Rab GTPase family

The Rab GTPase family

Harald Stenmark, Vesa M Olkkonen
Genome Biology 2001 2(5): reviews3007.1-3007.7
http://genomebiology.com/2001/2/5/reviews/3007

Семейство Rab является частью сверхсемейства Ras малых GTPases. Имеется, по крайней мере, 60 Rab генов в геноме человека и ряд Rab GTPases законсервирован от дрожжей до человека. Разные Rab GTPases локализуются на цитозольной стороне специфических внутриклеточных мембран, где они функционируют как регуляторы разлиынх ступеней пути переноса мембран. GTP-связанной форме Rab GTPases рекрутируют специфические наборы эффекторных белков на мембраны. Посредством этих эффекторов Rab GTPases регулируют формирование пузырьков, actin- и tubulin-зависимое перемещение пузырьков и слияние мембран.


(Рис.1.)  |  The Rab GTPase cycle


(Рис.2.)  |  Phylogenetic tree of human Rab GTPases


(Рис.3.)  |  Structural features of Rab GTPases


(Рис.4.)  |  Intracellular vesicle transport pathways and localization of selected Rabs

(Табл.1) Localization and function of selected Rab GTPases

Localization and function

Компартментализация эукариотических клеток нуждается в транспорте липидов и белков между определенными мембран-связанными органеллами. Этот транспорт тонко регулируется и обычно проявляется в виде транспорта пузырьков, которые отпочковываются от донорского компартмента и сливаются с акцепторным компартментом. Rab GTPases ('Ras-related in brain'), которые принадлежат сверхсемейству Ras малых GTPases, считаются ценральными регуляторами отшнуровывания перемещения и слияния пузырьков. Подобно др. регуляторным GTPases, белки Rab переключаются между двумя отдельными конформациями, GTP-связанной и GDP-связанной (Рис. 1). GTP-связанная конформация в целм рассматривается как 'активная', т.к. она является формой, которая взаимодействует с нижестоящими эффекторными белками.

Gene organization and evolutionary history

Человек имеет, по крайней мере 60 различных членов семейства Rab (Рис.2). Этот минимальные подсчеты. Rab гены широко распределены по хромосомам человека. Rab GTPases обнаружены у всех исследованных эукариот, включая Saccharomyces cerevisiae (11), Caenorhabditis elegans (29) и Drosophila melanogaster (26 членов). Большинство, но не все, дрожжевые Rab GTPases (большинством называемые Ypt белками) имеют одного или несколько гомологов у млекопитающих. В некоторых случаях, Rab млекопитающих м. функционально замещать дрожжевые, демонстрируя тем самым консервацию функций белков у эукарит.
Многие Rab GTPases, по-видимому, продукты генных дупликаций, учитывая, что некоторые подсемейства состоят из близко родственных Rab GTPases ('isoforms') с 75-95% идентичных последовательностей и с перекрывающимися функцими (Рис. 2). 10 подсемейств - Rab1, Rab3, Rab4, Rab5, Rab6, Rab8, Rab11, Rab22, Rab27 и Rab40 - определены, базируясь на определенных специфических для подсемейств мотивов последовательностей, но ряд Rab белков не удается сгруппировать в эти подсемейства. В целом, Rab GTPases наиболее отличаются по своим С-концам, которые участвуют в субклеточном таргеттинге, тогда как области, участвующие в связывании guanine-nucleotide наиболее законсервированы. Более того, Rab гены млекопитающих в целом состоят из нескольких экзонов, и подвергаются альтернативному сплайсингу.

Characteristic structural features

Осуществлена X-ray кристаллография для 4 Rab GTPases: мышиной Rab3a, Plasmodium falciparum Rab6, и S. cerevisiae Ypt51p и Sec4p. Rabs имеют одинаковую упаковку, которая по большому счету обща всем малым GTPases сверхсемейства Ras. Складывание дает шести-нитчатый β листок, представленный 5 параллельными и одной антипараллельной нитью, окруженный 5 α спиралями. В этой структуре элементы, отвечающие за связывание guanine нуклеотида и Mg2+, а также за GTP гидролиз, локализованы в пяти петлях, которые соединены с α спиралями и β нитями. Аминокислотные остатки, которые появляются вместе в пространстве, чтобы сформировать эти активные сайты, тесно ассоциированы или с фосфатными группами связываемого нуклеотида и Mg2+ или в основанием guanine (Рис. 3) и высоко законсервированы во всем сверхсемействе Ras; они легко м.б. использованы для распознавания любой малой GTPase.
Кристаллографический аналаиз p21Ras и Rab Sec4p в GDP- и GTP-связанном состоянии показал, что белки адаптируют две различные конформации, с наибольшими нуклеотид-индуцировнными различиями, появляющимися в областях, обозначенных switch I и switch II. Аминокислотные последовательности этих переключающих областей локализованы в области петли 2 и петли 4-α2-loop 5 области, соотв., а в трехмерной структуре они обнаруживаются на поверхности молекулы. Показано, что предполагаемые области переключения являются критическими для взаимодействия Rab белков с регуляторными белками партнерами, такими как GDP/GTP exchange факторы и GTPase-активирующие белки. Более того, кристаллическая структура комплекса Rab3a и его эффекторной молекулы rabphilin-3a показала, что области переключения формируют важную часть связывающей поверхности между двумя белками.
Анализ последовательностей показал присутствие 5 различных аминокислоных участков, которые характерны для Rab GTPases (Рис. 3b). Эти т. наз. RabF области (показанаы красным на Рис. 3b) концентрируются внутри и вокруг областей переключения I и II и, как полагают, создают средство для неоднозначной идентификации Rab белков. Кроме того, идентифицированы 4 области (RabSF области, покзаны темно голубыми на Рис. 3b), которые м.б. использованы для определения 10 подсемейств Rab GTPases. Области RabSF находятся на одной из двух поверхностей GTPases; они, по-видимому, обеспечивают специфичность связывания нижестоящих эффекторных молекул, которые должны распознаваться специфическим Rab или Rab подсемействами помимо детекции нуклеотид-связанного состояния. Так, показано, что хорошо охарактеризованный эффектор Rab3a, rabphilin-3A, занимает две основные связывающие стороны на поверхности GTPase. Эти области Rab3a названы Rab complementarity-determining области, они участвуют как в переключающих областях, так и в Rab мотивах, специфичных для сверхсемейства. Модель подтверждена там, гед эффекторы и регуляторы связываются как с RabF мотивами в областях switch I и II, чтобы различать активные и неактивные конформации и для обеспечения специфичности RabSF областей.

Localization and function

Некоторые Rabs экспрессируются повсеместно в тканях человека, тогда как др. являются ткане-специфичными (Табл. 1). Внутри клеток, они локализуются на цитозольной поверхности определенных внутриклеточных мембран (Рис. 4 и Табл. 1). Их обратимая мембранная локализация зависит от посттрансляционных модификаций цистеинового мотива на на самом С-конце (CXXX, CC, CXC, CCXX или CCXXX где X любая аимнокислота), с одной или двумя высоко гидрофобными geranylgeranyl группами. Эти посттрансляционные модификации нуждаются в инициальном распознавании вновь синтезированного Rab белка с помощью Rab escort protein (REP), который представляет Rab белок geranylgeranyl transferase. REP затем функионирует как хаперон, который удерживает гидрофибный, geranylgeranylated Rab растворимым и высвобождает его в соответ. мембране. Специфический таргеттинг Rab GTPases, как полагают, помещает на мембранах рецепторы, которые распознают комплекс между REP и специфическими Rabs, но такие рецепторы не идентифицированы на молекулярном уровне.
REP-ассоциированные Rab GTPases, как полагают, находятся в GDP-связанной форме, тогда как освобождение с мембран сопровождается заменой GDP на GTP, катализируемой GDP/GTP exhange factor (GEF), и высвобождением REP. После гидролиза GTP, который катализируется GTPase-activating protein (GAP), Rab GTPase м.б. высвобождена из мембраны. Это обеспечивается Rab GDP-dissociation inhibitor (GDI), который способен извлекать geranylgeranylated, GDP-связанный Rab из внутриклеточных мембран. GDI обладает структурным сходством с REP и подобно REP, GDI м. представлять geranylgeranylated, GDP-связанные Rab белки специфическим мембранам. GDI, который более обилен, чем REP, и таким образом служит как рециклинг-фактор, который делает возможным несколько раундов ассоциаций с мембраной и возвращений Rab GTPases.

Function

Установлено, что Rab GTPases функционируют как регуляторы специфических внутриклеточных путей переноса. Ключом к их функции является необходимость в эффекторных молекулах. которые соединяются исключительно с их GTP-связанной формой. Rab эффекторы являются очень гетерогенной группой белков: некоторые являются суперскрученными белками, участвующими в привязке к мембранам или docking, тогда как др. являются энзимами или ассоциированными с цитоскелтом белками. Показано, что эндосомная GTPase Rab5a имеет несколько разных эффекторов и это, по-видимому, верно для др. Rabs. Это указывает на то, что Rab GTPase м.б. способны регулировать несколько молекулярных событий в ограниченной мембранной локализации. Напр., Rab5a контролирует прикрепление и слияние эндоцитотических пузырьков, кроме того контролирует формирование пузырьков на плазматической мембране и зависимую от микротрубочек подвижность эндоцитотических структур.

Important mutants

Нокаут генов у дррожжей покзал, что некоторые Rab GTPases существенны, тогда как другие несущественны. Лишь нокаут Rab у млекопитающих для нейронально экспрессируемой Rab3a, выявил минорные фенотипические изменения у мышей. Некоторые генетические заболевания связаны с Rab GTPases или с взаимодествующими с ними белками.
Griscelli синдром является аутосомно рецессивным заболеванием, вызываюдщим частичный альбинизм. Имеется два варианта этой болезни, одна из них ассоциирована в первцю очередь с иммунологическими дефектами, а др. ассоциирует нейрологическими дисфункциями. Синдром с иммунологическими дефектами обусловлен миссенс мутациямив гене, кодирующем Rab27a. Эта GTPase регулирует перемещение меланосом на периферию меланоцитов, она регулирует также секрецию литических гранул в цитотоксических T лимфоцитах. Отсутствие Rab27a вызывает таким образом пигментные аномалии и дисфункции Т лимфоцитов. Синдром Griscelli с нейрологическими симптомами обусловливается мутациями в гене, кодирующем моторный белок миозин Va, предполагаемый эффектор Rab27a. который управляет периферическим распределением меланосом вдоль актиновых филамент. Т.к. миозин Va не участвует в экзоцитозе литических гранул, то инактивация этого белка не ведет к иммунологическим симптомам. to immunological symptoms.

Choroideremia это X-сцепленное заболевание, которое связано с дегенерацией пигментного эпителия сетчатки и соседнего хороидного слоя и слоя фоторецепторных клеток сетчатки, ведет к слепоте. Ген мутирующий при choroideremia является одним из двух REP изоформ, REP-1. Хотя др. изоформа, REP-2, по-видимому, достаточна для geranylgeranylation всех Rab GTPases во всех тканях за исключением пигментного эпителия сетчатки, REP-1 существенен для эффективной geranylgeranylation Rab27a в этой ткани. Т.обр., отсутствие REP-1 ведет к отсутствию функциональной Rab27a , специфической для пигментного эпителия сетчатки. Дегенерация этого эпителия и соседних с ним слоев м.б. обусловлена дефицитом транспорта меланосом и, следовательрно, отсутствием защиты против вредной экспозиции светом.

Подгруппа пациентов с Х-с цепленной неспецифической умственной отстсалостью имеет мутации в гене одной из GDI изоформ, GDI-α. Эта изоформа особенно обильна в головном мозге, а дисфункция рециклинга мембран из-за одной или более Rab GTPases в синапсах головного мозга, ведет к аберантной нейротрасмиссии и скорее всего лежит в основе симптомов этой болезни.

Localization and function

Rab GTPases - большое семейство белков с различными регуляторными функциями в поставке мембран. Секвенирование генома человека позволяет убедиться в разнообразии семейства Rab генов, хотя функция большинства генных продуктов неизвестна.
На молекулярном уровне, идентификация новых GAPs, GEFs и эффекторов даст новую информацию о регуляции Rab GTPases и о молекулярных комплексах, ее контролирующих. Ключевой вопрос, какие 'рецепторные' молекулы предопределяют специфичность их внутриклеточного распределения?
На уровне мембран, нескоько аспектов функции Rab GTPase остаются неизвестрными. ограничены ли Rab GTPases мембранными доменами и , если этот так, то как это детерми нируется? Как Rab GTPases и их эффекторы регулируют отпочковывание мембран, пожвижность их и слияние?
Наконец, каковы пути регуляторного действия Rabs, взаимодествия с клеточными сигнальными каскадами?

RAB PROTEINS AS MEMBRANE ORGANIZERS

Marino Zerial & Heidi McBride
Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, No 2, 107-117 (2001)


Внутриклеточный транспорт осуществляется в 4 ступени:  фрмирование пузырьков или тубулярных intermediate, движение пузырьков  к своим мишеням компартментам, связывание/помещение в док акцепторными мембранами и слияние с липидным двуслоем. Первым специфическим событием является Rab-обусловленное связывание пузырьков с правильными мишенями органеллами. В результате этого специфическое топологическое спаривание 
COGNATE SNARES (soluble
NSF attachment protein receptor, where NSF stands for N-ethyl-maleimide-sensitive fusion protein) между двумя бислоями (SNARE pins)гарантирует точность слияния (см. Chen и Scheller page 98). SNAREs встречаются в большом количестве в некоторых органеллах, однако во время транспорта пузырьков SNAREs распространяются на многие клеточные компартменты. Любая органелла м. содержать  SNARE комплексы, которые должны оставаться неактивными до тех пор, пока они не вернутся  к специфическим  местам своего функционирования.
Как Rab GTPases и их
EFFECTORS обеспечивают комплементарную специфичность SNARE комплексам? Открытие молекулярных взаимодействий  между Rab эффекторами и компонентами SNARE machinery позволяет предположить, что Rab белки непосредственно регулируют функцию SNARE.
Links
DATABASE LINKS
p115 | Rabaptin-5 | EEA1 | Rabenosyn-5 | Ypt1p | Rab1 | TRAPP COMPLEX | Sec4p | Exocyst | Rab5 | Ypt7p | HOPS COMPLEX | Vps41p | Vps39p | Rabex-5 | Rab9 | Rab6 | Rabkinesin-6 | Griscelli syndrome | MYO5A | RAB27A | myosin-VA | Rab27a | FYVE finger | p85α | p110β | hVPS34 | p150 | Rab4 | Rab11 | Sec1p | Vps33p | Vps45p | Vac1p | Pep12p | syntaxin 13 | Vam3p | calmodulin | calmodulin-binding IQ motif | Rab33b | syntaxin 6
HYPERLINKED FIGURE И TABLES
α-actinin | δ-PDE | Dss4p | EPS8 | Gyp1p | Gyp2p | Gyp3p | Gyp6p | Gyp7p | mSec13 | MSS4 | p40 | PRA1 | Rab2 | Rab3 | Rab7 | Rab8 | Rab10 | Rab12 | Rab13 | Rab17 | Rab18 | Rab20 | Rab21 | Rab22 | Rab24 | Rab25 | Rab26 | Rab30 | Rab36 | Rab37 | Rab11bp | RAB3GAP | RAB8IP | rabphilin3 | Sec2p | Sec4p | Sec15p | Tuberous sclerosis 2 | VAMP2 | Vps9p | VPS45 | Vps39p | Vps41p | Yif1p | Yip1p | Ypt6p | Ypt51p
FURTHER INFORMATION
Zerial lab home page | University of Ottawa Heart Institute




(Рис.1.)  |  Map of intracellular localization of Rab proteins.

(Рис.2.)  |  Model of Rab domains on endosomes.


(Табл.1)  | Rab proteins и their effectors

(Табл.2)  | Regulatory proteins

(Box 1) | Rab5 effectors cluster in a Rab5 domain

(Box.2) | Molecular interactions between Rab и SNARE machineries

Heterogeneity of Rab effectors

Rab белки составляют большое семейство мономерныых малых GTPases. 11 Rab (Yptp/Sec4p) белков экспрессируется у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, у человека известно 63 члена этого семейства согласно expressed-sequence tags (ESTs) и секвенированному геному. Установлено, что Rab белки распределны по отдельным внутриклеточным компартментам и регулируют транспорт между органеллами ( Рис. 1 и Табл 1, 2>). Наиболее важным свойством является способность GTPases to cycle регулярно между  GTP- и GDP-связаным состоянием.  states. Этот цикл обеспечивает временную и пространственную регуляцию мембранному транспорту, причем  Rab белки действуют подобно таймерам, чьи часы настроены в зависимости от (intrinsic и catalysed) скоростей обмена и гидролиза нуклеотидов. Их on/off регуляторная функция ограничивается мембранными компартментами, где они расположены.
Каждая ступень транспорта нуждается в том, чтобы активированные белки Rab связывались с растворимыми факторами, которые действуют как 'effectors', чтобы транслировать сигнал от Rab GTPase транспортному механизму (Табл. 1, 2). Структурная консервация Rab GTPases и SNAREs предполагает, что и Rab effectors будут также сгруппированы в семейства структурно сходных законсервированных белков. Но это не так. Их структурная гетерогеннось указывает на то, что Rab effectors являются высоко специализированными молекулами , чья активность направлена исключительно на индивидуальные органеллы и транспортные системы. Однако, некоторые Rab effectors обладают сходными структурными свойствами. Напр.,  p115/Uso1p, Rabaptin-5 и early endsosome antigen 1
EEA1 все содержат предсказуемые coiled-coil области, и Rab3-interacting molecule (Rim1), EEA1 и Rabenosyn-5 , содержащие цинковые пальчики.

Regulation of intracellular transport

Rab белки занимаются связыванием и постановкой в док пузырьков в соответствующих компартментах, что ведет к слиянию мембран.  Однако Rab белки участвуют также в почковании пузырьков и во взаимодействиях пузырьков с цитоскелетными элементами.
Membrane tethering. В зависимости от системы рекрутирование Rab и tethering эффекторных белков м.б. симметричным или асимметричным между донорскими и акцепторными мебрананами. В секреторном пути дрожжей  связывание  endoplasmic reticulum (ER)-derived пузырьков с комплексом Golgi зависит от рекрутирования Uso1p с помощью  Ypt1p, но не SNAREs. У млекопитиающих гомолог Uso1p, p115, связывается непосредственно с Rab1. Тогда как Rab1 рекрутирует p115 в
COPII (coat protein 2) VESICLES уже на ступени почкования, у дрожжей потребность в Ypt1p м.б. только на уровне мембран мишеней. Кроме этих белков мультибелковый комплекс TRAPP (transport protein particle) также является мишенью  для ER-derived пузырьков к аппарату Golgi.  TRAPP комплекс ускоряет обмен нуклеотидами  на Ypt1p, возможно в Golgi , где эта GTPase присутствует.
Высвобождение post-Golgi пузырьков для плазматических мембран у дрожжей  зависит от Sec4p , а  tethering фактор, который взаимодействует с этим Rab белком, также является мультибелковым комплексом —  exocyst. Это комплекс из 7 белков, которые специфически необходимы для exocytosis. Эквивалентный комплекс существует у млекопитающих. Одна из его субъединиц, Sec3p, маркирует сайт экзоцитоза на плазматической мембране дрожжей. Экзоцист обеспечивает пузырькам связь и через Sec15p субъединицу взаимодействует специфически и прямо с Sec4p GTP-dependent способом.
На раннем ENDOCYTIC PATHWAY, Rab5 регулирует транспорт, обеспечиваемый  clathrin-coated-vesicle, от плазматических мембран к ранним эндосомам, а также гомотипическое слияние ранних эндосом.  EEA1является Rab5 эффектором, который обеспечивает tethering/docking ранних эндосом. EEA1 является большим суперскрученным  белком с двумя цинковыми пальчиками и двумя   Rab5-связывающими доменами на amino и carboxyl концах. Принимая во внимание, что Rab5 необходим также для слияния  как для донорских, так и акцепторных мембран, то  EEA1 должен формировать мостики между двумя мембранами, несущими Rab5.

Симметричная потребность в Rab белке для докирования и слияния пузырьков установлена для  Ypt7p при слиянии вакуолей у дрожжей.  Ypt7p связывается с и регулирует мембранную локализацию  multi-protein комплекса (HOPS, который необходим для гомотипического слияния и сортировки белков вакуолей: называется также Class C Vps протеиновый комплекс), который включает  Vam2p/Vps41p и Vam6p/ Vps39p белки.  HOPS, по-видмому, является эффектором, обусловливающим Ypt7p-зависимое связывание. Более того,  HOPS стимулирует обмен нуклеотидов на Ypt7p. Итак, как было показано ранее для Rabaptin-5– Rabex-5 комплекса Rab5, HOPS купирует обмен нуклеотидов на Rab белке, для рекрутации и функции эффектора.

Vesicle budding. Менее очевидна роль Rab белков в отпочковывании. В экспериментах in vivo показана возможная роль Rab1 в отделении пузырьков от ER и для Rab9 от эндосом, направленная на trans-Golgi network (TGN). Однако недавно было показано, то Rab1 не существенен для формирования COPII пузырьков in vitro. У дрожжей Ypt1p (Rab1) такжененужен для образования COPII пузырьков, а необходим исключительно для нахождения мембран Golgi.
Rab5, который модулирует период полу-жизни clathrin-coated pits (
CCV ) на плазматической мембране in vivo, необходим для образования пузырьков in vitro. В соответствии с этим избыточная экспрессия RN-Tre,  Rab5 GAP (GTPase-activating protein), подавляет Rab5 и ингибирует интернализацию рецепторов.
Один из компонентов Ypt7p (Rab7)-связывающего комплекса HOPS, Vam2p/Vps41p, также участвует в отпочковывании пузырьков от Golgi.
Т.о., Rab белки м. прямо или косвенно влиять на отпочковывание пузырьков. Они м. регулировать концентрацию и/или сборку компонент оболочки или помогать включать молекулы груза селективно в строящиеся пузырьки. Альтернативно, их присутствие в активном состоянии м. действовать как надсмотрщик (checkpoint), который гарантирует высвобождение пузырьков в соответствующих мишенях компартментах.
Vesicle motility. Роль Rab6 в зависимом от микротрубочек транспорте стала ясной благодаря открытию, что эта GTPase взаимодействует с кинезин-подобным белком, Rabkinesin-6, важным для цитокинеза. Rab5 регулирует как прикрепление ранних эндосом к, так и движение вдоль микротрубочек. Генетическое взаимодействие у дрожжей между  Sec4p и myosin heavy chain Myo2p указывает на возможный механизм, с помощью которого пузырьки перемещаются моторными белками вдоль поляризованных актиновых волокон в направлении мест экзоцитоза.  При редком аутосомно рецессивном Griscelli syndrome у человека дефекты пигментации кожи и волос обусловленны ненормальным накоплением  меланосом в меланоцитах. Б-нь связана с мутациями в гене MYO5A и в RAB27A. Те же самые белки теряются у мутантных мышей  dilute ( myosin-VA) и ashen ( Rab27a), у которых нарушен транспорт пигментных гранул.  Rab27a и myosin-VA функционируют на одном и том же пути транспорта меланосом в меланоциты.

Multiplicity of Rab5 effectors

Идентифицировно более 20 полипептидов из цитозоля головного мозга телят, которые взаимодействуют прямо или косвенно с GTP-связанной формой Rab5. Очевидно, что  Rab5 эффекторы функционируют кооперативно (Вох 1).
Rabaptin-5 образует комплекс с др. белком Rabex-5, который катализирует обмен нуклеотидов на  Rab5. После активации Rab5 с помощью Rabex-5,  Rabaptin-5–Rabex-5 комплекс индуцирует свою собственную рекрутацию в мембрану через Rabaptin-5. Эта позитивная петля обратной связи  противодействует  гидролизу GTP и создает микроусловия, котрые способствуют попаданию активного Rab5 на мембрану, где собрались уже др. Rab5 эффекторы.
С-терминальный конец связывающего фактора EEA1 содержит два структурных элемента для связи мембран ранних эндосом. Один, FYVE finger, цинковый пальчик специфически связывается с phosphatidylinositol-3-phosphate, PtdIns(3)P, a Rab5-связывающий сайт располагается непосредственно выше FYVE finger.  Phosphatidylinositol-3-OH kinases (PI(3)Ks) является Rab5 эффектором. PI(3)Ks участвует в различных клеточных процессах. Определенные типы PI(3)K выполняют уникальную функцию в сигнальной трансдукции и митогенезе, цитоскелетной организации и транспорте мембран. Rab5 взаимодействует непосредственно с двумя типами PI(3)Ks. Во-первых, p85α/ p110β, типа I киназа, которая в основном фосфорилирует PtdIns(4)P и phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2), генерируя PtdIns(3,4)P2 и phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P 3). Функция p85α/p110β в отношении Rab5 неизвестна, но учитывая, что I PI(3)Ks составляют компоненты  signal-transduction machinery, взаимодействия между  p85α/p110β и Rab5 м. вызывать новые свойства Rab5 в ответ на внутриклеточную передачу сигналов. Во-вторых,  PI(3)K является  hVPS34/ p150, гомологом млекопитающих дрожжевой Vps34p/Vps15p. Эта киназа преимущественно фосфорилирует  phosphatidylinositol в PtdIns(3)P, который необходим для рекрутации FYVE finger белков в ранние эндосомы.  Rab5 , следовательно, связан с генерацией PtdIns(3)P путем рекрутирования hVPS34/p150 (Box.1). Этот механизм не ограничивается рекрутацией в мембраны EEA1. Rabenosyn-5 является др.  FYVE finger Rab5 эффектором, который сходен с  EEA1, он рекрутируется  Rab5- и PtdIns(3)P-зависимым способомв ранние эндосомы, где функционирует, выполняя docking и fusion.
Очищенные clathrin-coated vesicles
CCV ) неспособны рекрутировать EEA1, несмотря на присутствие Rab5. EEA1 (и возможно Rabenosyn-5) м. исключительно присоединяться к ранним эндосомам и это асимметричное рекрутрование между транспортными пузырьками и их целями органеллами прямо коррелирует с ассиметричным распределением hVPS34. Связывания EEA1 с активированным Rab5, следовательно, недостаточно для мембранной рекрутации. Однако молекулы EEA1 содержат несколько (низкого сродства) сайтов связывания, достаточных для связывания формирующихся CCV с ранними эндосомами.
Если и др. Rab GTPases взаимодействуют с эффекторными белками такой же сложности, что и у Rab5, то количество Rab эффекторов будет существенно большим.

Rab domains

Предполагается, что Rab5 и его эффекторы не случайно рекрутируются и распределяются на мембранах ранних эндосом, а пространственно сегрегированы в определнных доменах мембран или  Rab доменах.
Однако, мембранные организации, регулируемые Rab5 очень отличаются от др. мембранных доменов, таких как LIPID RAFTS . Во-первых, протеин-липидные взаимодействия являются центральным фактором в генерации Rab5 доменов. Локальный синтез PtdIns(3)P не только разрешает специфическое ректрутирование FYVE effectors в связке с Rab5, нои участвует в образовании ими кластера. Когда мембрана  flows через раннюю эндосому, то phosphoinositides др. чем PtdIns(3)P (напр., PtdIns(3,4)P2 и PtdIns(3,4,5)P 3), будут или превращаться в PtdIns(3)P или исключаться из  Rab5 домена. Напротив, PtdIns(3)P, который генерируется в Rab5 домене и domain и не удерживается с помощью Rab5 effectors, будет использоваться в др. суб-компартментах эндосом, подвергаясь дальнейшим модификациям или деградации.
Вторым важным фактором для формирования Rab5 домена является кооперативность эффекторов. Локальная генерация липидов и рекрутирование индивидуальных эффекторов недостаточна для для поддержания мембранного домена. Необходима олигомеризация белка. На мембране EEA1, Rabaptin-5 и Rabex-5 образуют динамичные олигомерные комплексы  с NSF. Однако, олигомеризации м.б. недостаточно и м.б. необходима  поддержка, такая как актиновая сеть или аналогичная spectrin/ankyrin системе или  Golgi stacking machinery для организации Rab effectors  в настоящий архитектурный формат (layout). Цитосклетные треки д.б. соединены с этим каркасом.
Наконец, генерация и поддержание доменов Rab5 зависит от энергии. Гидролз GTP регулирует кинетику и границы рекрутирования эффекторов. Через продукцию PtdIns(3)P , PI(3)K использует ATP для рекрутации и кластрирования этих молекул (Box.1). ATPase активность NSF регулирует динамику гетеро-олигомеров.  Интеграция между GTPase и ATPase циклами гарантирует динамичное состояние между сборкой и разборкой олигомерных комплексов белков  и липидов и тем самым обеспечивает специфический контроль размеров мембранного домена.

Visualization of Rab domains

Rab5, и , по-видимому, его эффекторы, накапливаются  в частности в interface между сливающимися пузырьками. и персистируют в виде дискретных точек в течение минут после слияния эндосом.  Иммунофлюоресценция и video microscopy клеток, экспрессирующих Rab5, Rab4 и Rab11, нагруженных GREEN FLUORESCENT PROTEIN (GFP) также выявляют компартментализацию этих трех GTPases мембранах эндосом. Имеется три главных популяции эндосом: одна содержит преимущественно Rab5, вторая содержит Rab5 и Rab4, и третья с Rab4 и Rab11. Первые две соответствуют early/sorting эндосомам и последняя околоядерным RECYCLING ENDOSOMES . TRANSFERRIN , интернализуемый в качестве эндоцитотического трассера сначала вступает в  Rab5 домен, а затем  движется последовательно через Rab4- и Rab11-позитивные структуры.  Rab5 домен выступает как входной путь в ранние эндосомы, тогда как Rab4 и Rab11 домены должны содержать machinery, которая необходима для сортировки и рециклинга трансферрина для клеточной поверхности. Эндосомы, следовательно, м. рассматривать как мозаику Rab4, Rab5 и Rab11 (возможно и др. Rab) доменов, которые динамически взаимодействуют, но сохраняют относительно стабильным распределение в течение времени ( Рис. 2). Эти Rab домены должны быть связаны с помощью привязывающих молекул без переменшивания. Молекулы, такие как Rabaptin-5, взаимодействующие с  Rab5 и Rab4, м. функционально и структурно связывать Rab5 и Rab4 домены (Рис.2).
Компартментализация мембран не ограничивается Rab5 системой, она затрагивает и др. Rab effectors, которые участвуют в привязывании пузырьков. Места docking в виде дискретных точек вокруг вакуолей у дрожжей содержат по крайней мере два белка, необходимых для  сортировки и морфологии белков вакуолей, Vam2/Vps41p и Vam6/Vps39p. Экзоцист локализуется в APICAL JUNCTIONAL COMPLEXES полярирзованных клеток млекопитающих, в апикальных полюсах панкреатических ацинарных клеток и в кончиках растущих NEURITES , ростовых конусах и мстах сборки синапсов в развивающихся нейронах. Высоко динамичные ностели, содержащие Rab6 и специфические молекулы груза, транслоцируются из Golgi в ER. Т.о., участки Rab effectors обнаруживаются как внутри эндоцитотических, таки и биосинтетических органелл, указывая тем самым, что эти молекулы м. б в целом ограничены пространственно на мембранах органелл.

Rabs link to SNAREs и motor proteins

Критическим фактором транспорта везикул является координация между Rab-зависимым прикреплением мембран, докированием и SNARE-зависимым слиянием мембран. SNAREs ангажированы в trans-взаимодействия между vesicle- и target-SNAREs. Это взаимодействие ведет к тесной аппозиции мембран и слиянию. Предполагается, что селективной включение CIS-SNARE COMPLEXES в Rab домен является обязательным условием для распознавания SNAREs и для образования пар in trans upon tethering/docking (Вох 2)
. Молекулярные взаимодействия  с Rab эффекторами внутри Rab доменов м. приводить к селективному обогащению  cis-SNARE комплексами в местах их функционирования.
Установлена прямая молекулярная связь между Rab эффекторными белками и компонентами SNARE machinery (Box 2). Sec1p и родственные белки, Vps33p и Vps45p, регулируют спаривание SNARE путем секвестрирования молекул синтаксина. Взаимодействия между Rab эффекторми и членами семейства Sec1 наблюдались в клетках млекопитающих и дрожжей. Эти взаимодействия м. извлекать ингибиторы из SNAREs и м. вызывать конформационные изменения, которые позволяют SNAREs быть primed или стабилизированными в  trans-paired конформации (Box.2)
Примером второго набора взаимодействий между Rab effectors и SNARE priming machinery м.б. то, что Vac1p преципитируется вместе с  Pep12p и SEC18P в присутствии sec18-1 mutant.  Rab5 эффекторные белки  EEA1 и Rabaptin-5–Rabex-5 комплекс формируют олигомеры на эндосомах, чья сборка зависит от АТФазной активности NSF. Взаимодействия между  Ypt7p эффектором HOPS и SNAREs иакже зависят от АТФазной актиновсти Sec18p. Наконец, в обеих системах имеются специфические связи с белками SNARE. EEA1 соединяется непосредственно с syntaxin 13 и это взаимодействие функционально необходмо доя слияния эндосом. Ypt7p эффекторные белки обнаружены также в комплексе со SNARE Vam3p комплексом.
Компатрментализация эффекторов  Rab и SNARE machinery со специфически организованными доменами объясняет как продуктивное, компетентное к слиянию SNARE pairing происходит внутри мембранной среды, которая выбирается для присоединения пузырьков, несмотря на присутствие cycling популяции SNAREs и несмотря на promiscuous спаривание. Переход от связывания с мембранами к слиянию указывает на относительно большое расстояние, к. д.б. пройдено после активации SNARE machinery внутри Rab домена (75–150 nm). Это соответствует длине палочковидных привязывающих факторов. EEA1, напр., ассоциирует с филаментозным материалом, который отходит от цитоплазматической поверхности эндосом. Предполагается, что привязанные пузырьки продираются через высокой вязкости цитозоль, привязанные своей 'веревкой' до тех пор, пока пузырек не соединится с поверхностью мишени. Как только пузырек призелится используются активированые SNAREs для заключения его в док, при этом закрывается щель между двумя бислоями. Это указывает на то, что привязывающие факторы общаются на расстоянии в 100-nm и что пузырьки будучи "отлoвленными" передают сигнал к priming of SNAREs. Альтернативная возможность в том, что привязывающие факторы м. подвергаться существеннм конформационным изменениям после присоедининеия  пузырька к свободному концу,  в результате уменьшается размер щели и пузырек подтягивается к мишени. Напр.,  calmodulin-связывающий домен легкой цепи миозина )-binding domain of myosin скручивается, что генерировать движение в ответ на конформационные изменения  в моторном домене. Интересно, что калмодулин необходим и для слияния эндосом, а EEA1 содержит предполагаемый calmodulin-binding IQ motif, который м. функционировать в таких конформационных изменениях. 

Rab5-зависимое движение эндосом вдоль микротрубочек зависит от  hVPS34 PI(3)K. Итак, Rab5 функционально связывает регуляцию мембранного транспорта, подвижность и внутриклеточное распредление ранних эндосом. Это указывает на то, что микротубулярный мотор или молекулы, которые регулируют его рекрутацию и/или активность м.б. PtdIns(3)P-связывающими белками.  Rab5 эффектором, обеспечивающим переещение ранних эндосом м.б.  minus-ended kinesin. Rabkinesin-6 является Rab6 эффектором, a др. родственнуй кинезину белок, Rab33b-BP, соединяется с  Rab33b.



Сайт создан в системе uCoz