Ferguson, K. M. et al. Structural basis for discrimination of 3-phosphoinositides by pleckstrin homology domains. Mol. Cell 6, 373-384 (2000) | | |
Lietzke, S. E. et al. Structural basis of 3-phosphoinositide recognition by pleckstrin homology domains. Mol. Cell 6, 385-394 (2000) | | |
REVIEWS Lemmon, M. A. & Ferguson, K. M. Signal-dependent membrane targeting by pleckstrin homology (PH) domains. Biochem. J. 350, 1-18 (2000) | | | |
Chan, T. O. et al. AKT/PKB and other D3 phosphoinositide-regulated kinases: kinase activation by phosphoinositide-dependent phosphorylation. Annu. Rev. Biochem. 68, 965-1014 (1999) | | |
Сравнивали структуру pleckstrin homology (PH) домена, который узнает только phosphatidylinositol-phosphate PtdIns(3,4,5)P3 в любое время с доменом, который не м. отличить PtdIns(3,4,5)P3 от PtdIns(3,4)P2.
The PH domains of Grp1 (right) and DAPP1 (left), bound to Ins(1,3,4,5)P 4.
Kathryn Ferguson с сотр. и Susan Lietzke с сотр. выделили PH домен из PtdIns(3,4,5)P3-специфического белка (известного так же как ARNO3 или cytohesin 3) для кристаллографического анализа. Ferguson et al. исследовали также структуру (PHISH), который связывает PtdIns(3,4,5)P3 и PtdIns(3,4)P2 с одинаковым сродством. Lietzke с сотр. сравнили Grp1 PH домен с неразборчивым PH доменом (AKT). Inositol-1,3,4,5-tetrakisphosphate (Ins(1,3,4,5)P4) - водорастворимая головная группа в PtdIns(3,4,5)P3 - использовалась для кристаллизации лиганд-связанных PH доменов.
Не было сюрпризом, что PH домены Grp1 and DAPP1 являются -sandwiches, но Grp1 имеет добавочно две-strands. Эта форма является уютным карманом, воспринимающим 5-phosphate (рис.), который просто отсутсвует в неразличающем PH домене DAPP1 и protein kinase B. Эти различия объясняют, почему Grp1 связывает PtdIns(3,4,5)P3,но не PtdIns(3,4)P2. Все дело в количестве водородных мостиков, необходимых для стабилизации взаимодействия. Ferguson с сотр. установили, что и Grp1 и DAPP1 образуют 14 боковых цепочек водородных мостиков с Ins(1,3,4,5)P4, но у Grp1 они равномерно распределены между 3-, 4- и 5-фосфатами, тогда как у DAPP1 нет водородных мостиков с 5-фосфатом. Итак, Grp1 не м. сформировать достаточного плотного соединения только с 3- и 4-фосфатами.
Теперь возможно учитывать длину и силу реакции различных PH-доменовых белков при поиске лекарств, связывающих специфические PH домены.
Moritoshi Sato, Yoshibumi Ueda, Tokio Takagi and Yoshio Umezawa Production of PtdInsP3 at endomembranes is triggered by receptor endocytosis Nature Cell BiologyAOP (5 October 2003) doi:10.1038/ncb1054 | |
Фосфолипид phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate (PtdInsP3) играет ключевую роль в широком круге клеточных процессов, включая регуляцию пролиферации клеток и апоптоза. Передача сигналов PtdInsP3 часто расстроена при раке и диабете. Однако известно мало о пространственно-временных аспектах PtdInsP3 в одиночных живых клетках. Yoshio Umezawa и др.разработали флюоресцентные индикаторы, которые позволяют анализировать пространственно-временную регуляцию продукции PtdInsP3 и делают возможным определить их специфическое направление или в плазматическую мембрану или эндомембраны. Используя эти новые маркёры, исследователи установили, как сигнальные пути, стощие ниже PtdInsP3, активируются во внутриклеточных компартментах, удаленных от плазматической мембраны.
Группа Umezawa's получила избирательный PtdInsP3-связывающий индикатор, названный 'fllip', который м.б. прикреплен как к эндомембранам (fllip-em) так и плазматической мембране (fllip-pm) посредством инсерции специфических membrane localization sequence (MLS). Индиакатор подвергается конформационному изменению после связывания PtdInsP3 и даёт в результате fluorescence resonance energy transfer (FRET), тем самым позволяя определить динамику PtdInsP3.
Стимуляция клеток с помощью platelet derived growth factor (PDGF) способствует димеризации receptor tyrosine kinase PDGFR, которые затем активируются посредством фосфорилирования по множественным отсаткам тирозина. Phosphatidylinositol 3-kinase (PI(3)K)присоединяется к этим сайтам фосфолрилирования и должным образом активируется. Используя fllip-em и fllip-pm, авт. нашли, что т.к. уровни и endomembrane (EM) и plasma membrane (PM) PtdInsP3 увеличиваются после стимуляции PDGF, то уровни EM увеличиваются на 2-3 раза сильнее, чем уровни PM. Лигандами индуцированная продукция PtdInsP3 обнаруживает временную задержку для EM по сравнению с PM. Это, как было установлено, обусловлено переносом PDGFR на EM посредством clathrin-обулволенного эндоцитоза. Т.о., PI(3)K активируется на EM, а PtdInsP3 увеличение, обнаруживаемое в EM, продуцируется in situ.
Эти результаты предоставляют механистическую связь между передачей сигналов рецепторами и удаленными эндоплазматическими увеличениями уровней PtdInsP3. Fllip индикаторы предоставляют собой новый инструмент для обнаружения липидных вторичных мессенджеров и помимо PtdInsP3, a изменения в MLS м. позволить индикаторам закрепляться на разных клеточных мембранах.
