RAP1 signalling
ПЕРЕДАЧА СИГНАЛОВ RAP1

RAP1 SIGNALLING: ADHERING TO NEW MODELS

Johannes L. Bos, Johan de Rooij &Kris A. Reedquist
Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, No.5, 369-377 (2001)


Rap1, ближайший родственник Ras, регулирует Ras-опосредованную передачу сигналов.  Rap1 активируется внеклеточными сигналами посредством разных регуляторных белков и м. участвовать в различных процессах от модуляции роста и дифференцировки до секреции и интегринами-опосредованной адгезии и морфогенеза.

Сверхсемейство Ras большая группа белков, которая cycle между GDP- и GTP-связанными формами и взаимодействует с белками в зависимости от нуклеотидов, которые связаны. Члены семейства — по крайней мере 13 из имеющихся (Рис. 1) — характеризуются значительным сходством своих эффекторных доменов и одной из основных их функций является сборка или активация белков на цитоплазматической поверхности мембран. Наиболее известным членом семейства является Ras, один из трех ras, мутантен в 15% всех опухолей у человека. Важным оказался и его ближайший родственник Rap1.

(Рис.1.)  |  Ras-like small GTPases.

Boxes
Box 1 | Subcellular localization of Rap1
Rap1 is bound to the membrane through a geranylgeranyl group, which is added post-translationally to the processed Rap1 carboxyl terminus. Rap1 is found predominantly at intracellular membranes in the perinuclear region и at endocytic и exocytic vesicles, but also at the plasma membrane. Matsuda и co-workers report an elegant FLUORESCENCE-RESONANCE ENERGY TRANSFER procedure to measure Rap1 activation in single cells, in real time, и find that epidermal-growth-factor-induced activation of Rap1 also occurs mainly in the perinuclear region.

In certain cell types, such as neutrophils и PAROTID GLAND cells, Rap1 is associated with specialized secretory granules. Upon secretion, Rap1 redistributes to the plasma membrane. This might indicate that Rap1 is involved in either signalling processes that control the formation of these granules или the regulation of exocytosis.

Box 2 | Lessons from lower eukaryotes
Yeast. In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, Bud1 (Rsr1) is the most likely orthologue of Rap1 - it lacks a glutamine at position 61, и Rap1 can partially complement the bud1 defect. Bud1 recruits polarity-establishment factors - including the small GTPase Cdc42, Cdc24 (a GEF for Cdc42) и the scaffold protein Bem1 - to assemble the actin cytoskeleton for bud formation (Fig.5.) Bud5 (a GEF for Bud1) и Bud2 (a GAP for Bud1) are also involved in this process и might recognize a positional landmark to select the bud site.

The Rap1 orthologue CaRSR1 in Candida albicans is also involved in bud-site selection in the yeast stage. In addition, disruption of CaRSR1 affects GERM-TUBE formation и cell elongation during hyphae formation, indicating that CaRSR1 controls cell morphogenesis.

Dictyostelium discoideum. Rap1 is involved in regulating cortical actin-based morphological changes, as revealed by membrane ruffling и the formation of lamellipodia. It also positively regulates phagocytosis of bacteria и negatively regulates MACROPINOCYTOSIS , и it has been proposed to regulate endocytic processes through control of the actin cytoskeleton. No evidence, however, has been found for a role of Rap1 in exocytosis.

Drosophila melanogaster. The Roughened mutation is a gain-of-function mutation in Rap1. The dominant F157L mutation disrupts eye development. In particular, the ommatidia of the adult eye often lack one of the photoreceptor cells, usually the R7 cell. Development of the R7 cell is regulated by the Ras-Raf-ERK pathway, but the Roughened mutation does not interfere directly with Ras proximal signalling. This indicates that the apparent effect of Rap1 on Ras signalling is indirect. Expression of membrane-targeted Drosophila GEF C3G in the eye also results in a rough-eye phenotype that can be rescued not only by reducing the gene dose for Rap1, but also by reducing the dose for genes in the Ras-ERK pathway. These results indicate either that Rap1 is upstream from the Ras-ERK pathway, или that it acts in parallel to this pathway.

Loss-of-function mutations in Rap1 are lethal at the larval stage, и embryos that lack maternally supplied Rap1 show abnormalities, including defects in closure of the ventral furrow и head involution. The migration of germline cells (pole cells) и mesodermal cells is perturbed, indicating a possible function for Rap1 in regulating cell migration и morphogenesis. Surprisingly, however, deletion of Rap1GAP has no obvious phenotype.

Box 3 | Cellular processes in which Rap1 is implicated
Rap1 has been implicated in several cellular processes, for instance:

  • Rap1 is often found associated with secretory vesicles, implicating a possible function in exocytosis. Although there is little evidence that Rap1 regulates secretion, the Rap1 GEF Epac2 (cyclic AMP-GEFII) has been linked to цАМФ-regulated exocytosis - particularly Ca2+-dependent secretion of growth hormone. This link was established through the association of Epac2 with Rim1 и Rim2, two putative effectors of Rab3. Indeed, цАМФ-induced secretion was mediated, at least in part, by a protein kinase A (PKA)-independent pathway that required both Epac2 и Rim.
  • Rap1 has been found in a complex with cytochrome b5 , a component of the NADH OXIDASE COMPLEX . Rap1 localizes with cytochrome b in the specialized granules of monocytes, и it translocates to the phagosome membrane where the oxidase complex is assembled. But this story has not been followed up recently.
  • Rap1 can be co-immunoprecipitated with the sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase (SERCA) 3b from lysates of purified human platelets, although direct association between the two proteins has yet to be shown. Indirect evidence indicates that active Rap1 might inhibit the ATPase, thereby modulating intracellular levels of Ca2+.
  • Rap1 is involved in regulating цАМФ-induced - but not nerve growth factor (NGF)-induced - neurite outgrowth. Rap1 probably acts in a pathway that can cooperate with NGF или цАМФ to induce differentiation.
  • Rap1 has been implicated in the control of cell proliferation и, when overexpressed, even induces oncogenic transformation, for instance, in Swiss-3T3 cells.

Links
DATABASE LINKS
Rap1 | Krev-1 | Raf | Rap1a | Rap1b | NGF | C3G | Crk | R-ras | Epac1 | M-ras | CalDAG-GEF | Rap2 | Nsp2 | Ral | Tuberin | Rab5 | GAPIP4BP | B-raf | RalGDS | EGF | interleukin-1 | interleukin-2 | phospholipase D | Rlf | Rgl | AF-6 | zonula occludens 1 | profilin | protein kinase B/Akt | CD31 | H-ras | mitogen-activated protein kinase | phospholipase C | VLA5 | Spa-1 | HGF | SDF-1 | LFA-1 | Bud1 | Cdc24 | Cdc42 | Bem1 | Bud5 | Bud2
FURTHER INFORMATION
Bos lab | SMART database
ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES
G proteins


Matsuda и др. показали, что Ras и Rap1 активируются в виде пространственно-временного паттерна в клетках, используя технику fluorescent resonance energy transfer (FRET) и fluorescence recovery after photobleaching (FRAP).



FRET рис. показывает активацию Ras (вверху) и Rap1 (внизу) в COS клетках в ответ на действие epidermal growth factor в течение 0, 5 or 30 min (слева направо). Красный оттенок связан с высокой долей эмиссии, а интенсивность этого оттенка коррелирует с источником освещенности.

EGF-индуцированная активация Ras появляется на периферии плазматической мембраны и она ниже в местах межклеточных контактов - возможно в результате увеличения локальной Ras GAP активности. Напротив, EGF ведет к активации Rap1 во внутренней околоядерной области. Т.к. Raichu-Rap1 мутант с отсутствием farnesyl половинки не активируется EGF, а предварительная обработка Raichu-Rap1-экспрессирующих клеток ингибитором clathrin-опосредованного эндоцитоза предупреждает активацию Rap1's, очевидно, что Rap1 активируется в компартментах внутриклеточных мембрн с помощью интернализации EGF рецепторов.
В PC12 клетках, продолжительная активация Ras с помощью nerve growth factor ( NGF ) стимулирует выросты нейритов. Сначала активация Raichu-Ras происходит в теле клетки, но позднее точки активного Ras персистируют только в выпячивающихся нейритах. Это согласуется с предположением, что реакция выживания обеспечивается активацией NGF рецептора, TrkA, на клеточной поверхности, тогда как дифференцировка происходит в ответ на TrkA в эндосомах. Снова, в противоположность, активный Rap1 виден толко во внутриклеточных регионах таких клеток.

ORIGINAL RESEARCH PAPER Mochizuki, N. et al. Spatio-temporal images of growth-factor-induced activation of Ras and Rap1. Nature 411, 1065-1068 (2001) | Article | PubMed

M.R.H. Kooistra, N.Dube, J.L.Bos (j.l.bos@umcutrecht.nl)
Rap1: a key regulator in cell-cell junction formation
J.Cell.Sci. -2007.- V.120, No. 1, P. 17-22

Rap1 является Ras-подобной малой GTPase, которая активируется множественными внеклеточными стимулами и участвует в контроле обеспечиваемой интегринами клеточной слипчивости. Получены доказательтсва участия Rap1 в обеспечиваемых кадхерином межклеточных соединениях. В самом деле, ингибирование Rap1 приводит к формированию незрелых слипчивых соединений, тогда как активация Rap1 усиливает межклеточные соединения. Факторы обмена нуклеотидов для Rap1, такие как C3G и PDZ-GEF непосрественно соединяются с Е-кадхерином или другими белками соединений, а такие белки как afadin/AF6 и белки, контролирующие актиновый цитоскелет, действуют как эффекторы Rap1. Всё это подчеркивает роль Rap1 в пространственном и временном контроле образования межклеточных соединений.


(Рис.1.) Overview of the Rapl signalling network.



(Рис.2.) Schematic overview of adherens junctions and tight junctions



(Рис.4.) Model for the involvement of Rapl in cell-cell junction formation.

Regulating the switch

Rap1 имеет две изоформы, Rap1a и Rap1b, отличающиеся лишь по нескольким аминокислотам. Rap1 соединяется или с GDP или GTP, а переход между двумя состояниями представляет собой молекулярное переключение  — GTP-связанная форма является 'on', а GDP-связанная форма 'off'. Цикл ГДФ-ГТФ регулируется guanine nucleotide-exchange factors (GEFs), которые облегчают разрыв нуклеотидных связей и позволяют более многочисленным GTP связываться повторно.  GTPase-activating proteins (GAPs) индуцируют гидролиз связи GTP, заканчивая цикл. Кристаллическая структура GDP- и GTP-связанных форм Ras или Rap1 показывает, что конформация двух областей  —  switch 1 и switch 2  — различна. Эти области, которые сходны у Ras и Rap1 (Рис. 1), позволяют эффекторным белкам различать GDP- и  GTP-связанные формы и тем самым представлять 'business end' малых guanine-nucleotide-binding (G) белков.

Разработан м-д мониторинга активации эндогенного Rap1. Используя этот подход, было установлено, что эндогенный Rap1 активируется с помощью стимуляции различных трансмембранных рецепторов, включая рецепторорные тирозин киназы, гетеромерные G-protein-coupled рецепторы, цитокиновые рецепторы и молекулы клеточной адгезии (Рис. 2). Широко распространенные вторичные мессенджеры, такие как cyclic AMP, Ca2+ и diacylglycerol (DAG)участвуют в трансдукции внеклеточных сигналов к Rap1. Для некоторых стимулов, таких как nerve growth factor ( NGF), необходима интернализация распознаваемого рецептора для активации Rap1. Это согласуется с локализацией Rap1 преимущественно на внутренней повержности мембран (Box 1).

(Рис.2.)  |  The Rap1 signalling network.

Это разнообразие сигналов и путей, ведущих к Rap1 отражается и в значительном разнообразии GEFs и GAPs, которые регулируют Rap1 (Рис. 3).

(Рис.3.)  |  Regulatory proteins of Rap1.

'On' switches

C3G. Идентифицирован первый Rap GEF, C3G (Crk SH3-domain-binding guanine-nucleotide releasing factor, где SH3 означает Src homology region 3 domain), обеспечивающий активацию Rap1 и индуцируемый рецепторными тирозин-киназами и, возможно, нерецепторными тирозин-киназами. C3G содержит каталитическую область, которая отвечает за реакцию обмена, и различные богатые пролином последовательности, которые ассоциируют с первым SH3 доменом Crk адапторных белков. Связываение Crk–C3G комплекса с фосфотирозин-содержащими белками, по-видимому, облегчает фосфорилирование Tyr504 у C3G, и если образование этого комплекса подавлено, то рецепторной тирозин-киназой индуцированная активация Rap1 блокируется. C3G активирует также R-ras (related to Ras), и некоторые из биологических эффектов, индуцируемых Crk–C3G м. опосредоваться с помозью этой GTPase.
Epacs. Обнаружение, что Rap1 активируется через цАМФ указывает на возможное вовлечение protein kinase A (PKA), мишени для цАМФ. Однако в некоторых типах клеток PKA не является, по-видимому. обязательной и в результате был идентифицирован Epac1 (exchange protein directly activated by цАМФ) или цАМФ GEFI. Epac1 активируется in vitro и in vivo в результате непосредственного связывания с cAMP. Его цАМФ-связывающий домен является авто-ингибирующей областью, которая, как отдельный домен, м. ингибировать каталитическую область in vitro. Epac1 содержит также
DEP домен, который отвечает за локализацию на мембране.
Др. членом семейства является Epac2, который содержит дополнительный N-концевой цАМФ-связывающий сайт со значительно меньшим сродством. третьим членом является Repac (related to Epac; GFR, MR-GEF), который содержит только каталитическую область, указывая тем самым. что он м.б. или постоянно активным или что его регуляторные последовательности м. находиться на отдельной, еще не идентифицированной субъеднице. Repac м. также взаимодействовать с Ras-подобными малыми GTPases посредством своего Ras-связывающего домена
RBD , а ко-экспрессия с конституитивно активной формой M-ras (где M означает muscle) — слабо охарактеризованным Ras гомологом — обусловливает частичную инактивацию Repac. Область RBD у Repac обладает гомологией с Epac1 и Epac2, так что эти GEFs м. также регулироваться с помощью Ras-подобных GTPases.
CD-GEFs. Члены CD-GEF ( CalDAG-GEF, где Cal означает Ca2+) семейства имеют предполагаемые Ca2+- и DAG-связывающие сайты, так что м. регулироваться одной или двумя молекулами. Они обладают различной GTPase специфичностью: CD-GEFI активирует Rap1 и R-ras; CD-GEFII или RasGRP активирует Ras и R-ras; и CD-GEFIII активирует Ras, Rap1, Rap2 и R-ras. CD-GEFII и III транслоцируются на мембраны в дополнение к DAG mimetic 12,13-tetradecanoyl phorbol acetate (TPA), но нечувствительны к повышенным уровням Ca2+. Напротив, CD-GEFI не транслоцируется в ответ на TPA, но регулируется аллостерически с помощью Ca2+ in vitro. Это м. указывать на то, что CD-GEFI является основным медиатором активации Rap1 с помощью Ca2+, а CD-GEFIII - активации Rap1 с помощью DAG.

PDZ-GEFs.. The PDZ-GEFs (Ras/Rap1a-associating-GEF, nRap-GEP) содержат
PDZ DOMAIN и домен, который хотя и сходен с цАМФ-связывающим доменом Epac, обладает очень низким сродством  к cAMP. PDZ-GEF1, по-видимому, регулируется также как Epacs; негативная регуляция каталитической активности с помощью (related) цАМФ-связывающего домена. Подобно Repac, PDZ-GEF1 содержит также предполагаемый RBD и м. связываться с GTP-связанным Rap1. С PDZ-GEF1 взаимодействуют и некоторые др. белки, включая PDZ-домен содержащие S-SCAM адапторные белки.

Other GEFs. Nsp2 (AND-34 /BCAR-3), белок с GEF доменом и с N-терминальным
SH2 доменом, при избыточной экспрессии регулирует малый GTPase Ras-like ( Ral) белок и, в меньшей степени, Rap1 и R-ras. Однако, in vitro Nsp2 не активирует Rap1.

'Off' switches

Rap1GAP. Rap1обладает очень низкой внутренне присущей GTPase активностью, т.к. в отличие от других малых GTPases, он не содержит законсервированного в положении 61 глютаминового остатка. Следовательно, GTPase-activating proteins (GAPs) важны для GDP–GTP цикла, т.к. они индуцируют гидролиз GTP. Rap1GAP - первый Rap1-специфичный GAP. Rap1GAPII имеет дополнительный N-терминальный домен, который ассоциирует с активной Gα-subunits, обеспечивая транслокацию GAP на плазматическую мембрану в ответ на активацию G-protein-coupled рецептора. Это ведет к снижению уровня Rap1GTP, указывая тем самым на повышенную активность GAP. Взаимодействия Rap1GAP с Gαz или Gαo также обнаружены. Взаимодействие с  Gαo, по-видимому, имеет противоположный эффект - ингибирование активности GAP.
Other RapGAPs. Spa1 член семейства Rap1GAPs характеизуется присутствием  домена PDZ. Один из членов этого семейства, E6TP1, идентифицирован как партнер для спаривания и мишень для деградации с помощью papillomavirus E6 онкопротеина человека. Tuberin, белок, не имеющий обычных белковых доменов за исключением домена GAP  является продуктом гена familial tuberous sclerosis, который если делетирован вызывает злокачественные опухоли. Этот белок обладает in vitro Rap1GAP активностью, но он также используется как GAP для Rab5. Наконец, GAPIP4BP, который связывается со вторичным мессенджером inositol-1,3,4,5-tetrakisphosphate, используется как Rap1GAP и является Ras GAP. 

Почему столь много различных сигналов и механизмов регулируют Rap1? Rap1 трансформирует многие внеклеточные сигналы в один нижестоящий биологический ответ или Rap1 является 'conserved' медиатором нескольких клеточных реакций, а, следовательно, и различных эффекторов? Известны различные эффекторы для Rap1, включая Ras effectors Raf1, B-raf и RalGDS.

Rap1 effectors

Control of the ERK pathway. Rap1 связывается с serine/threonine kinase Raf1 in vitro, благодаря взаимодействию с RBD и соседней богатой цистеином областью Rap1 и, кроме того, два белка ко-иммунопреципитируют. Но является ли это реальной функцией Rap1 модулировать передачу сигналов Ras/extracellular-signal-regulated kinase (ERK)(Рис. 2) путем отлавливания Raf1 в неактивном комплексе? Мутантый Rap1 м. ингибировать ERK путь. Индуцированная interleukin-1 активация Rap1, по-видимому, ослабляет Ras-опосредованую активацию передачи сигналов ERK. В
ANERGIC T CELLS , конституитивно активный Rap1 ингибирует Ras–ERK-опосредованную индукцию экспрессии interleukin-2, тогда как в нормальных T клетках избыточная экспрессия Rap GAP вызывает повышенную активацию ERK.
В фибробластах пре-активация эндогенного Rap1 с помощью внешних сигналов не способна противодействовать последующей Ras-зависимой активации ERKs, указывая тем самым, что активация Rap1 не всегда вызывает инактивацию (или активвацию) ERK. Следовательно, ингибирование Raf1–ERK сигнализации с помощью активации Rap1 зависит от клеточного содержимого. Одним из привлекательных кандидатов на роль стимула Rap1-индуцированной инактивации Raf является цАМФ. В определенных клетках, цАМФ актививрует Rap1 и ингибирует Ras-опосредованную инактивацию ERK. Кроме того цАМФ м. ингибировать активацию Raf через прямое фосфорилирование Raf1 с помощью PKA. Пока связь между активацией эндогенного Rap1, прямой инактивацией Raf1 и последующим подавлением Ras-опосредованной активации ERK  окончательно не установлена.
В некоторых типах клеток Rap1 участвует в активации  — скорее, чем в подавлении — пути ERK. Модель, что Rap1 соединяется с  и активирует члена семейства Raf, B-raf подтверждается in vitro, особенно тем фактом, что ингибиторы Rap1, такие как Rap1GAP и Rap1N17, устраняют активацию B-raf–ERK пути. Кроме того, B-raf преципитируется вместе с Rap1. Причина разных эффектов Rap1 на B-raf (activating) и Raf1 (inactivating) лежит во взаимодействии Rap1 с цистеин-богатой областью двух киназ, эти два домена и делают разными эффекты  Rap1 на два белка.
Купирование Rap1 с B-raf обнаруживается в субнаборе клеток, экспрессирующих B-raf — в особенности, в нейрональных клетках  — и, по-видимому, ограничивается Rap1, активируемым цАМФ  PKA-зависимым способом. Эта PKA-зависимая активация Rap1 (и, затем, ERK) м. возникать из-за повышенного уровня внутриклеточного Ca2+ . В др. типах клеток Rap1 активируется с помозью PKA-независимого механизма через  Epac. В некоторых из этих клеток цАМФ не индуцирует активность ERK.
цАМФ-опосредованная активация Rap1 и B-raf является не только механизмом, с помощью которого цАМФ активирует путь ERK (Рис. 4). Так, цАМФ-индуцированная активация ERK обеспечивается Ras скорее, чем Rap1 в меланоцитах, а PKA-опосредованное фосфорилирование негативной регуляторной фосфатазы ERK необходимо для  agonist-индуцированной активации ERK в T клетках. PKA фосфорилирует B-raf непосредственно, в зависимости  от уровня относительной экспрессии
14-3-3 PROTEINS . Это фосфорилирование м.б. ингибирующим скорее, чем актьивирующим. Можно предположить, что Rap1 необходим, но недостаточен и что прямое фосфорилирование с помощью PKA др. фактора, которым м.б. B-raf, является обязательным для активации комплекса. Или прямое фосфорилирование с помощью  PKA  Rap1 на С-конце м. также wxfcnjdfnm в этом процессе. Более того, Rap1GAP фосфорилируется с помощью PKA, но физиологическое значение этого неясно.

(Рис.4.)  |  Rap1 as a mediator of cyclic AMP signalling.

Other putative effectors of Rap1. The Ras-related малая GTPase Ral регулирует некоторые клеточные процессы, включая трансформацию и регуляцию phospholipase D и транскрипционных факоров. Ral-специфические GEFs, включая RalGDS, Rlf и Rgl, содержат RBDs, который связывается с активированными Ras и Rap1 in vitro . Избыточная экспрессия Rap1 м. активировать Ral, а in vitro, Rap1 м. стимулировать RalGDS-зависимые обмены на Ral. Более того, в тромбоцитах активация Rap1 — но не Ras — коррелирует с активацией Ral. Однако, прямой регуляции RalGEFs с помощью Rap1 не выявлено. Напр., RalGDS обнаруживается в Т клетках и фибробластах, но селективная активация Rap1 в отсутствие Ras активации неспособна активировать Ral.
Др. предполагаемый Rap1 эффектор, AF-6, который содержит PDZ домены, связывается с актиновыми филаментами и обнаруживается в ADHERENS JUNCTIONS . AF-6 содержит два N-концевых RBDs, тот, что ближе к концу, связывается с высоким сродством, активируя Ras и Rap1. AF-6 связывается с некоторыми др. белками, включая zonula occludens 1-1, profilin и Fam-deubiquitylating энзим, указывая тем самым, что AF-6 м. обеспечивать формирование или стабильность клеточных слипчивых соединений. Избыточная экспрессия активного Ras, но не Rap1, нарушает локализацию AF-6, указывая, что Ras скорее, чем Rap1 м.б. природным регулятором AF-6.

Наконец, активированный Rap1 взаимодействует непосредственно с др. белками, включая phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) catalytic subunit p110, Ras GAP, Nore1 (novel Ras effector) и Krit (Krev interaction trapped). Биолошическое значение этих взаимодействий пока неизвестно. Однако, Rap1 участвует в цАМФ-индуцированной, PI3K-опосредованной активации protein kinase B ( PKB/Akt)54  в тироидных клетках, указывая, что Rap1 способен активировать PI3K. Интересно, что активация Rap1 не зависит от PKA, тогда как активация Akt/PKB ингибируется с помощью ингибиторов PKA. Фосфорилирование Rap1 по серину в С-конце с помощью Rap1, по-видимому, ключевой этап в этой активации.

Cellular processes involving Rap1

У нижших эукариот Rap1 участвует в процессах поляризации или функционирования клеток скорее, чем в процессах связанных с пролиферацией и дифференцировкой клеток (Box 2). В клетках млекопитающих Rap1 участвует также и в др. клеточных процессах (Box 3).
Integrin-mediated cell adhesion. Вo-первых, преходящая избыточная экспрессия Rap1 сильно стимулирует αLβ2 -зависимую адгезию в Т клетках человека и мышиных pre-B клетках лейкемической линии. Во-вторых, T-cell receptor (TCR)-индуцированная адгезия блокируется с помощью инакивированного Rap1N17, а CD31 -индуцированная адгезия ингибируется с помощью RapN17, RapGAP и RBD. В-третьих, хотя ингибиторы Ras блокируют также TCR- и CD31-индуцированную адгезию, неспособность CD31 индуцировать активацию Ras подчеркивает передачу сигнала Rap1 как критического сигнала. И, наконец, Rap1 и H-ras стимулируют адгезию с помощью различных механизмов — тогда как H-ras-индуцированная адгезия нуждается в интактном актиновом цитоскелете и чувствительна к ингибиторам mitogen-activated protein kinase, PI3K и phospholipase C, ни один из них не нужен для Rap1-индуцированной адгезии.
Rap1 является также критическим в CD31- и cytokine-индуцированной адгезии гематопоэтических клеток, которые используют α1 интегрины  (VLA4 и VLA5). Но регуляция клеточной адгезии с помощью Rap1, по-видимому, не ограничена гематопоэтическими клетками: избыточная экспрессия Rap GAP signal-induced proliferation-associated gene 1 ( Spa-1) блокирует присоединение клеток HeLa к покрытым фибронектинам пластинкам; а доминантно-негативный C3G блокирует hepatocyte growth factor ( HGF)-индуцированную активацию Rap1 и повторное соединение клеток 293 с чашками для тканевой культуры.
Следовательно, Rap1 м. регулировать многочисленные интегрин-зависимые процессы, такие как морфогенез, гематопоэз, миграция лейкоцитов и инвазия опухолей. На самом деле, Rap1 необходим в агонистом-индуцированном, интегрин-зависимом фагоцитозе OPSONIZED PARTICLES в макрофагах мыши. Rap1 необходим также для фагоцитоза у Dictyostelium discoideum. Нарушения в активации Rap1 с помощью трансфицированных дикого типа и ингибирующих Crk и C3G белков коррелируют с нарушениями в реакции миграции клеток в ответ на HGF и stromal-cell-derived factor 1 ( SDF-1).

Наблюдания, что Rap1 обеспечивает активацию интегринов путем стимуляции рецепторов клеточной поверхности, таких как CD31 и TCR, показывают, что Rap1 функционирует 'inside-out' signalling по отношению к интегринам. Но как Rap1 регулирует функцию интегринов? Эффектор неизвестен. Ингибирование Rap1 функции, по-видимому, ведет к физическому ограничению интегринов, т.к. прямая активация lymphocyte-function-associated antigen 1 ( LFA-1) с помощью связывания Mn2+ с внеклеточным integrin cation-связывающим сайтом также ингибируется Rap1-ингибирующими белками. Итак, Rap1 активация м. не являться непосредственным сигналом для интегринов, но он м. индуцировать более общие изменения в клеточной архитектуре, которые сказываются на функции интегринов.

Rap1 участвует также  в 'outside-in' signalling интегринов, хотя это не доказано. У тромбоцитов активация большого интегрина αIIbβ3? gj-видимому, является результатом активации Rap1. Однако, в этих 'клетках, интегрином-опосредованная адгезия необходима и для последующей инактивации Rap1. Кроме того, клеточно-специфическая регуляция активности Rap1 выявлена в адгерентных клетках после присоединения их, но не обнаруживается различий от того помещены они на фибронектин (integrin-dependent) или polylysine (integrin-independent). Это указывает на то. что активность Rap1 м.б. независимой от передачи сигналов извне с помощью интегрина.  Mn2+-индуцированная активация интегрина также не вызывает активации Rap1, но активирует ERK. Клеточная адгезия м. также быть результатом редукции активности Rap1.

Conclusions и future prospects

Итак, эволюционно законсервированные GEFs связывают активацию Rap1 с широким репертуаром общераспространенных сигнальных путей  и мессенджеров, включая tyrosine-kinase-зависимый protein–protein сигнальные модули, Ca2+, DAG, цАМФ и др., еще неидентифицированные пути. Ниже Rap1 идентифицировано несколько предполагаемых эффекторов — включая и genuine эффекторы Ras. Наконец, Rap1 участвует в некоторых клеточных реакциях, включая клеточную дифференцировку, экзоцитоз и интегрин-опосредованную адгезию.
Rap1 фосфорилируется с помощью PKA, но роль этго фосфорилирования неясна. Оно м.б. связано с инактивацией Rap1 или с активацией B-raf с помощью Rap1. Неясна роль PKA и в цАМФ-опосредованной активации Rap1 — усилению Rap1GTP.  PKA-независимые пути оказались неожиданными, они связаны с повсеместно экспрессирующимися цАМФ мишенями, Epacs. PKA-зависмая активация Rap1 м.б. непрямой через пути, связанные с повышенными уровнями Ca2+. В целом, роль Rap1 в регуляции ERK еще не определена. Неизвестна роль Rap1и в Raf1/B-raf-ERK signalling у низших эукариот (Box 2).
Rap1 играет роль в inside-out signalling к интегринам, но молекулярный механизм неясен.
Возможная взаимосвязь между Rap1 и актиновым цитоскелетом следует из анализа Bud1 у дрожжей (Рис. 5). Bud1 взаимодействует непосредственно с Cdc24, фактором обмена Cdc42 (который является GTPase, участвующей в рекрутации актинового цитосклета в место почкования ). Очевидно, Rap1 помогает определить положение для некоторых клеточных процессов со своими GEFs и GAPs как белками, которые м. распознавать позиционные метки.

(Рис.5.)  |  Role of Bud1 in bud site selection.

Имеется мало доказательств роли Rap1 в болезнях человека. Однако, Rap GAP E6TP1 идентифицирован как мишень для E6 онкопротеина из high-risk human papillomaviruses. Следовательно, Rap1 м. участвовать в индуцировнной вирусом папиломы неоплазии. Более того, CD-GEFI является мишенью для ретровирусных инсерций, включая те, что индуцируют лейкемию у мышей.
Сайт создан в системе uCoz