше, чем трансгены с однм энхансером. Следовательно, эти элементы взаимодействуют синергично.

Обсуждается функция этих регуляторных модулей.

Kelly at al. (2000)

Эмбриональный и плодный миогенез

Рострокаудальный градиент активности трансгена

Модули и MLC1F/3F ген