Использовали 3'- или 5'-end-меченные ДНК субстраты, чтобы идентифицировать концы раскрученных ДНК (anti-biotin антителами конъюгированные бусинки золота, связанные с концам ДНК, становилисть видимыми как электрон-плотные частицы в электронных микрографах), Taylor and Smith определяли полярность нитей раскручиваемых структур, продуцируемых с помощью RecB-helicase-дефектных мутантов, RecB^K29QCD. Электронные микрографы показывали ssDNA петли и только один, 5'-заканчивающийся, ssDNA хвост эквивалентной длины. Итак авт. пришли к заключению, что неактивная RecB субъединица, оставшаяся на 3'конце, где она инициально связана, продуцирует петлю, но не второй хвост. Скорость раскрычивания почти идентична той, что наблюдается у дикого типа RecBCD, это указывает на то, что RecD helicase, которая связага с 5' концом, является более быстрой helicase, чем RecB и имеет противоположную полярность.

Чтобы проверить вклад RecB helicase, Taylor and Smith использовали RecBC энзим (лишенный RecD) и нашли, что он продуцирует Y-формные молекулы с двумя равной длины ssDNA хвостами, но без образования петли, как ожидалось для single-helicase энзима. Кроме того, a RecD-дефектные мутанты, RecBCD^K177Q, давали 'loop two-tail' раскрученные структуры, но с 3'-заканчивающимся длинным ssDNA хвостом и очень коротким 5' хвостом, обнаруживающими противополжную полярность нитей по сравнению с энзимом дикого типа. Неактивная RecD субъеджиница остается связаннойс или непосредственно с 5'-заканчивающейся нитью, где она формирует петлю и почти одинаковой длины ssDNA хвост на противополжной ните. Если удалить RecD субъеджиницук или инактивировать ее геликазную активность, используя RecBCD^K177Qмутантов, то в результате скорость раскрцчивания будет ~20% от таковой у энзима дигого типа — это подтверждает, что RecB является медленной helicase, которая функционирует на 3'-заканчивающейся нити.

Kowalczykowski и др. очищали histidine (his)-нагруженный RecD (^hisRecD) белок и определили, что он имеет ssDNA-зависимую ATPase активность. Они показали, что она также обладает DNA helicase активностью, которая обнаруживает АТФ зависимость. Однако, белок RecD транслоцируется в 5'→3' направлении. чтобы раскручивать ДНК, указывая тем самым, что м. путешествовать в том же направлении, что и RecB.

Затем Kowalczykowski и др. установили, что очищенный ^hisRecD белок м. б. восстановлен с помощью RecBC энзима, чтобы создать функциональный дикого типа энзим RecBCD, который обнаруживает быстрое processive раскручивание и корректное распознавание последовательностей ДНК, Chi, a recombination hotspot. Они также показали, что оба мутантных single-motor RecBCD энзима, RecB^K29QCD или RecBCD^K177Q, сохраняют почти на уровне дикого типа свою helicase активность, iуказывая тем самым, что RecB и RecD обладают независимыми, комплементарными активностями.

Эти исследования привели обе группы к модели 'dual-helicase'. Хотя на вид сложная RecBCD's биполярная геликазная активность осуществляется с помощью простого механизма, в котором две геликазы м.б. связаны с противоположными, анти-параллельными нитями разрыва двойной ДНК, но транслоцируются они в одном и том же направлении по отношению к дуплексу. Два мотора м. также объяснить исключительнол высокую processivity of RecBCD, aтакже как и необычное 'loop two-tail' промежуточное раскручивание, наблюдаемое на электронных микрографах — если два связанных мотора перемещаются по оппозитным нитям с неравными скоростями, более быстрая геликазная активность дает длинный ssDNA хвост, а петля ssDNA образуется на нити с более низкой скоростью геликазы. Интересно посмотреть, используются ли биполярные неидентичные геликазные мотора и др. DNA-processing энзимами.