Биохимический анализ показал, что повсеместно экспрессирующиеся Pc-G белки как млекопитающих, так и мух формируют большие (~2–5 Md) комплексы [9] [10] [11]. Когда Такие комплексы искусственно targeted с помощью промотор-репортерных конструкций, то наблюдали существенную репрессию — как эписомно расположенных, так и и интегрированных в хромосомы репортерных генов [11] [12] [13] [14]. Это может указывать на неспецифичность функции репрессии , in vivo Pc-G комплексов. Это хорошо иллюстрируется слабыми изменениями паттерна генной экспрессиии специфических Hox генов в ответ на изменения дозы одиночных Pc-G генов у мыши [15] [16] [17]. Как достигается такая специфичность и как Pc-G комплексы взаимодействуют со своими генами-мишенями? Выявлено существование двух отличных Pc-G белковых комплексов в клетках как у Drosophila так и млекопитающих [18] [19] [20]. Фенотипический анализ мутантов Drosophila и мыши указывает на разные функции этих разных комплексов. Комплекс состоящий из Extra sex combs (Esc) и Enhancer of zeste (E[z]) белков необходим на стадии инициации, когда Pc-G репрессия необходима для освобождения от рано действующих репрессоров, таких как Hunchback (Hb). Второй комплекс, содержащий большинство Pc-G белков, таких как Pc, Psc, Ph, постоянно необходим для стабильного поддержания инициированной Pc-G репрессии специфических генов-мишеней([21]; see Table 1 for an overview of gene names). Автор обозначает эти комплексы как Pc-Gi (инициирующий) и Pc-Gm (поддерживающий). Мышиный гомолог Esc, названный Eed (embryonic ectoderm development), идентифицирован с помощью позиционного клонирования в середине гаструляции у летальных мутантов [22]. Этот тяжелый фенотип хорошо согласуется с ранней инициирующей ролью и контрастирует с менее выраженными фентипически отличными дефектами, обнаруживаемчми у мышей, дефицитных по генам Pc-Gm [15] [16] [17].

Table 1. Обзор Pc-G и trx-G генов^*.

Drosophila gene	Mammalian homologue
Pc-G initiating (Pc-Gi) dMi-2	Mi-2
Centrosomal and chromosomal factor (ccf)?
Enhancer of zeste (E[z])	EZH2,Enx1/EZH1,Enx2/
Extra sex combs (esc)	Eed, hEED
Pc-G maintenance (Pc-Gm) Polycomb (Pc)	M33, HPc
	HPc2, MPc2
Posterior sex combs (psc)	bmi-1, BMI-1
	Mel-18, MEL-18
Polyhomeotic (ph)	HPH1, Mph1/rae28
	HPH2, Mph2
^†dRING?	Ring/Ring 1a, RING1
	Ding/Ring 1b, RING2
Pleiohomeotic (pho)?	hYY-1, mYY-1
trx-G
trithorax (trx)	MII IALL-1/HRX
	ALR
brahma (brm)	hbrm/mbrm
	BRG1/mBrg1
(snr1)	hSNF5,INI1

^* Больше информации по этим генам содержится в обзорах [15] [16] [17] [26]. Знак вопроса указывает недавние добавления, базирующиеся на наблюдении за генетическими взаимодействиями. У млекопитающих, Pc-Gm (и возможно trx-G гены) удвоены и представлены в виде очень сходных пар (показаны на соседних линиях, напр. RING1 и RING2). ^†Частичные dRING последовательности выявлены недавно кДНК базе данных Drosophila[71].

Важным новым добавлением является идентификация dMi-2 как Hb-взаимодействующего белка [23••]. Генетически dMi-2 мутанты ведут себя очень похоже с E(z) мутантами, указывая тем самым, что действуют в Pc-Gi комплексе. Mi-2 позвоночных очищен как субъединица гистон деацетилазного комплекса, который может действовать на нуклеосомы, деацетилируя гистоновые H3 и H4 amino-terminal хвосты. Это первый комплекс, обладающий как деацетилирующей активностью, так и АТФ-зависимой нуклеосомы ремодулирующей активностью [24•] [25•]. Так как деацетилирование специфических лизинов на N-терминальных концах гистонов H3 и H4 создает репрессивную нуклеосома/хроматин конфигурацию, то это подтверждает механизм, с помощью которого Pc-G комплексы могут действовать, репрессируя транскрипцию [5]. Mi-2 белковые комплексы не содержат других Pc-Gi белков, указывая, что Pc-G взаимодействия могут быть более преходящими по природе, в соответствии с ферментативной модификацией хроматина, потребность в которой временная. Сходным образом, не выявлено стабильно ассоциированной гистон деацетилазной активности для комплексов Pc-Gi или Pc-Gm у мышей. Все это подтверждает спекулятивную модель осуществления Pc-G репрессии (see Fig. 1). Ранние ген-специфические репрессоры, такие как Hb, временно рекрутируют Mi-2 деацетилазный комплекс, совместно с другими белками Pc-Gi для локальной модификации нуклеосом. Прецендентом такого вовлечения является функциональная ассоциация различных гистон деацетилаз с сиквенс-специфическими ДНК связывающими репрессорами (reviewed in [3] [5]). Модифицированный хроматин затем распознается Pc-Gm комплексами еще неизвестным способом для стабильного поддержания репрессивного 'imprint'.

Рис. 1 Гипотеза о (a,b) Pc-G репрессии и (c,d) trx-G активации. Гены-мишени (такие как Hox гены) могт или быть репрессированы (a) или активированы (b) ранними сиквенс-специфическими ДНК связывающими факторами такими как Hunchback (Hb) и Fushi tarazu (Ftz). Это ведет к вовлечению или dMi-2/гистон деацетилазы (HDAC) и Pc-Gi белковых комплексов к репрессируемым промотор/PRE или в случае активного промотора к Polymerase II holoenzyme (POL II holo) и ассоциированных хромати ремодулирующих комплексов, таких как SWI/SNF and GAGA/NURF. (b) Локальное деацетилирование гистонов вместе с Pc-Gi белками, по-видимому, индуцируют изменения в конформации хроматина, что позволяет Pc-Gm комплексам связываться и стабильно поддерживать репрессию. (c) Напротив, POL II holo энзим м хроматин ремодулирующие комплексы обеспечивают изменения структуры хроматины, вместе с сиквенс-специфическими ДНК связывающими trx-G белками (такими как trx и GAGA) и вообще рекрутируют гистоновые ацетилазы (HAT) для стабилизации индукции (d) гиперацетилированная 'active' PRE. По-видимому, другая, чем у мух и все еще плохо изученная, инициация экспрессии Нох генов у млекопитающих может сопровождаться ранней фазой открытия хроматина ('chromatin-opening' phase) [72]. Это должно обеспечиваться сходными законсервированными и у млекопитающих trx-G белковыми комплексами и ремодулирующими факторами. Сходным образом, Pc-Gi белки и Mi-2/HDAC комплексы могут обеспечивать раннее 'repressed' состояниеHox кластеров, которое поддерживается затем с помощью законсервированных Pc-Gm комплексов млекопитающих тех генов, которые не были активированы. Подобно Hox кластерам генов у млекопитающих также и Pc-Gm гены дуплицируются в ходе эволюции, существенно увеличивая число потенциально возможных комплексов Pc-Gm в соответствии с увеличением числа генов-мишеней [16]. (PRE, Polycomb-responsive element; TATA, TATA box; TBP, TATA-binding protein).

Figure 1 A speculative view of (a,b) Pc-G repression and (c,d) trx-G activation. Target genes (such as Hox genes) can be either repressed (a) or activated (b) by early sequence-specific DNA binding factors such as Hunchback (Hb) and Fushi tarazu (Ftz). This leads to recruitment of either dMi-2/histone deacetylase (HDAC) and Pc-Gi protein complexes to the repressed promoter/PRE or in case of an active promoter, to recruitment of Polymerase II holoenzyme (POL II holo) and associated chromatin remodeling complexes, such as SWI/SNF and GAGA/NURF. (b) Local histone deacetylation together with Pc-Gi proteins is proposed to induce a change in chromatin conformation, allowing Pc-Gm complexes to bind, to stably maintain repression. (c) Vice versa, POL II holo enzyme and chromatin remodeling complexes mediate a change in chromatin structure, assisted by sequence specific DNA binding trx-G proteins (such as trx and GAGA) and perhaps by recruiting histone acetylases (HAT) to stably induce (d) a hyperacetylated 'active' PRE. Although probably different than in flies and still poorly understood, initiation of Hox gene expression in mammals may be accompanied by an early 'chromatin-opening' phase [72]. This could be mediated similarly through conserved mammalian trx-G protein complexes and remodeling factors. Likewise, Pc-Gi proteins and Mi-2/HDAC complexes may be mediating the early 'repressed' state of Hox clusters, which is maintained by conserved mammalian Pc-Gm complexes on those genes that do not get activated. Of interest is that next to the Hox gene clusters also the mammalian Pc-Gm genes have been duplicated in evolution, leading to much greater potential of possible Pc-Gm complexes, in accordance with increased numbers of target genes [16]. (PRE, Polycomb-responsive element; TATA, TATA box; TBP, TATA-binding protein).

Эта модель может объяснить другое: Pc-G комплексы у Drosophila нуждаются в специфических ДНК элементах (Polycomb-response elements [PREs]) для обеспечения репрессии, факторов, которые детерминируют/способствуют взаимодействию с PREs и которые все еще неизвестны [21] [26]. Идентификация Drosophila pleiohomeotic Pc-G гена как сиквенс-специфического ДНК связывающего белка со значительной гомологией с транскрипционным фактором YY-1 является первым примером [27•]. Изучение некоторых PRE-последовательностей выявило общий мотив, который напоминает YY-1 consensus сайт [28]. Одако этот мотив недостаточен для обеспечения полной репрессивной активности с помощью PRE, следовательно, участвуют дополнительные последовательности/факторы [27•] [28]. Все вместе это указывает на то, что Pc-Gm комплексы могут быть необходимы как для YY-1 сайта, так и для специфически окружающих деацетилированные гистоновые 'imprints', чтобы связываться эффективно(Fig. 1). Интересно, что Pc-G и trx-G комплексы действуют в тесной близи на PREs, исключая простую модель Днк-конкуренции за противоположные активности [29] [30••]. Более того, некоторые trx-G белки, такие как GAGA могут обнаруживаться на репрессированных PREs,указывая, что 'activating' ремодулирующая роль trx-G обязательно регулируется через ассоциацию с дополнительными факторами, такими как SWI/SNF ([31]; and see below). Итак, гипоацетилирование репрессирует PREs , а гиперацетилирование дерепрессирует PREs.

Важные уроки следуют иззаметной стабильности или активного или репрессированного состояния, индуцированных посредством PREs в генах-мишениях у Drosophila [30••]. Наследование ген-транскрипционных паттернов наблюдается не только в последовательных митозах, но даже передаются частично через мейоз в течение нескольких поколений [30••]. Если это стабильное эпигенетическое наследование происходит и у млекопитающих, то это скорее всего будет обнаруживаться в изменениях экспрессии генов при заболеваниях, напоминая хорошо задокументированные эффекты CpG метилирования/импринтинга при болезнях [32] [33].

Pc-G deregulation and disease: connection to cell-cycle regulation and beyond

Как уже упоминалось выше потеря Pc-Gi Eed функции ведет к ранней эмбриональной гибели в четырех случаях Pc-Gm нокаута (reviewed in [16] [17]). Тяжесть Pc-Gi потери функции, по-видимому, связана с их инициирующей функцией, но тот факт, что Mi-2/гистон деацетилаза могут быть вовлечены указывает на то, что могут проявиться многие плейотропные эффекты: похоже, что такие энзиматические 'modules' могт быть использованы в репрессии, не связанной с Pc-G.

Отметим, что Pc-Gi белки могут также выполнять и структурную роль в регуляции конденсации и сеграции хромосом во время митозов [34] [35]. Эта специальная роль может указывать на общую функцию их с гетерохроматин-ассоциированными белками, которые влияют на мозаичный эффект положения (position effect variegation (PEV)) [8] [36]. PEV представляет собой другую более indiscriminate форму эпигенетического молчания, при которой гетерохроматин распространяет ('spreads') свое влияние на соседние области хромосом [8]. PEV четко отличается от Pc-Gm-обусловленной репрессии, при которой не используется гетерохроматин [37] [38], возможно, что Pc-Gi могут выполнять общую роль 'initiator' в обоих процессах. В соответствие с этим Pc-Gi белки, по-видимому, более 'ancient' в эволюционном плане и хорошо законсервированы у растений и Caenorhabditis elegans, где они играют полноценную и важную роль в поддержании репрессированного состояния в зародышевой линии [39] [40] [41]. Взаимодействие с такой более структурной ролью в сегрегации и поддержании хромосом безусловно должно вносить вклад в нестабильность генома, которая потенциально влият на возникновеие болезней таких как рак.

Безусловно мишениями обоих Pc-Gi и Pc-Gm комплексов являются кластеры Hox генов, что было показано in vivo на Eed гипоморфных мутантных мышах и на разных Pc-Gm нокаутных мышах, а также на мышах с избыточной экспрессией bmi-1 Pc-Gm гена (reviewed in [15] [16] [17]). Эти мутантные мыши обычно обнаруживают характерные дефекты склета, а также дефекты пролиферации и выживания гематопоэтических клеток. Это напоминает некоторые дефекты, ассоциированные с дерегуляцией экспрессии гомоеобоксных (Hox) генов у человека с врожденными скелетными аномалиями, такими как синполидактилия и различными формами лейкемии у человека [42] [43] [44] [45]. У человека неизвесты мутации с потерей функции Pc-G генов, которые можно было бы связать с фактом, что Pc-G мутации затрагивают множественные (Hox) гены-мишени, ведущие к гибели. Однако известно, что дергуляция экспрессии Pc-G генов не вносит вклада в заболевания (see below).

Помимо Hox генов, Pc-G комплексы, по-видимому, регулируют множество других генов-мишеней, на это указывает широкий спектр феноипов у мутантных мышей и мух при связывании Pc-Gm комплексов с ~ 100 отдельными сайтами политенных хромосом Drosophila [16] [46]. Биохимический и функциональный анализ общих пролиферативных дефектов в первичных клетках от нокаутных по гену bmi-1 Pc-Gm мышей недавно выясил такую важную мишень. Это локус INK4a, который кодирует опухолевые супрессоры и ингибиторы клеточного цикла p16 и p19Arf, которые обнаруживают избыточную экспрессию в Pc-Gm мутантных клетках [47•]. Напротив, избыточная экспрессия bmi-1 ведет к подавлению p16 и p19Arf, объясняя онкогенный потенциал bmi-1 in vivo, по индукции лимфом у трансгенных мышей [48]. Эта связь интересна, так как p16 и p19Arf действуют как вышестоящие регуляторы ретинобластомна- (Rb) и p53 тумор-репрессирующего путей и являются главными регуляторами переключения иммортализация/старение (immortalization/senescence checkpoint) у грызунов и в первичных клетках у человека(reviewed in [49]). Эта контрольная точка ('checkpoint')считает количество клеточных делений, ведущих к необратимой остановеке роста после определенного числа пассажей и тем самым избавляет клетки от иммортализации. Эти результаты связывают оногенетическое "поддержание" Pc-G факторов с кнтролем клеточной пролиферации и обеспечивает связь между дифференцирокой и выходом из клеточного цикла. Интересно посмотреть могут ли Pc-Gm комплексы являються частью механизма часов 'clock', который считает клеточные деления. Дополнительным подтверждением потенциальной роли в трнсформации является указание на эффекты избыточной экспрессии других генов Pc-Gm таких как RING, в клеточных линиях грызунов [50].

Помимо таких общих дефектов, потеря индивидуальных Pc-Gm также ведет к уникальным фенотипам у мышей — указывающими на дерегуляцию определенных генов-мишеней индивидуальными Pc-G белками. Это дефекты нейрологические, клеток нервного гребня и гладкомышечных клеток [15] [16]. Наиболее драматическим примером могут служить самцы &#rarr;самки с реверсией пола у M33 мутантных мышей, укзывающим на то, что нарушается SRY пол-детерминирующий путь [51]. Trx-G genes and leukemia

Наиболее сильная взаимосвязь с болезнью получена для некоторых trx-G членов, которые обычно противодействуют репрессии с помощью Pc-G. Человечий гомолог Drosophila trx, названный MLL, ALL-1 или HRX (hereafter named MLL), часто повреждается общераспространенной транслокацией 11q23, обусловливающей как острую лимфобластическую, так и острую миэлоидную лейкемию (reviewed in [43] [52]). Выявлено 30 различных слияний хромосом, в большинстве своем дающих гибридные белки [52], указывающие на то, что MLL ген может содержать специальный фрагильный сайт особенно чувствительный к таким перестройкам. Партнеры по слияюнию неродственны, но в некоторых случаях могут влиять на subtype/lineage лейкемии [52] [53]. Интересно слияние MLL сCBP (CREB-binding protein), который действует как 'integrator' большинства сигнальных путей и содержит внутренне присущую активность по ацетилированию гистонов, которая сохраняется в слитых белках [54] [55]. Предпочтительна модель, которая базируется на том, что укороченный в результате транслокации MLL продукт действует доминантно, взаимодействуя с функцией нормального MLL. MLL, подобно trx, способен взаимодействовать непосредственно со специфическими генами-мишенями, с которыми могут взаимодейстовать и гибридные белки. Первым примером таких потенциальных генов-мишеней,как и ожидалось, являются Hox гены [56].

Напротив, общераспространенная делеция С-концевых частей в транслоцированных MLL может удалять критический для белкового взаимодействия мотив, создавая доминантно-негативную функцию trx. Особый интерес в этом отношении представляет С-терминальный законсервированный домен SET, который связывает SNF5 [57•], единицу высоко законсервированного SWI/SNF хроматин ремодулирующего комплекса; это указывает на то, что нормальная функция MLL может быть связана с рекрутированием SWI/SNF с определенными генами-мишенями. Домен SET domain обнаруживается также в некоторых Pc-Gi и PEV-супрессирующих белках, указывая на то, что они могут также взаимодействовать с SWI/SNF комплексами [8] [36]. Идентифицированы MLL-родственные гены, потенциально увеличивающие disease implications [58]. MLL-дефицитные мыши выявляют — и иные кроме скелетных дефекты, обусловленные отсутствием необходимой эксперессии Hox генов — гематопоэтические дефекты, согласующиеся с ожидаемой ролью MLL как гена trx-G [59] [60]. Критические MLL мишени при лейкемии еще не идентифицированы. Показанные выше взаимодействия и связи Pc-Gm сINK4a в регуляции клеточного цикла могут быть важными to assess whether MLL may similarly converge on INK4a.

The SWI/SNF-ремодулирующий комплекс, участвующий в trx-G функционировании, благодаря субъединице SNF2 у Drosophila назван Brahma он был клонирован как trx-G ген [61]. SWI/SNF, был первым идентифицирован у дрожжей как белок, необходимый для эффективной активации транскрипции субнабора генов, следовательно он высоко законсервирован [3] [4] [5] [62]. Субъединица SWI/SNF ISWI также присутствует в трех других хроматин-ремоделирующих комплексах ACF, CHRAC и NURF, что подтвержает взаимодействия с общими партнерами. Кроме того , NURF идентифицирован как комплекс, который может участовать в связывании транскрипционных факторов, таких как GA-repeat binding trx-G белок GAGA, с соединенной с нуклеосомами матрицей ДНК [63]. Все это подтвержадет то, что ДНК связывающие trx-G белки, такие как MLL/trx и GAGA могут вовлекать несколько ремодулирующих комплексов с разыми активностями по отношению к PREs. Очевидно, что они должны действовать в согласии, чтобы поддерживать активную и защищать Pc-G комплексы от сборки в неактивные хроматиновые комплексы. В этом отношении важна ассоцииация SWI/SNF с Polymerase II голоэнзимом [64]. Факт что SWI/SNF/PolII комплексы кроме того вовлекают факторы, подобные CBP, которые обладают гистон ацетилирующей активностью, может быть интересным в отношении способности 'reversing' обусловленного Pc-Gi деацетилирования 'imprint'.

Помимо ассоциации с MLL при лейкемии, гомологи Brahmaмлекопитающих brm и BRG-1 также участвуют в регуляции клеточного цикла. brm и BRG-1 могут связывать 'active' Rb белок, указывая на потенциальную роль в Rb опухоль-супрессирующей активности [65]. Редукция brm экспрессии коррелирует с трансформацией фибробластов грызунов онкогенами ras [66]. Демонстрацией cancer-prone фенотипа с помощью SWI/SNF дерегуляции является идентификация hSNF5 как bona fide опухоль-супрессирующего гена, который часто теряется в высоко злокачественных метастазах rhabdoid опухолей [67•]. Если потеря SNF5 ослабляет функцию SWI/SNF в поддержании генной активности, то это может вести к аберрантной гипер-репрессии генов-мишеней Pc-G белковыми комплексами. Conclusions and perspectives

Важно верифицировать обнаруживается ли столь заметная стабильность транскрипционных состояний, обнаруживаемая у Drosophila, и у млекопитающих, так как это могло бы представлять новую форму эпигенетического 'imprinting' и неменделевского наследования. Интересны в этом отношении эпигенетическое замалчивание (epigenetic silencing) с помощью CpG-метилирования у позвоночных, а также потребность в гистоновых деацетилазах для стабильной репрессии [68•] [69•].

Обнаружение, что имеются отдельные Pc-G комплексы с отдельными функциями и то, что возможна связь с другими механизмами "памяти" , таким как PEV, могут привести к открытию общих принципов наследования. Если исходить из возможности, что histone-(de)acetylation формы критическая часть Pc-G/trx-G импринтинга ([23••]; V Orlando, personal communication) , то неясно как это может быть определено в выборках fixed patient (tumor). Идентификация in vivo соответствующих генов-мишеней, таких как INK4a локус в регуляции клеточного цикла и опухолей, будет критической. Необходимо установление корреляций дерегуляции Pc-G и trx-G генов с развитием и болезнями. Что эта возможность не исчерпана иллюстрирует корреляция паттерна экспрессии Pc-G в гематопоэтическом развитии [70], и корреляция избыточной экспрессии bmi-1 с high-grade osteosarcoma человека(MW Hentz et al., unpublished data).

Модификаторы хроматина