HIF-1α белок стабилизируется в условиях гипоксии. Он димеризуется с Arnt и связывает hypoxia response elements (HREs; с ACGTG стержневой последовательностью) в генах-мишенях. Доказано [11•],что HIF-1α обеспечивает физиологическую реакцию как на гипогликемию, так и гипоксию путем активрования генов, кодирующих гликолитические энзимы, EPO (erythropoietin), и VEGF (vascular endothelial growth factor) [11•]. 

   Мыши, нокаутные по HIF-1α [20••] [21••] [22••] и Arnt [23] [24] обнаруживают сходные, но неидентичные дефекты развития. HIF-1α нулевые мутанты являются эмбриональными леталями. На 9-й день эмбриогенеза (E9), отмечается снижение васкуляризации, особенно в желточном мешке и цефалической области. Образование кровеносных сосудов инициируется, но позднее обычно обнаруживаемые плотные сосудистые структуры замещаются большой мало разветвленной васкулатурой (vasculature), Это указывает на то, что дефекты являются ангиогенными. Раннее эмбриональное развитие млекопитающих происходит при пониженных уровнях кислорода. Дефекты развития у  HIF-1α мутантов согласуются с неспособностью эмбрионов создавать кровеносную сеть в ответ на гипоксию.

   Так как HIF-1α образует гетеродимеры с  Arnt, то не является неожиданностью, что мутанты  Arnt являются эмбриональными леталями и обнаруживают дефекты в структуре сосудов[23] [24]. Аномалии обнаруживаются в васкуляризации плаценты, желточного мешка и бранхиальных дуг, а также в формировании нервной трубки. Два  Arnt мутанта [23] [24] отличались по дефектам в желточном мешка, по-видимому. из-за различий в генетическом фоне. Дефекты Arnt перекрываются с дефектами HIF-1α  (напр., васкуляризация желточного мешка), но в целом они менее тяжелые. В частности, массивная гибель клеток цефалической мезенхимы происходит на ст. E10 [21••] [25•] и обусловливает неспособность нервной трубки к закрытию у HIF-1α мутантов, но не у  Arnt. Другой фенотип, обнаруживаемый только у HIF-1α мутантных мышей, это миокардиальная гипертрофия. Очевидно, Arnt2 и/илиr Bmal1 компенсируют дефекты  Arnt в этих сайтах. Однако, мыши, несущие делецию Arnt2 доживают до рождения [26•] и имеют лишь дефекты. 

   Ключевым признаком как  HIF-1α так и Arnt мутантов является то, что они нарушают ангиогенез. Это же налюдается у  VEGF мутантов, которые дефектны как по васкулогенезу, так ангиогенезу [27] [28]. Показано. что HIF-1α:Arnt регулируют экспрессию VEGF [20••] [21••] [22••] [23]. Соответсвенно, Arnt мутантные мыши обнаруживают снижение экспрессии VEGF в желточном мешке и других местах эмбриона [23]. Кроме того цефалические сосудистые дефекты обнаруживаются как у HIF-1α так и у VEGF мутантных мышей. Неожиданно, HIF-1α мутантные эмбрионы экспрессировали более высокие уровни VEGF мРНК, чем эмбрионы дикого типа  [25•]. Как HIF-1α и VEGF мутантные мыщи имеют почти идентичные сосудистые дефекты? Одна из возможностей в том, что гибель цефалических клеток  вызывает уменьшение мезенхимных поддерживающих клеток (pericytes), которые необходимы и для поддержания эндотелиальных клеток, что ведет к регрессии сосудов.  Другая возможность в том, что эндотелиальные клетки мутантов HIF-1α неспособны обеспечиватьклеточную реакцию на гипоксию, даже когда имеется избыточная продукция VEGF. В этой модели регрессия сосудов происходит из-за клеточно-автономной функции HIF-1α.

   Экспрессия EPAS1, второго HIF, указывает на то, что он преимущественно экспрессируется в эндотелиальных клетках  [14], подтверждая, что играет иную роль в регуляции гипоксии нежели HIF-1α. Анализ EPAS1 мутантных эмбрионов [29••] показал, что хотя они морфологически нормальны (включая и сосудистую систему) они не живут далее E15.5, после этой стадии гибнут и  HIF-1α мутантные эмбрионы. Предполагается, что гибель EPAS1 мутантных эмбрионов происходит в результате физиологических, чем морфологических нарушений. Помимо эндотелиальных клеток  EPAS1 экспрессируется в органе  organ of Zuckerkandl (OZ), который расположен вблизи почек и тестисов . OZ является эмбриональным сайтом регулируемого кислородом высвобождения катехоламинов. Катехоламины контролируют скорость сердечных сокращений. Показано, что у EPAS1 мутантов снижена скорость сердечных сокращений и редуцирован норадреналин, наиболее известный катехоламин у плодов. Гибель EPAS1 мутантных мышей м.б. устранена введением D,L-threo-3,4-dihydroxyphenylserine, субстрата для норадреналина. Гены-мишени для  EPAS1 не идентифицированы, кандидатами являются гены, кодирующие биосинтез катехоламинов  и белки, связанные с высвобождением или потреблением катехоламинов.  OZ дегенерирует во время эмбриогенеза и каротидные тела, по-видимому, контролируют постнатальный респираторный и кардиоваскулярный output посредством уровней O₂ и синтеза и высвобождения катехоламинов. EPAS1 экспрессируется в каротидных телах, указывая на их роль в котроле O₂ во время эмбриогенеза и у взрослых.

Т.о., HIF-1α участвует в ангиогенезе и в выживаемости клеток, а  EPAS1 регулирует уровни катехоламинов во время развития. Различия в фенотипе и функции указывают на раздельность путей адаптации к гипоксии во время эмбриогенеза: HIF-1α действует на 'local' клеточном уровне, а EPAS1 действует на 'systemic' уровне. Другим важным вопросом является, как HIFs чувствуют и реагируют на варьирующие уровни O₂ и все ли HIFs используют одни и те же sensing пути.

Белки bHLH–PAS млекопитающих контролируют развитие и физиологию  кислородного гомеостаза. А как у беспозвоночных? Насекомые довольно резистентны к гипоксии, но обладают способностью отвечать физиологически [30], онтогенетически [31],и транскрипционно [32]. у Drosophila Trachealess bHLH–PAS белок [33] [34] образует гетеродимер с Tango, ортологом Drosophila Arnt  [35] [36•] [37], чтобы управлять развитием трахей, респираторного органа насекомых. Нет доказательств, что Trachaeless:Tango реагируют на разные уровни O₂. Известно, что терминальное ветвление трахей регулируется оксигенацией клеток [12] [31]. Предполагается, что низкий уровень O₂ в клетках запускает активацию HIF bHLH–PAS белка, что служит сигналом трахеолам к дальнейшему ветвлению и высвобождению дополнительного O₂ [12]. Подтверждений не получено, однако выявлена индуцируемая гипоксией HRE-связывающая активность в тканевой культуре клеток у Drosophila  [38], а Drosophila Similar bHLH–PAS белка [39], который димеризуется с Tango [35], и обладает O₂-регулируемым доменом, обнаруживаемом в  HIFs млекопитающих [40•].

Murine Sim1 and Drosophila sim: homologs with similar functions in controlling development of neuronal cell lineages

Ген Drosophila single-minded (sim) контролирует транскрипцию и развитие клеток средней линии в ЦНС  [1•]. Sim образует гетеродимеры с Tango, и этот комплекс связывает энхансерные элементы средней линии (ACGTG стержневые последовательности), которые находятся в генах-мишенях [35]. Млекопитающие имеют два sim гена — Sim1 и Sim2 [41].  Sim1 контролирует развитие специфических типов клеток в ЦНС .

   Sim1 экспресируется в клетках предшественниках  paraventricular nucleus (PVN),  anterior periventricular nucleus (aPV), и supraoptic nucleus (SON) гипоталямуса мышей [42] [43••] (Fig. 2). У Sim1 нулевых мутантов мыши PVN, aPV, и SON клетки не достигают терминальной дифференцировки и не экспрессируют нейропептиды  TRH (thyrotropin-releasing hormone), SS (somatostatin), CRH (corticotropin-releasing hormone), VP (vasopressin), и OT (oxytocin), которые характеризуют, по крайней мере, 5 типов клеток в PVN/SON. Так как соотвествующая  PVN/SON область содержит мало клеток у новорожденных мутантных мышей, то предполагается, что эти клетки погибают. PVN/SON участвует в обеспечении трофическим фактором(ми) pituicytes, расположенных в задней доле гипофиза. Соответственно, число pituicytes у Sim1 мутантов снижено, тогда как передняя доля гипофиза развивается нормально. Отсутствие функции PVN/SON задней доли гипофиза ведет к перинатальной гибели Sim1 мутантов. Интересно, что нейроны средней линии в головном мозге насекомых, образование которых управляется   sim, содержят ряд нейросекреторных и нейропептиды-продуцирующих клеток, включая  CRH-подобные diuretic пептиды [44].

Figure 2 Sim1 экспрессия и функция вдоль hypothalamus–pituitary оси. Sim1 экспрессируется в  PNV, APV, и SON гипоталямуса  (выделено слева серым). Соответствующая правая сторона показывает 5 основных типа клеток, секретирующих нейропептиды , CRH, TRH, SS, OT, and VP, расположенные в трех ядрах. OT и VP нейроны проецируются (стрелка) в posterior (P) долю гипофиза. у Sim1 мутантных мышей все 5 типов клеток неспособны к терминальной дифференцировке. Кроме того задняя доля гипофиза уменьшена в размере из-за отсутствия SON/PVN, которые, по-видимому, секретируют трофические факторы, необходимые для роста задней доли гипофиза. A, anterior pituitary.

Фенотип, описанный для Sim1 мутантных мышей, сходен с таковым  у Brain-2,  POU доменовым транскрипционным фактором, при котором также отсутствуют CRH, OT, и VP нейроны в PVN/SON и снижено количество pituicytes. Так как экспрессия Brain-2 в проспективных PVN/SON отсутствует у Sim1 мутантов, то Sim1 скорее всего использует Brain-2 для выражения своей функции при спецификации CRH, OT и VP нейронов. У Drosophila  ген Drifter  [45] является гомологом Brain-2 и функционирует как подчиненный sim в развитии клеток средней линии ЦНС.

   Хотя генетически Sim1 действует как вышестоящий по отношению к Brain-2 в спецификации  CRH/VP/OT нейронов, не обнаружено прямого вовлечения в регуляцию транскрипции CRH/VP/OT. Наблюдали [46],что  Clock:Bmal1 гетеродимеры активируют  VP промотор в SCN , открывает возможность, что Sim1 вместе с Arnt или Arnt2 может прямо регулировать экспрессию VP, и возможно OT, CRH, TRH, или SS в PVN/SON как во время развития, так и после рождения. Остается интигующая возможность, что Sim1 обеспечивает гомеостатический потенциал гипоталямусу с помощью ответов на физиологический статус организма  (вообще с помощью связывания непосредственно эффекторных молекул), и контроли рует стрессы с помощью регуляции  экспрессии гормональных генов. Хотя у Drosophila sim функция необходима для экспресси Drifter, Sim также скорее всего функционирует позднее, контролируя midline glial transcription в комбинации с Drifter и другими факторами транскрипции [47] [48•].

Однако у млекопитающих ни Sim1ни Sim2 не экспрессируются в донной пластинке, аналоге средней линии. Sim1 экспрессируется в V3 нейронах соседних к донной пластинке (ближайших!) [42] [49•]. Средняя линия в ЦНС насекомых не только служит водоразделом, она состоит из функциональных нейронов и специализированных глиальных клеток. Напротив у позвоночных донная пластинка не содержит нейронов, но представлена специализированным типом клеток. Очевидно множественные функции клеток средней линии у насекомых подразделены в ЦНС позвоночных и переданы более специализированным клеткам и что Sim1 функционирует только в  V3 субнаборе, а не в донной пластинке. Интересно, что экспрессия  Sim1 в V3 клетках отсутствует у Nkx2.2 мутантных мышей [49•]. Эти мутанты обусловливают трансформацию V3 клеток в более дорсальные, с судьбой мотонейронов. Nkx2.2 является гомологом Drosophila ventral nervous system defective (vnd) гена, который контролирует развитие вентральной ЦНС, но репрессирован в клетках средней линии ЦНС с помощью sim [50] [51]. Хотя Nkx2.2 и vnd и законсервированы как паттернирующие вентральную нервную ткань, их регуляторная иерархия  и способ регуляции в отношении Sim1 и sim, по-видимому, ревертированы у двух организмов.

Spineless and Ahr: homologs with different functions in vertebrates and insects

Ahr и Arnt образуют гетеродимерные DNA-связывающие комплексы, которые контролируют физиологическую реакцию на метаболизм токсина [52]. Они высоко законсервированы у позвоночных и широко экспрессируются. Ahr действует как цитоплазматический рецептор aryl hydrocarbons (напр., диоксина). После связывания лиганда  Ahr транслоцируется в ядро и образует ДНК-связывающий активационный комплекс с Arnt (Fig. 3a). Физиологическая реакция на aryl hydrocarbons не обнаруживается у насекомых и др. беспозвоночных [53]. Тем не менее хорошо законсервированные Ahr и Arnt гены обнаружены у  Drosophila [54•] и Caenorhabditis elegans [55•].

Figure 3 Разные способы функционирования Ahr/Spineless  (a) У позвоночных Ahr действует как цитоплазматический рецептор, который связывает  aryl hydrocarbons и управляет транскрипцией генов, которые кодируют hydrocarbon-metabolizing энзимы. (i) Первоначально, он поддерживается в чувствительном к лиганду состоянии в виде комплекса с  Hsp90 и Ahr-interacting protein (AIP). (ii) После связывания  hydrocarbon лиганда (H), Ahr отделяется от AIP и Hsp90, транслоцируется в ядро (N), и димеризуется с  Arnt. (iii) Комплекс Arh:Arnt связывается с  xenobiotic response element (XRE) генов-мишеней. (b) Ген Drosophila spineless (ss) является онтогенетическим регулятором, который ведет себя иначе. чем Ahr у позвоночных. (i) В отсутствие bHLH–PAS белка-партнера, Tango (Tgo) он находится в цитоплазме  (C). (ii) Когда ген ss активирован (напр., в дистальных частях антенн) синтезируются  ss мРНК и Ss белок. В цитоплазме белки  Ss и  Tgo димеризуются. (iii) Белковый комплекс Ss: Tgo вступает в ядро и связывается с XRE последовательностями генов-мишеней .

Гомолог Ahr у Drosophila ген spineless  [54•]. Нулевые мутанты spineless жизнеспособны и обнаруживают ряд фенотипов. Тарзусы ног делетированы, а сенсорные щетинки редуцированы в размерах. При наиболее выраженном мутанном феноипе наблюдается трансформация  арист в тарзусы. spineless специфически экспрессируется в предшественниках антенн, сенсорных клетках и тарзусах. Spineless образует ДНК-связывающий гетеродимерный комплекс с Tango (Fig. 3b) [56•]. Локализованный в цитоплазме многих клеток Tango накапливается в ядрах всех эмбриональных сайтов с эктопической экспрессией spineless, следовательно, Spineless и Tango fобразуют гетеродимерные комплексы in vivo. Это говорит против того, что Spineless действует как цитоплазматический рецептор для диффузного лиганда, который котролирует его перенос в ядро. Предполагается. что функция  spineless прямо ассоциирует с его экспрессией, а повсеместно экспрессируемый лиганд не является регуляторным.

   Во всех аспектах функция Spineless сходна с  Sim и Trachealess белками, регулирующими развитие и также взаимодействующими с Tango [36•]. 

   Drosophila spineless играет роль в развити, его участие в метаболизме токсинов неизвестно. Превичной функцией Ahr у позвоночных является физиологическая роль, хотя у Ahr нокаутных мышей обнаруживаются некоторые дефекты развития в печени [57] [58]. Предполагается, что исходный Ahr/spineless участвовал в хемосенсации (chemosensation) [56•]. У позвоночных белок Ahr принял роль сенсора токсинов, а у артропод  Ss - роль контроля развития антенн, хемосенсорного органа.  

Conclusions and perspectives

Изучение bHLH–PAS необходимо, чтобы установить степень участия этих белков в опосредовании средовых влияний на развитие и физиологию. необходимо знать полный спектр функций генов bHLH–PAS. Разные bHLH–PAS белки часто связываются с одними и теми же ДНК элементами это делает воззможной перекрестную регуляцию  и интеграцию множественных средовых и клеточных сигналов. Важно идентифицировать cis и trans-действующие факторы, которые диктуют транскрипционную специфичность и перекрестную регуляцию bHLH–PAS белков. 

Despite the striking similarities between invertebrate and vertebrate bHLH–PAS proteins, there are some interesting differences. Vertebrate Ahr is a receptor and requires ligand binding to function appropriately, whereas the Drosophlia developmental regulatory proteins, Sim, Trachealess, and Spineless, function in a ligand-independent mode.  It will be interesting to determine whether vertebrate developmental bHLH–PAS proteins, such as Sim1 and Sim2, require a ligand for proper function. Another distinction is that Drosophila Arnt/Tango is cytoplasmic in the absence of bHLH–PAS partner proteins, whereas vertebrate Arnt is predominantly nuclear.   Structural knowledge of the ligand-binding and interaction properties of the PAS domain now permits novel approaches for designing ligand-responsive proteins.