The Smads
The Smads Liliana Attisano, Si Tuen Lee-Hoeflich Genome Biology. 2001 2(8): reviews3010.1-3010.8 http://genomebiology.com/2001/2/8/reviews/3010
Большое сверхсемейство transforming growth factor-β (TGFβ) секретируемых белков регулирует рост, развитие и дифференцировку клеток разных организмов, включая нематод, мух, мышей и челвека. Сигналы инициируются после связывания членов сверхсемейства TGFβ с serine/threonine kinase рецепторами клеточной поверхности, затем они умножаются с помощью внутриклеточных медиаторов Smads. Активация Smads ведет к их транслокации из цитоплазмы в ядро, где они активируют или репрессируют транскрипцию вместе с транскрипционными факторами, и тем самым регулируют экспрессию генов-мишеней. Большинство Smads состоит из двух законсервированных доменов. Mad homology (MH) домены I and 2, которые разделены незаконсервированной линкерной областью. Эти домены лишены энзиматической активности и вместо этого Smads обеспечивает свои эффекты посредством межбелковых и белок-ДНК взаимодействий. Целенаправленное разрушение генов Smad выявили их важность для эмбрионального развития и tumor-suppressor роль Smads у человека. (Рис.1.) \| Primary structure and relationships of Smads (Рис.2.) \| The TGFβ signal-transduction pathway (Табл.1) Chromosomal localization of human Smads (Табл.2) Phenotypes of Smad-deficient mice	Gene organization and evolutionary history Smads являются группой родственных внутриклточных белков, важных для передачи сигналов в ядро от членов сверхсемейства transforming growth factor-β (TGFβ) на клеточной поверхности. Хотя и родственны др., но Smads структурно отличны от др. внутриклеточных эффекторных белков. Прототипические члены семейства Smad, Mad и Sma, впервые были описаны у Drosophila и Caenorhabditis elegans, соотв. Родственные белки у Xenopus, человека, мышей и крыс были затем идентифицированы и все члены семейства теперь известны как Smads. Родственные белки описаны и у рыбок данио и паразитических гельминтов Schistosoma mansoni. Smads, которые содержат от 400 до 500 аминокислот, м.б. сгруппированы в 3 подсемейства, receptor-regulated Smads (R-Smads), common Smads (co-Smads) и inhibitory Smads (I-Smads), каждое из которых играет определенную роль (Рис. 1). Представительные члены всех трех подсемейств идентифицированы у большинства видов животных и наивысшая степень консервации наблюдается между членами каждого подсемейства. Напр., Drosophila Mad и Smad1 человека, члены R-Smad подгруппы, имеют 82% идентичных аминокислотных последовательностей. Между подсемействами, наивысшая степень консервации наблюдается для С-терминального Mad homology 2 (MH2) домена, с идентичными аминокислотными последовательностями от 32% до 97% у Smads человека. Имеется 8 членов семейства Smad family у млекопитающих поиски в базе данных генома человека подтверждают, что это полный комплект. 8 Smad генов человека картируются в 4-ой хромосоме(Табл. 1). Три Smad гена – Smad2, Smad4 и Smad7 – образуют тесный кластер в 18q21.1, области, которая часто делетируется при опухолях у человека. Три обнаружены на хромосоме 15, Smad3 и Smad6 картированы в 15q21-22 и Smad5 в 15q31. ОстальныеSmad гены, Smad1 и Smad8, локализованы в хромосоме 4 и 13, соотв. Интрон-экзонные границы для большинства Smad генов определены или в геноме мыши или геноме человека, и во всех случаях гены состоят из 6–12 экзонов. Альтернативно сплайсированные виды мРНК описаны для Smads 2, 4, 5, 6 и 8. Characteristic structural features Большинство Smads имеет два законсервированных домена на их N- (MH1) и С-конце (MH2), которые разделены богатой пролином линкерной областью варьирующей длины (Рис. 1a,b,c). У ингибирующих Smads, Smad6 и Smad7 и DAD, MH1 домены замещены дивиргентными N-концами, которые имеют области сходствавнутри ингибирующей подгруппы Smad. Хотя структура полной длины Smad еще не определена, но кристаллографический анализ отдельных доменов Smad прливает свет на важные структурные особенности MH1 и MH2 доменов (Рис. 1b,c). The MHI domain Определенные R- и co-Smads обладают ДНК-связывающей активностью, связывают стержневые ДНК консенсусные последовательности GNCN. Хотя это взаимодействие с довольно низкой специфичностью, связывание ДНК, как установлено, жизненно необходимо для транскрипционной активации специфических генов-мишеней. Кристаллическая структура MH1 домена Smad3 соединенная с 8 парами оснований Smad-связывающего элемента (GTCTGTCT) демонстрирует, что MH1 домен образует компактную глобулярную складку, которая использует высоко законсервированную в 11-остатков β шпильку для контакта с большой бороздой ДНК (Рис. 1b). У Smad2, 30 аминокислотная инсерция, кодируемая экзоном 3, как полагают, замещает β-hairpin петлю, что дает структурное объяснение отсуствию ДНК-связывающей активности у Smad2. Smad-зависимая активация мишеней-промоторов зависит от транслокации R-Smad-co-Smad комплексов из цитоплазмы в ядро. R-Smads вступает в ядро после рецептором-опосредованного фосфорилирования, тогда как Smad4 нуждается в ассоциации с R-Smad партнером для накопления в ядре. Основна спираль helix (H2) в домене MH1, представленая типичным сигналом ядерной локализации (KKLKK), существенна для ядерного импорта Smad3 (Рис. 1b). Транслокация Smad3 в ядро нуждается во взаимодействии с importin β, интересно отметить, что присутствие инсерции, кодируемой экзоном 3, в домене MH1 Smad2 предупреждает его взаимодействие с with importin β. Все это подтверждает, что др. детерминанты, такие как MH2 домен м. также участвовать в регуяции накопления в ядре R-Smads. Взаимодействие Smads с некоторыми транскрипционными факторами, включая Jun, TFE3, Sp1 и Runx, также м. происходить в MH1 домене; детальный анализ детерминант для этого типа взаимодействий не проведен. The MH2 domain Домен MH2 не связывает ДНК, он является многофункциональной областью, которая обеспечивает дифференциальную ассоциацию с широким разнообразием белков. Многие из этих взаимодействий служат для обеспеченияспецифичности и избирательрости функции Smad. Первая кристаллическая структура Smad MH2 домена было установлена для co-Smad Smad4. Было показано, что MH2 домен представлен пятью α спиралями (H1 - H5) и тремя петлями (L1, L2 и L3), которые заключают β sandwich (Рис. 1c). Smads существуют как мономеры и тримеры и хотя имеются некоторые противоречия о точом составе, стоихометрии и формировании олигомеров, довольно ясно, что домен MH2 является критическим для обеспечения взаимодействия волигомерах. Анализ трехмерного Smad4 кристалла показывает, что loop-helix область (L1, L2, L3 и H1) одной субъединицы осуществляет экстенсивные контакты с трех-спиральным пучком (H3, H4 и H5) др. субъединицы и что многие законсервированные остатки в Smads расположены внутри тримерного интерфейса. Передача TGFβ сигналов обеспечивается за счет прямой ассоциации R-Smads с TGFβ рецепторным комплексом. R-Smads затем непосредственно фосфорилируются с помощью типа I TGFβ рецепторной киназы, по крайней мере, по двум серинам законсервированного SSXS мотива, локализованного на самом конце С домена MH2. Установлено, что взаимодействия специфических Smad с рецепторами опосредуются с помощью L3 петли R-Smads и L45 петли в типа I рецепторе. Структура Smad2 MH2 домена была кристализована в комплексе со Smad-binding domain (SBD) of SARA (Smad anchor for receptor activation), белком, чьей функцией является рекрутация Smads на TGFβ рецепторы. Общая топология R-Smad MH2 домена сходна с таковой, что у Smad4, но R-Smads кроме того имеют карман на одной поверхности, которая расположена по соседсту с петлей 3. Т.к. Smad4 не взаимодействует с рецепторами, то считается, что этот basic карман м. служить местом-доком для фосфорилированного и активированного типа I рецептора. Кристаллическая структура Smad2 MH2 домена в комплексе с SARA SBD также обнаруживает необычайное расположение, при котором в 40-остатков SBD находятся в расправленной конформации, которая формирует богатую пролином спираль, α helix и a β нить. котрые контактируют с тремя спиральными пучками (H3, H4 и H5), и β нитью Smad2 MH2 домена. Считается, что взаимодействие SARA с β листком необходимо для специфичности, тогда как контакт с трехспиральным пучком вносит вклад в сродство связывания. Пока неясно, могут ли др. белки, которые взаимодействуют с Smad MH2 доменом также принимать форму, соответствующую взаимодействующей поверхности; функциональные исследования покзали, что α-спираль 2 домена MH2 важна для взаимодействия Smad2 с транскрипционным фактором FAST (FoxH1). The Smad linker region Линкерная область, которая соединяет MH1 и MH2 домены содержит ряд важных пептидных мотивов. Они включают потенциальные сайты для фосфорилирования с помощью mitogen-activated protein kinases (MAPKs) – это фосфорилирование м блокировать функцию R-Smad – и сигнал ядерного экспорта, локализованный внутри экзона 3 co-Smad Smad4. R-Smads и I-Smads также содержат законсервированный proline-tyrosine (PY) мотив, который обеспечивает взаимодействие с WW доменами в Smad-взаимодействующих белках Smurf1 и Smurf2. Smurfs являются E3 ubiquitin лигазами с C2-WW-HECT класса доменом, который катализирует ubiquitin-опосредованную деградацию определенных Smads и Smad-ассоциированных белков, включая ядерные онкопротеины SnoN и TGFβ-рецепторный комплекс. Линкерная область Smad4 также содержит Smad activation domain (или SAD), который необходим для транскрипционной активации. Кристаллическая структура фрагмента Smad4, который включает SAD aи MH2 домен, показала, что SAD контактирует со Smad4-специфическими последовательностями в домене MH2. Это стабилизирует богатое глютамином α-спиральное расширение, названное TOWER, которое, вместе с пролин-богатым SAD, м. формировать поверхность транскрипционной активации. Localization and function Developmental expression patterns в целом, все Smads широко экспрессируются в ходе всего эмбрионального развития и в большинстве взрослых тканей и типов клеток. Анализ мышиных эмрионов покзал, что имеются некоторые вариации в паттерне, времени и уровнеэкспрессии индивидуальных Smads. Напр., ингибирующие Smads, Smad6 иSmad7, экспрессируются на высоком уровне в развивающейся сердечно-сосудистой системе, хотя каждый кроме того обладает определенным паттерном экспрессии и в др. тканях, включая intramembranous кости и тестисы. Сo-Smad Smad4 повсеместно экспрессируется в ходе всего эмбрионального развития с особенно высоким уровенм в эпителиальных киптах кишечника. R-Smads обнаруживают перекрываеющиеся паттерны экспрессии; по крайней мере, один из BMP-регулируемых Smads (Smad1, Smad5 и Smad8) и одby bp TGFβ/activin-регулируемы[ Smad (Smad2 или Smad3) экспрессируется в каждой ткани. Function Члены сверхсемейства TGFβ передают сигналы, индуцируя стабильный ансамбль из гетеромерных комплексов трансмембранного типа I и II serine/threonine-kinase рецепторов. Внутри этого комплекса типа II рецепторная киназа фосфорилирует типа I рецептор, который затем инициирует передачу сигнала далее вниз по пути Smad. Smads затем передают сигналы TGFβ от клеточной поврехности в ядро. Каждый класс Smads играет определенную роль в сингальном пути (Рис. 2). Активированые типа I рецепторы ассоциируют со специфичесими R-Smads и фосфорилируют, по крайней мере, по двум серинам в законсервированном С-терминальном SSXS мотиве. Распознавание разных R-Smads с помощью различного типа I рецепторных киназ высоко специфично. Т.обр., TGFβ и activin типа I рецепторы, TβRI (ALK5) и ActRIB (ALK4), соотв., активируют как Smad2, так и Smad3, которые близки, тогда как ALK1 и BMP типа I рецепторы ALK2, ALK3 и ALK6 все направляют Smads 1, 5 и 8. Фосфорилированные R-Smads затем диссоциируют от рецепторов и формируют гетеромерные комплексы с co-Smad, Smad4. Хотя у млекопитающих имеется только одна co-Smad, у Xenopus же идентифицирована вторая co-Smad, Smad4β. R-Smad-co-Smad гетеромерный комплекс затем транслоцируется в ядро, чтобы модулировать активность специфических промоторов. Хотя Smads могут непосредственно связываться с ДНК с низким сродством, но они влияют на взаимодействия с различными ДНК-связывающими партнерами, чтобы найти специфические гены-мишени для транскрипционной регуляции. Напр., TGFβ/activin-регулируемые Smads, Smad2 и Smad3, непосредственно ассоциируют с ДНК-связывающими партнерами, такими как FoxH1 (FAST), AP-1, TFE3, Sp1, Mixer, Runx2, LEF1/TCF и Miz1. Значительно меньше известно о связываемых партнерах BMP-регулируемых Smads, но идентификация ядерных партнеров квлючает OAZ, Runx2 и Hoxc-8/9. Будучи локализованные на соотв. мишенях-промоторах, Smads м. затем позитивно или негативно регулироватьтранскрипционную активность путем поставки ко-акиваторов, таких как CBP/p300, или корепрессоров, включая TGIF и Ski/Sno, которые связывают deacetylases. В отличие от R-Smads, I-Smads, Smad6 и Smad7, являются мощными антогонистами TGFβ сигнального пути. I-Smads, которые не имеют С-терминального SSXS мотива, функционируют за счет стабильного связывания, чтобы активировать рецепторный комплекс, и таким образом блокировать доступ к и фосфорилирование соотв. R-Smads с помощью I типа рецепторных киназ. Кроме того, Smad7 м. одновременно индуцировать ubiquitin-обусловленную деградацию активного рецепторного комплекса благодаря своей способности поставлять Smurfs, членов семейства C2-WW-HECT domain E3 лигаз. В отличие от R- и co-Smads, которые транслоцируются из цитоплазмы в ядро после активации сигнального пути, Smad7 располагается в ядре, а стимуляция лигандом вызывает его экспорт в цитоплазму, где он связывается с рецепторами, чтобы проявить свои ингибирующие эффекты. В дополнение к TGFβ-независимым сигналам, экспрессия I-Smad генов стимулируется с помощью TGFβ и BMPs, тем самым создается негативная обратная связь пути. Important mutants 5 из 8 Smad генов удалось нарушить с помощью гомологичной рекомбинации у мышей (Табл. 2). Мыши без Smad2, Smad4, или Smad5 обнаруживали ранний летальный фенотип. В случаеSmad2 и Smad4, нулевые мутантные мыши имели дефекты в индукции мезодермы и в формировании передне-задней оси, тогда как Smad5 нулевые мыши погибали позднее, между 9 и 11.5 днем эмбриогенеза и обнаруживали дефекты ангиогенеза. Напротив, Smad3-дефицитные мыши были жизнеспособны. Целенаправленные изменения гена Smad3 давали разные фенотипы, включая дефекты T-клеток или реактивности спленоцитов, возникновение colorectal опухолей и возникновение б-ни дегенерации суставов, напоминающей остеоартрит. Мыши без ингибирующего Smad Smad6 имели сердечно-сосудистые аномалии, включая гиперплазию сердечных клапанов и дефекты разделения тракта оттока, указывая тем самым, что Smad7 не может заменить Smad6 даже несмотря на то, что оба экспрессируются в сердечно-сосудистой системе на высоком уровне. Фенотип мышей без Smads 1, 7 и 8 неустановлен. Мыши, гетерозиготные по Smad2, Smad3 или Smad4 также обладают варьирующими дефектами,это указывает на то, что важна доза гена Smad. TGFβ является мощным ингибитором пролиферации клеток для большинства нормальных типов клеток, указывая тем самым, что потеря TGFβ реактивности м.б. важной ступенью во время развития опухолей. В соответствии с этим, мутации Smads вовлечены в ряд опухолей у человека. Smad4 первоначально был идентифицирован как ген сильного опухолевого репрессора в панкреатических карциномах, его мутации выявлены и в colorectal, легочных и панкреатических опухолях. Smad4 мутации обнаруживаются также в семьях с familial juvenile polyposis, с наследуемым синдромом, ассоциированым с высоким риском желудочно-кишечных опухолей. Гетерозиготные Smad4 мыши имеют кишечный полипоз и инвазивные карциномы. Мутации Smad2 также встречаются в colorectal и легочных опухолях. Т.о., Smads которые обеспечивают передачу сигналов от TGFβ, по-видимому, представляют собой класс tumor-suppressor генов, важных для канцерогенеза у человека. Frontiers Итак, предложена молекулярная модель, объясняющая как Smads передают сигналы от сверхсеейства TGFβ (Рис. 2). Теперь усилия направлены на выяснение как контролируется локализация Smads и их ассоциации с др. белками. Фосфорилирование Smads с помощью TGFβ рецепторного комплекса является существенным для инициации сигнального каскада, а доставка R-Smads к рецепторам, как полагают, облегчается с помощью SARA, днако субклеточный компартмент, где эти события происходят, и даже то, имеется ли SARA-подобрный белок для BMP-регулируюмых Smads, неизвестно. Неясно также как проявляются активности Smads в ядре. Известно, что Smads ассоциируют с E3 ubiquitin-ligases, следовательно, ubiquitinated и деградируют, а значит м. слудить адапторами, обеспечивая ubiquitin-обусловливаемую деградацию др. белков. Важно понять, как клетки поддерживают деликатный баланс между Smad и уровнями ubiquitin-ligase белков, чтобы гарантировать соотв. чувствительность к сигналам сверхсемейства TGFβ. Хотя известно, что Smads функционируют в ядре ка регуляторы транскрипции, однако не совсем понятно, что детерминируется, когда Smads позитивно или негативно регулируют транскрипцию. Мало известно о ДНК-связывающих партнераъх для BMP-регулируемых Smads. Клетки одновременно получают множество сигналов и известны взаимодействия компонентов TGFβ пути с эффекторами др. сигнальных путей. Необходимо понять как и зачем Smads общаются с др. сигнальными путями. Продолжается поиск новых белков, взаимодействующих с Smad, они возможно прольют свет на существующие paradigms. Члены сверхсемейства TGFβ играют критическую роль в многочисленных онтогенетических событиях от детерминации клеточной судьбы до органогенеза, важно понять эти события. За исключением Smad3 и Smad6 мыши, дефицитные по Smads погибают в раннем эмбриогенезе; необходимо понять их роль, для этого необходимо получить условные мутантные аллели. Передача сигналов TGFβзадействована в широком круге нарушений у человека, включая фиброз, гипертензию,остеопороз, атеросклероз и рак. Кроме того, мутации компонентов сиогнального пути TGFβ ассоциированы с наследственными болезнями, включая синдром сохранения Miillerian протоков, наследственную hemorrhagic telangiactasia, наследственную chondrodysplasia, семейную первичную pulmonary hypertension и наследственный non-polyposis colorectal cancer. Из Smads, лишь Smad4 ассоциирует с наследственными болезнями, а именно, с juvenile polyposis syndrome. Важно выяснить др. наследственные синдромы, связанные с мутациями Smads.

Gene organization and evolutionary history

Smads являются группой родственных внутриклточных белков, важных для передачи сигналов в ядро от членов сверхсемейства transforming growth factor-β (TGFβ) на клеточной поверхности. Хотя и родственны др., но Smads структурно отличны от др. внутриклеточных эффекторных белков. Прототипические члены семейства Smad, Mad и Sma, впервые были описаны у Drosophila и Caenorhabditis elegans, соотв. Родственные белки у Xenopus, человека, мышей и крыс были затем идентифицированы и все члены семейства теперь известны как Smads. Родственные белки описаны и у рыбок данио и паразитических гельминтов Schistosoma mansoni. Smads, которые содержат от 400 до 500 аминокислот, м.б. сгруппированы в 3 подсемейства, receptor-regulated Smads (R-Smads), common Smads (co-Smads) и inhibitory Smads (I-Smads), каждое из которых играет определенную роль (Рис. 1). Представительные члены всех трех подсемейств идентифицированы у большинства видов животных и наивысшая степень консервации наблюдается между членами каждого подсемейства. Напр., Drosophila Mad и Smad1 человека, члены R-Smad подгруппы, имеют 82% идентичных аминокислотных последовательностей. Между подсемействами, наивысшая степень консервации наблюдается для С-терминального Mad homology 2 (MH2) домена, с идентичными аминокислотными последовательностями от 32% до 97% у Smads человека.

Имеется 8 членов семейства Smad family у млекопитающих поиски в базе данных генома человека подтверждают, что это полный комплект. 8 Smad генов человека картируются в 4-ой хромосоме(Табл. 1). Три Smad гена – Smad2, Smad4 и Smad7 – образуют тесный кластер в 18q21.1, области, которая часто делетируется при опухолях у человека. Три обнаружены на хромосоме 15, Smad3 и Smad6 картированы в 15q21-22 и Smad5 в 15q31. ОстальныеSmad гены, Smad1 и Smad8, локализованы в хромосоме 4 и 13, соотв. Интрон-экзонные границы для большинства Smad генов определены или в геноме мыши или геноме человека, и во всех случаях гены состоят из 6–12 экзонов. Альтернативно сплайсированные виды мРНК описаны для Smads 2, 4, 5, 6 и 8.

Characteristic structural features

Большинство Smads имеет два законсервированных домена на их N- (MH1) и С-конце (MH2), которые разделены богатой пролином линкерной областью варьирующей длины (Рис. 1a,b,c). У ингибирующих Smads, Smad6 и Smad7 и DAD, MH1 домены замещены дивиргентными N-концами, которые имеют области сходствавнутри ингибирующей подгруппы Smad. Хотя структура полной длины Smad еще не определена, но кристаллографический анализ отдельных доменов Smad прливает свет на важные структурные особенности MH1 и MH2 доменов (Рис. 1b,c).

The MHI domain

Определенные R- и co-Smads обладают ДНК-связывающей активностью, связывают стержневые ДНК консенсусные последовательности GNCN. Хотя это взаимодействие с довольно низкой специфичностью, связывание ДНК, как установлено, жизненно необходимо для транскрипционной активации специфических генов-мишеней. Кристаллическая структура MH1 домена Smad3 соединенная с 8 парами оснований Smad-связывающего элемента (GTCTGTCT) демонстрирует, что MH1 домен образует компактную глобулярную складку, которая использует высоко законсервированную в 11-остатков β шпильку для контакта с большой бороздой ДНК (Рис. 1b). У Smad2, 30 аминокислотная инсерция, кодируемая экзоном 3, как полагают, замещает β-hairpin петлю, что дает структурное объяснение отсуствию ДНК-связывающей активности у Smad2.

Smad-зависимая активация мишеней-промоторов зависит от транслокации R-Smad-co-Smad комплексов из цитоплазмы в ядро. R-Smads вступает в ядро после рецептором-опосредованного фосфорилирования, тогда как Smad4 нуждается в ассоциации с R-Smad партнером для накопления в ядре. Основна спираль helix (H2) в домене MH1, представленая типичным сигналом ядерной локализации (KKLKK), существенна для ядерного импорта Smad3 (Рис. 1b). Транслокация Smad3 в ядро нуждается во взаимодействии с importin β, интересно отметить, что присутствие инсерции, кодируемой экзоном 3, в домене MH1 Smad2 предупреждает его взаимодействие с with importin β. Все это подтверждает, что др. детерминанты, такие как MH2 домен м. также участвовать в регуяции накопления в ядре R-Smads. Взаимодействие Smads с некоторыми транскрипционными факторами, включая Jun, TFE3, Sp1 и Runx, также м. происходить в MH1 домене; детальный анализ детерминант для этого типа взаимодействий не проведен.

The MH2 domain

Домен MH2 не связывает ДНК, он является многофункциональной областью, которая обеспечивает дифференциальную ассоциацию с широким разнообразием белков. Многие из этих взаимодействий служат для обеспеченияспецифичности и избирательрости функции Smad. Первая кристаллическая структура Smad MH2 домена было установлена для co-Smad Smad4. Было показано, что MH2 домен представлен пятью α спиралями (H1 - H5) и тремя петлями (L1, L2 и L3), которые заключают β sandwich (Рис. 1c). Smads существуют как мономеры и тримеры и хотя имеются некоторые противоречия о точом составе, стоихометрии и формировании олигомеров, довольно ясно, что домен MH2 является критическим для обеспечения взаимодействия волигомерах. Анализ трехмерного Smad4 кристалла показывает, что loop-helix область (L1, L2, L3 и H1) одной субъединицы осуществляет экстенсивные контакты с трех-спиральным пучком (H3, H4 и H5) др. субъединицы и что многие законсервированные остатки в Smads расположены внутри тримерного интерфейса.

Передача TGFβ сигналов обеспечивается за счет прямой ассоциации R-Smads с TGFβ рецепторным комплексом. R-Smads затем непосредственно фосфорилируются с помощью типа I TGFβ рецепторной киназы, по крайней мере, по двум серинам законсервированного SSXS мотива, локализованного на самом конце С домена MH2. Установлено, что взаимодействия специфических Smad с рецепторами опосредуются с помощью L3 петли R-Smads и L45 петли в типа I рецепторе. Структура Smad2 MH2 домена была кристализована в комплексе со Smad-binding domain (SBD) of SARA (Smad anchor for receptor activation), белком, чьей функцией является рекрутация Smads на TGFβ рецепторы. Общая топология R-Smad MH2 домена сходна с таковой, что у Smad4, но R-Smads кроме того имеют карман на одной поверхности, которая расположена по соседсту с петлей 3. Т.к. Smad4 не взаимодействует с рецепторами, то считается, что этот basic карман м. служить местом-доком для фосфорилированного и активированного типа I рецептора. Кристаллическая структура Smad2 MH2 домена в комплексе с SARA SBD также обнаруживает необычайное расположение, при котором в 40-остатков SBD находятся в расправленной конформации, которая формирует богатую пролином спираль, α helix и a β нить. котрые контактируют с тремя спиральными пучками (H3, H4 и H5), и β нитью Smad2 MH2 домена. Считается, что взаимодействие SARA с β листком необходимо для специфичности, тогда как контакт с трехспиральным пучком вносит вклад в сродство связывания. Пока неясно, могут ли др. белки, которые взаимодействуют с Smad MH2 доменом также принимать форму, соответствующую взаимодействующей поверхности; функциональные исследования покзали, что α-спираль 2 домена MH2 важна для взаимодействия Smad2 с транскрипционным фактором FAST (FoxH1).

The Smad linker region

Линкерная область, которая соединяет MH1 и MH2 домены содержит ряд важных пептидных мотивов. Они включают потенциальные сайты для фосфорилирования с помощью mitogen-activated protein kinases (MAPKs) – это фосфорилирование м блокировать функцию R-Smad – и сигнал ядерного экспорта, локализованный внутри экзона 3 co-Smad Smad4. R-Smads и I-Smads также содержат законсервированный proline-tyrosine (PY) мотив, который обеспечивает взаимодействие с WW доменами в Smad-взаимодействующих белках Smurf1 и Smurf2. Smurfs являются E3 ubiquitin лигазами с C2-WW-HECT класса доменом, который катализирует ubiquitin-опосредованную деградацию определенных Smads и Smad-ассоциированных белков, включая ядерные онкопротеины SnoN и TGFβ-рецепторный комплекс. Линкерная область Smad4 также содержит Smad activation domain (или SAD), который необходим для транскрипционной активации. Кристаллическая структура фрагмента Smad4, который включает SAD aи MH2 домен, показала, что SAD контактирует со Smad4-специфическими последовательностями в домене MH2. Это стабилизирует богатое глютамином α-спиральное расширение, названное TOWER, которое, вместе с пролин-богатым SAD, м. формировать поверхность транскрипционной активации.

Localization and function

Developmental expression patterns

в целом, все Smads широко экспрессируются в ходе всего эмбрионального развития и в большинстве взрослых тканей и типов клеток. Анализ мышиных эмрионов покзал, что имеются некоторые вариации в паттерне, времени и уровнеэкспрессии индивидуальных Smads. Напр., ингибирующие Smads, Smad6 иSmad7, экспрессируются на высоком уровне в развивающейся сердечно-сосудистой системе, хотя каждый кроме того обладает определенным паттерном экспрессии и в др. тканях, включая intramembranous кости и тестисы. Сo-Smad Smad4 повсеместно экспрессируется в ходе всего эмбрионального развития с особенно высоким уровенм в эпителиальных киптах кишечника. R-Smads обнаруживают перекрываеющиеся паттерны экспрессии; по крайней мере, один из BMP-регулируемых Smads (Smad1, Smad5 и Smad8) и одby bp TGFβ/activin-регулируемы[ Smad (Smad2 или Smad3) экспрессируется в каждой ткани.

Function

Члены сверхсемейства TGFβ передают сигналы, индуцируя стабильный ансамбль из гетеромерных комплексов трансмембранного типа I и II serine/threonine-kinase рецепторов. Внутри этого комплекса типа II рецепторная киназа фосфорилирует типа I рецептор, который затем инициирует передачу сигнала далее вниз по пути Smad. Smads затем передают сигналы TGFβ от клеточной поврехности в ядро.

Каждый класс Smads играет определенную роль в сингальном пути (Рис. 2). Активированые типа I рецепторы ассоциируют со специфичесими R-Smads и фосфорилируют, по крайней мере, по двум серинам в законсервированном С-терминальном SSXS мотиве. Распознавание разных R-Smads с помощью различного типа I рецепторных киназ высоко специфично. Т.обр., TGFβ и activin типа I рецепторы, TβRI (ALK5) и ActRIB (ALK4), соотв., активируют как Smad2, так и Smad3, которые близки, тогда как ALK1 и BMP типа I рецепторы ALK2, ALK3 и ALK6 все направляют Smads 1, 5 и 8. Фосфорилированные R-Smads затем диссоциируют от рецепторов и формируют гетеромерные комплексы с co-Smad, Smad4. Хотя у млекопитающих имеется только одна co-Smad, у Xenopus же идентифицирована вторая co-Smad, Smad4β.

R-Smad-co-Smad гетеромерный комплекс затем транслоцируется в ядро, чтобы модулировать активность специфических промоторов. Хотя Smads могут непосредственно связываться с ДНК с низким сродством, но они влияют на взаимодействия с различными ДНК-связывающими партнерами, чтобы найти специфические гены-мишени для транскрипционной регуляции. Напр., TGFβ/activin-регулируемые Smads, Smad2 и Smad3, непосредственно ассоциируют с ДНК-связывающими партнерами, такими как FoxH1 (FAST), AP-1, TFE3, Sp1, Mixer, Runx2, LEF1/TCF и Miz1. Значительно меньше известно о связываемых партнерах BMP-регулируемых Smads, но идентификация ядерных партнеров квлючает OAZ, Runx2 и Hoxc-8/9. Будучи локализованные на соотв. мишенях-промоторах, Smads м. затем позитивно или негативно регулироватьтранскрипционную активность путем поставки ко-акиваторов, таких как CBP/p300, или корепрессоров, включая TGIF и Ski/Sno, которые связывают deacetylases.

В отличие от R-Smads, I-Smads, Smad6 и Smad7, являются мощными антогонистами TGFβ сигнального пути. I-Smads, которые не имеют С-терминального SSXS мотива, функционируют за счет стабильного связывания, чтобы активировать рецепторный комплекс, и таким образом блокировать доступ к и фосфорилирование соотв. R-Smads с помощью I типа рецепторных киназ. Кроме того, Smad7 м. одновременно индуцировать ubiquitin-обусловленную деградацию активного рецепторного комплекса благодаря своей способности поставлять Smurfs, членов семейства C2-WW-HECT domain E3 лигаз. В отличие от R- и co-Smads, которые транслоцируются из цитоплазмы в ядро после активации сигнального пути, Smad7 располагается в ядре, а стимуляция лигандом вызывает его экспорт в цитоплазму, где он связывается с рецепторами, чтобы проявить свои ингибирующие эффекты. В дополнение к TGFβ-независимым сигналам, экспрессия I-Smad генов стимулируется с помощью TGFβ и BMPs, тем самым создается негативная обратная связь пути.

Important mutants

5 из 8 Smad генов удалось нарушить с помощью гомологичной рекомбинации у мышей (Табл. 2). Мыши без Smad2, Smad4, или Smad5 обнаруживали ранний летальный фенотип. В случаеSmad2 и Smad4, нулевые мутантные мыши имели дефекты в индукции мезодермы и в формировании передне-задней оси, тогда как Smad5 нулевые мыши погибали позднее, между 9 и 11.5 днем эмбриогенеза и обнаруживали дефекты ангиогенеза. Напротив, Smad3-дефицитные мыши были жизнеспособны. Целенаправленные изменения гена Smad3 давали разные фенотипы, включая дефекты T-клеток или реактивности спленоцитов, возникновение colorectal опухолей и возникновение б-ни дегенерации суставов, напоминающей остеоартрит. Мыши без ингибирующего Smad Smad6 имели сердечно-сосудистые аномалии, включая гиперплазию сердечных клапанов и дефекты разделения тракта оттока, указывая тем самым, что Smad7 не может заменить Smad6 даже несмотря на то, что оба экспрессируются в сердечно-сосудистой системе на высоком уровне. Фенотип мышей без Smads 1, 7 и 8 неустановлен. Мыши, гетерозиготные по Smad2, Smad3 или Smad4 также обладают варьирующими дефектами,это указывает на то, что важна доза гена Smad.

TGFβ является мощным ингибитором пролиферации клеток для большинства нормальных типов клеток, указывая тем самым, что потеря TGFβ реактивности м.б. важной ступенью во время развития опухолей. В соответствии с этим, мутации Smads вовлечены в ряд опухолей у человека. Smad4 первоначально был идентифицирован как ген сильного опухолевого репрессора в панкреатических карциномах, его мутации выявлены и в colorectal, легочных и панкреатических опухолях. Smad4 мутации обнаруживаются также в семьях с familial juvenile polyposis, с наследуемым синдромом, ассоциированым с высоким риском желудочно-кишечных опухолей. Гетерозиготные Smad4 мыши имеют кишечный полипоз и инвазивные карциномы. Мутации Smad2 также встречаются в colorectal и легочных опухолях. Т.о., Smads которые обеспечивают передачу сигналов от TGFβ, по-видимому, представляют собой класс tumor-suppressor генов, важных для канцерогенеза у человека.

Frontiers

Итак, предложена молекулярная модель, объясняющая как Smads передают сигналы от сверхсеейства TGFβ (Рис. 2). Теперь усилия направлены на выяснение как контролируется локализация Smads и их ассоциации с др. белками. Фосфорилирование Smads с помощью TGFβ рецепторного комплекса является существенным для инициации сигнального каскада, а доставка R-Smads к рецепторам, как полагают, облегчается с помощью SARA, днако субклеточный компартмент, где эти события происходят, и даже то, имеется ли SARA-подобрный белок для BMP-регулируюмых Smads, неизвестно. Неясно также как проявляются активности Smads в ядре. Известно, что Smads ассоциируют с E3 ubiquitin-ligases, следовательно, ubiquitinated и деградируют, а значит м. слудить адапторами, обеспечивая ubiquitin-обусловливаемую деградацию др. белков. Важно понять, как клетки поддерживают деликатный баланс между Smad и уровнями ubiquitin-ligase белков, чтобы гарантировать соотв. чувствительность к сигналам сверхсемейства TGFβ. Хотя известно, что Smads функционируют в ядре ка регуляторы транскрипции, однако не совсем понятно, что детерминируется, когда Smads позитивно или негативно регулируют транскрипцию. Мало известно о ДНК-связывающих партнераъх для BMP-регулируемых Smads.

Клетки одновременно получают множество сигналов и известны взаимодействия компонентов TGFβ пути с эффекторами др. сигнальных путей. Необходимо понять как и зачем Smads общаются с др. сигнальными путями. Продолжается поиск новых белков, взаимодействующих с Smad, они возможно прольют свет на существующие paradigms.

Члены сверхсемейства TGFβ играют критическую роль в многочисленных онтогенетических событиях от детерминации клеточной судьбы до органогенеза, важно понять эти события. За исключением Smad3 и Smad6 мыши, дефицитные по Smads погибают в раннем эмбриогенезе; необходимо понять их роль, для этого необходимо получить условные мутантные аллели.

Передача сигналов TGFβзадействована в широком круге нарушений у человека, включая фиброз, гипертензию,остеопороз, атеросклероз и рак. Кроме того, мутации компонентов сиогнального пути TGFβ ассоциированы с наследственными болезнями, включая синдром сохранения Miillerian протоков, наследственную hemorrhagic telangiactasia, наследственную chondrodysplasia, семейную первичную pulmonary hypertension и наследственный non-polyposis colorectal cancer. Из Smads, лишь Smad4 ассоциирует с наследственными болезнями, а именно, с juvenile polyposis syndrome. Важно выяснить др. наследственные синдромы, связанные с мутациями Smads.

The Smads

Gene organization and evolutionary history

Characteristic structural features

Localization and function