TAF_II250

TAF_II250: a transcription toolbox David A. Wassarman and Frank Sauer J.Cell Sci 114, N 16. 2895-2902 (2001)
Неспособность general transcription factors (GTFs) добраться до хроматина, ДНК закрученая вокруг повторяющихся нуклеосом, состоящих из стрежневых гистонов H2A, H2B, H3 и H4, указывют на то, что обязательной ступенью для инициации транскрипции является изменение стурктуры хроматина. Два общих класса комплекс/энзимы участвуют в событиях изменения хроматина: АТФ-зависимые комплексы ремоделирования нуклеосом(напр., SWI/SNF, RCS, ACS, CHRAC, NURF, и Mi-2/ NURD) и энзимы, модифицирующие гистоны (напр., histone acetyltransferases (HATs) и histone deacetylases (HDACs). Хотя порядок действия хроматин ремодулирующих/модифицирующих комплексов во время активации транскрипции м.б. ген-специфичным, их взаимозависимая активность, по-видимому, предшествует и облегчает связывание TFIID, который вместе с TFIIB являются единственными копонентами preinitiation complex (PIC), который мю связываться специфически со стрежневой промоторной ДНК. TAF_II250 является одним из 10-12 TATA-binding protein (TBP)-associated factors(TAF_IIs), который комплексуется с TBP в TFIID. Связывание TFIID с corepromoter, окружающим точку старта транскрипции gene nucleates assembly в PIC, который содержит RNA polymerase II (RNA polII) и GTFs TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF и TFIIH . Функция nucleating TFIID, как полагают, представлена несколькими определенными активностями: (1) зависимое от активатора распознавание сиквенс элементов стрежневой промоторной ДНК; (2) генерация хроматиновых условий таких, которые бы были благоприятны для сборки PIC инициации транскрипции; и (3) структурной модификации GTFs для облегчения сборки PIC и инициации транскрипции. TAF_II250 вносит вклад в каждую из этих TFIID активностей. (Рис.1.) \| A schematic diagram of metazoan TAF_II250. (Рис.2.) \| A four-step model for how TAF_II250 contributes to transcriptional activation.	TAF_II250 is a broadly acting regulator of transcription TAF_II250 является существенным белком у дрожжей, плодовых мушек, в линиях клеток хомячков и очевидно у всех эукариотических организмов. Гомологи обозначены TAF_II130 и TAF_II145 у дрожжей, TAF_II230 и TAF_II250 у Drosophila, и TAF_II250 и cell cycle gene1 (CCG1) у млекопитающих. Здесь мф будем использовать TAF_II145 и TAF_II250 для обозначениф дрожжевого и metazoan белков, соотв. Инактивация TAF_II145 у дрожжей или TAF_II250 в клеточной линии хомячков вызывает арест в G1 фазе клеточного цикла, а нулевые мутации у Drosophila TAF_II250 ведут к гибели во время эмбриогенеза или раннего линочного развития. Более того, гомозиготные мутантные клоны TAF_II250 не образуются у Drosophila, это указыает на то, что он участвует в пролифереции или выживаемости клеток. Это м.б. связано с потребностью в TAF_II250 во время RNA-pol-II-зависимой транскрипции. У Drosophila, TAF_II250 экспрессируется во всех ядрах и соединяется с большим числом эухроматиновых сайтов в политенных хромосомах. У дрожжей экспрессия 14-27% RNA-pol-II-транскрибируемых генов подавляется вдвое при инактивации TAF_II145. Наконец, в ts13 клетках хомячка с температуро-чувтвительным аллелем TAF_II250, сходный анализ выявляет, что транскрипция 18% генов, транскрибируемых с помощью RNA pol II, подавляется вдове при непермиссивной температуре. Многие гены, обнаруживающие TAF_II250-зависимую экспрессию кодируют белки, участвующие в регуляции клеточного цикла и в контроле роста. TAF_II250 должен играть болеважную роль в транскрипции, чем это предполагается, т.к. температуро-чувствительные мутации не м. инактивровать все функции TAF_II250. Растет лист факторов, которые м. высвободить клеточный цикл из ареста, или блокировать апоптоз вts13 или tsBN462 клетках хомячка, которые содержат идентичные glycine-to-aspartate миссенс-мутации в TAF_II250. Этот лист включает вирусные белки (simian virus40 (SV40), большой Т антиген, hepatitisB virus pX, human cytomegalovirus (HCMV), immediate-early (IE) белки IEP86 and IEP72 и human papilloma virus (HPV) 16 E7 и клеточные белки (E2F-1, CIITA и D-type cyclins. Участвуют два отдельных механизма: избыточная экспрессия вирусных белков или CTIIA восстанавливает клетки путем активирования TAF_II250-зависимых промоторовв отсутствие функционального TAF_II250, тогда как избыточная экспрессия E2F-1 и D-type циклинов восстанавливает клетки путем востановления активности нижестоящих TAF_II250 мишеней. SV40 large T antigen, HCMV, IE и CIITA белки связывают TAF_IIs in vitro и in vivo, а мутации, которые затрагиваюи их взаимодействия с TAF_II неспособны восстанавливать ts13 или tsBN462 транскрипционные дефекты. Более того, восстановление с помощью CTIIA зависит от ацетилтрансферазной активности. Т.к. TAF_II250 acetyltransferase активность нарушена в tsBN462 клетках, то это указывает на то, что CIITA замещает TAF_II250 выполняя две его функции: ассоциацию с TFIID ацетилирование белков. Т. обр., др вирусные и клеточне, белки которые восстанавливают ts13 или tsBN462 клеточне дефекты и ассоциируют с TFIID м. также быть ацетилтрансферазой или взаимодействовать с ацетилтрансферазой. TAF_II250 is not the only scaffold for TFIID in vivo Комплекс TFIID держится вместе благодаря TAF_II-TAF_II и TAF_II-TBP взаимодействиям. В частности, Drosophila TAF_II250 вовлечен в строгие взаимодействия с TBP, TAF_II30α, TAF_II30ß, TAF_II60, TAF_II80,TAF_II110 and TAF_II150 (Рис. 1). Иммобилизированный TAF_II250 м. служить как остов для сборки TFIID субкомплексов и holo-TFIID из рекомбинантных субъединиц, которые указывают на то, что сборка и интеграция TFIID зависят от TAF_II250. Соотв., инактивация TAF_II250 у дрожжей ведет к деградации др. субъединиц TFIID. Однако, инактивация всех исследованных TAF_IIs вызывает деградацию др. TAF_IIs, это указывает на то, что каждый TAF_II необходим для интеграции TFIID in vivo. TAF_II250 function is regulated by activators Первоначальная находка, что TFIID, но не TBP, м. опосредовать активатор-управляемую транскрипцию в восстановленной RNA pol II системе указывала на то, что одна функция TAF_IIs отвечает на энхансером-связанные активаторы. В случае TAF_II250, взаимодействия активаторов увеличивают оккупацию промотора TFIID (т.е. рекрутацию) и модулируют TAF_II250 регуляторную и энзиматическую активности (т.е. регуляцию). Физические взаимодействия между TAF_II250 и активаторами являются критическим компонентом этого механизма. TAF_II250 связывает активаторы (напр., HIV Tat, adenovirusE1A ), Herpes simplex virus type 1 ICP4 и JUN ), и др. транскрипционные регуляторы (retinoblastoma tumor suppressorprotein RB, MDM2 proto-oncogeneи cyclin D ) (Рис. 1). Отдельная линия доказательств точки зрения на механизм, с помощью которого активаторы связываются с TAF_II250 чтобы соединить TFIID с определенными промоторами (Рис. 2).(1) Область ICP4, необходимая для транскрипционных активаций, нужна также для ассоциации TAF_II250.(2) Ген-специфическая оккупация промотора TAF_II145 у дрожжей увеличивается в ответ на сигнал активации и снижается после удаления энхансерного сайта.(3) Энхансеры м. вызвать TAF_II250 зависимость промоторов, которые обычно TAF_II250 независимы. Однажды рекрутированный на промотор, TAF_II250 должен участвовать в сборке PIC путем связывания с RAP74 субъединицей (обозначаемой также TFIIFα из TFIIF, на это указывает то, что TAF_II250 мутанты, которые неспособны взаимодействовать с RAP74 неспособны восстанавливать ts13 днфекты клеточного цикла. Соединение TFIID с определенным геном посредством активатор-TAF_II250 связывания обладает преимуществами, поскольку TFIID ограничен в клетках. Важность TAF_II250 взаимодействий с активаторами и GTFs указывает на то, что TAF_II250 фукнкционирует как классический ко-активатор, который открывает дорогу активаторам к сборке PIC . Имеются также подтверждения механизма, при котором активаторы модифицируют активности TAF_II250, чтобы усилить формирование или стабильность PIC на промоторе ДНК (Рис. 2). Конкурентное взаимодействие между активаторами и TAF_II250 должны контролировать связывание TFIID со стержневыми промоторами. N-концы TAF_II250 связываются с ДНК-связывающей поверхностью TBP и ингибируют TBP-ДНК взаимодействия. Однако, кислые активаторы, JUN и TFIIA конкурируют с TAF_II250 за соединение с TBP, и тем самым меняют ДНК-связывающие свойства TFIID. Более того, некоторые репрессоры ингибируют TAF_II250 энзиматические активности, которые м. способствовать сборке PIC путем модификации структуры GTFs и хроматина. Соединение HIV Tat, активатора и репрессора транскрипции вирусного гена, с TAF_II250 ингибирует TAF_II250 HAT активность. Сходным образом, соединение RB с TAF_II250 ингибирует TAF_II250 N-терминальную киназную активность. Напротив, E1A и cyclin D1 супрессируют TAF_II250-kinase-inhibitory эффект RB. т.обр., регуляция активности TAF_II250 с помощью взаимодействий с активаторами и GTFs является интегральным по отноешнию к процессу активации транскрипции. TAF_II250 binds to core promoter initiator sequences Установлено, что TAF_II250 интимно контактирует со стержневым промоторным инициаторным элементом как в содержащих TATA-box, так и не содержащих TATA стержневых промоторах (Рис. 2). Инициатор (Inr) это элемент с законсервированными последовательностями, который охватывает стартовую точку транскрипции и м. управлять правильностью инициации транскрипции в отсутствие TATA box. Роль TAF_IIs в распознавании Inr подтверждается находкой, что TFIID, содержащий субъединицу TBP, которая не м. связываться с ДНК не м. функционировать на TATA-only промоторах, но м. поддерживать транскрипцию с TATA-less, Inr-содержащих промоторов. Область C-терминальная по отношению к HAT домену дрожжего TAF_II145 необходима для связывания промотора in vivo. In vitro, рекомбинатные TAF_II250-TAF_II150, TBP-TAF_II250 и TBP-TAF_II250-TAF_II150 комплексы эффективно связывают Inr-содержащие промоторы. Более того, TAF_II250-TAF_II150 комплекс м. поддерживать Inr-опосредованную транскрипцию и специфически соединяться с последовательностями, которые сочетаются с Inr консенсуной последовательностью из пула случайных последовательностей олигонуклеотидов. Эти результаты указывают на то, что TAF_II250 вместе с TAF_II150 обеспечивает связывание TFIID с Inr и что TBP несущественен для этой активности. Дальнейшим подтверждением является то, что TBP-free TFIID комплекс из клеток млекопитающих, который поддерживает транскрицию с TATA-less и TATA-содержащих промоторов, содержит Inr элементы. Анализ основных промоторов генов, чья экспрессия затрагивается мутациями TAF_II250, не поясняет роли TATA элемента в спецификации TAF_II250 зависимости. Некотрые TAF_II250-зависимые промоторы содержат нетрадиционный (nonconsensus) TATA элемент, тогда как др. содержат консенсусный TATA элемент. Инсерция канонического TATA элемента в TATA-less промотор м. обойти зависимость от TAF_II145, но мутация слабого TATA элемента в консенсусную последовательность не меняет потребности в TAF_II145.По-видимому, сложный код, состоящий из вкладов от TATA и Inr элементов основного промотора, специфицирует TAF_II250 зависимость. TAF_II250 post-translationally modifies histones and GTFs Показано, что TAF_II250 обладает протеин киназной, HAT, и ubiquitin-активирующей и -конъюгирующей энзиматическими активностями (Рис. 1, 2). Интересно, TAF_II250 не обладает существенным сходством последовательностей с др. членами этих семейств энзимов, это делает возможным предположить, что и др. TAF_IIs, и др. белки в целом обладают энзиматическими доменами, которые остаются неидентифицированными т.к. они не выявляются при анализе мотивов первичных последовательностей. TAF_II250 is a bipartite protein kinase TAF_II250 содержит два независимых serine/threonine протеин киназных домена: один на N-конце (NTK) и др. на С-конце (CTK; (Рис. 1). Киназная активность продемонстрирована in vitro для белков Drosophila, человека и дрожжей. Дрожжевые киназные домены располагаются в джвух отдельных белках. TAF_II145 и Bromodomainfactor 1 (Bdf1) содержат NTK и CTK, соотв. TAF_II250 NTK и CTK домены аутофосфорилируются, а NTK домен трансфосфорилирует RAP74 и большую субъединицу TFIIA (TFIIA-L) in vitro. RAP74 и TFIIA являются кандидатами на роль субстратов для TAF_II250 киназной активности и in vivo:эндогенный RAP74 гиперфосфорилируется;дефосфорилирование RAP74 снижает сго способность поддерживать транскрипционную элонгацию in vitro; а фосфорилирование TFIIA стимулирует формирование комплекса TFIIA-TBP-TATA-element in vitro (Рис. 2). Автофосфорилирование TAF_II250 м. также играть роль в регуляции транскрипции, как было показано для TFIIF. Несмотря на отсутствие определенного субстрата, ясно. что киназная активность необходима in vivo, т.к. рекомбинатный TAF_II250 белок, у которого отсутствует NTK домен не м. восстанавливать ts13 фенотипы. Более того, делеция CTK у Drosophila ведет к гибели.. TAF_II250 is a histone acetyltransferase and binds to acetylated histones Установлено. что TAF_II250 обладает HAT активностью. HAT домен картируется в центре наиболее законсервированной у metazoan TAF_II250 и в C-терминальной части дрожжевого TAF_II145 (Рис. 1). Выявлена корреляция между ацетилированием высоко законсервированного лизинового остатка в N-терминальных хвостах гистонов и активацией транскрипции. Одна модель объясняет, как ацетилирование гистонов влияет на экспрессию генов, исходя из того, что степень конденсации хроматина напрямую связана с уровнем ацетилирования гистонов. Соответственн, гиперацетилирование редуцирует сродство гистоновых хвостов к ДНК в результате образуется менее компактный хроматин и повышается доступность транскрипционных фактров к ДНК. In vitro, Drosophila TAF_II250 ацетилирует свободные гистоны и нуклеосомные гистоны слабо по сравнению с дрожжевой HAT1 и P/CAF человека. Lys14 гистона H3 является преимущественным сайтом ацетилирования, хотя др. лизиновые остатки в H3 и H4 являются прекрасным субстратом TAF_II250. TAF_II250 ацетилирует также TFIIEß и TFIIF in vitro. Способность мутантов TAF_II250 ацетилировать гистоны in vitro температуро-зависма, это указывает на то, что энзиматическая активность улаживается в ts13 клетках при непермиссвной температуре и что клеточный цикл и транскрипционные дефекты, наблюдаемые при непермиссивной температуре результат снижения HAT активности. Хотя гистоны и GTFs являются субстратами для TAF_II250 acetyltransferase активности in vitro, но неясно являются ли они субстратами, имеющими отношение к транскрипции. Две линии доказательств указывают на то, что гистоны м. и не быть имеющими к делу отношение субстратами: (1) активация транскрипции температуро зависима с нехроматиновых матриц в экстрактах ts13 клеток; и (2) ингибирование TAF_II250 ацетилтрнасферазной активности с помощью HIV Tat репрессирует транскрипцию с нехроматиновых матриц в экстрактах клеток HeLa. Т. обр., TAF_II250 acetyltransferase активность необходима in vitro , даже в отсутствие гистонов. Более того, TFIIEß и TFIIF м. не быть актуальными сусбстратами in vitro. Однако, остается открытым вопрос ацетилируются ли GTFs и гистоны с помощью TAF_II250 in vivo. Ацетилирование гистонов с помощью TAF_II250 in vivo могло бы вызывать локальные изменения структуры хроматина, чтобы увеличить доступность и связывание TFIID и др. PIC компонентов (Рис. 2). В дополнение к ацетилированию белков TAF_II250 связывает множественные ацетилированные гистоны с помощью двух тандемных bromodomains, расположенных в С-терминальной области белка (Рис. 1). Bromodomainis - мотив ~120-остатков, присутсвующий в разных белках, которые связаны с хроматином. TAF_II250 doublebromodomain (DBD) связывается наиболее тесно с гистоном H4, ацетилированным по lys5 и lys12 . Это согласуется с кристаллической структурой DBD, которая показывает, что имеющиеся карманы для acetyllysine расположены на расстоянии, эксивалентном семи остаткам. Следовательно, TAF_II250 bromodomains м.направлять TFIID к хроматин-упакованным промоторам (Рис. 2). TAF_II250 is a ubiquitin-activating/conjugating enzyme Недавно было продемонстрированао, что TAF_II250 обеспечиваетe monoubiquitination гистона H1, линекрного гистона, который соединяется с ДНК между соседними нуклеосомами. Invitro, monoubiquitination нуждается в последовательной активации ubiquitin-активрующих (E1) и ubiquitin-конъюгирующих (E2) энзимов. TAF_II250 обладает обеими этими активностями: он ковалентно связывается , посредством thioester мостика с ubiquitin АТФ-зависимым способом (E1 активность), и переносит активированый убмквитин на гистон H1 посредством изопептидного мостика (E2 активность). E1 и E2 активности Drosophila и человечьего TAF_II250 обнаруживаются в центральной области белка (Рис. 1). Интересно, что эта область отсутствует у дрожжевого TAF_II145 и Bdf1, тогда как гистон, подобный H1 (HHO1) у дрожжей обнаружен. Мутации Drosophila TAF_II250, которые нарушают гирстон H1 ubiquitination активность in vitro и in vivo выделедены при скрининге генов. которые модулируют способность Ras GTPase специфицировать судьбу клеток. Гены-мишени для TAF_II250 у Ras сигнальном пути не идентифицированы, но TAF_II250 мутации затрагивают транскрипцию в эмбрионе Drosophila , редуцируя экспрессию Dorsal и Caudal генов-мишеней. Неясно, как monoubiquitination гистона H1 с помощью TAF_II250 влияет на транскрипцию. Возможно H1 облегчает складывание нуклеосомных рядов в структуры высшего порядка, а ubiquitination меняет хроматин-связывающие свойства H1 и тем самым дестабилизирует как локальную, так и высшего порядка структуры и меняет взаимодействия между стержневыми гистонами и ДНК (Рис. 2). И в само деле, связывание гистона H1 с хроматином высоко динамично в живых клетках и модуляция связывающей активности H1 м.б. важной ступенью в регуляции доступа транскрипционнй кухни к ДНК . Т.к. TAF_II250 не нуждается в E3 ubiquitin-лигазе для убиквитилирования гистона H1 in vitro, то возможно он использует один для убиквитилияции др. белков in vivo. Кандидатом на роль такого энзима является MDM2 ubiquitin ligase, чье связывание с TAF_II250 коррелирует с активацией транскрипции. In vivo, MDM2 м. направлять E1 и E2 активности TAF_II250 на белки, такие как p53. Conclusions and perspectives: a model for the role of TAF_II250 during transcriptional activation На основании описанных выше исследований мы предлагаем следующую модель, как TAF_II250 регулирует экспрессию генов (Рис. 2). Сигнал, инструктирующий TFIID, где связатьсься с геномом, возможно идет от активаторов, которые связывают как cis-регуляторные области генов-мишеней, так и TFIID, чтобы поместить TFIID на определенные гены. TAF_II250 играет фундаментальную роль в этом процессе рекрутации, служа как партнер по связыванию для активаторов и как остов для др. TAF_II субъединиц TFIID. Более того, взаимодействия активатор-TAF_II250 м. регулировать время или субстрат специфичность энзиматической активности TAF_II250 Будучи рекрутированным, TFIID распознает и связывает основной core промотор. TAF_II250 играет двойственную роль в этом процессе, регулируя TBP-ДНК взаимодействия и, с помощью TBP и/или TAF_II150, распознает и связывается с Inr элементами. Арсенал TAF_II250 энзиматических функций м.б. применен и в этой точке, обеспечивая доступ к nucleosome-embedded core promoters. Потребности в индивидуальных TAF_II250 активностях д.б. ген-специфичными, т.к. нарушение NTK или HAT активности влияет на экспрессию разных генов. TAF_II250-обеспечивает monoubiquitination гистона H1 и ацетилирование гистонов H2B, H3 и H4, это м. вызывать динамические изменения в структуре хроматина, которые облегчают связывание TFIID. Связывание TAF_II250 двойного bromodomain с ацетилированными гистонами м стабилизировать взаимодействие TFIID с нуклеосомами во время процесса ремодлирования хроматина. Будичи связанным с ДНК, TFIID nucleates сборку PIC в стартовой точке транскрипции. TAF_II250-обусловленные структурные изменения в хроматине должны позволять взаимодействовать PIC с ДНК, которое необходимо для инициации и элонгации транскрипции. Во время или после сборки PIC TAF_II250 м. модифицировать TFIIFα и TFIIA-L путем фосфорилирования и TFIIEßи TFIIF путем ацетилирования, регулируя тем самым вклад TFIIA, TFIIE и TFIIF в инициацию транскрипции и элонгации. В заключение, эта простейшая модель описывает, как отдельный инструмент, содержащийся в TAF_II250 "toolbox" вносит вклад в превращение активирующего сигнала, получаемого TFIID в ферментативный синтез мРНК.

TAF_II250 is a broadly acting regulator of transcription

TAF_II250 является существенным белком у дрожжей, плодовых мушек, в линиях клеток хомячков и очевидно у всех эукариотических организмов. Гомологи обозначены TAF_II130 и TAF_II145 у дрожжей, TAF_II230 и TAF_II250 у Drosophila, и TAF_II250 и cell cycle gene1 (CCG1) у млекопитающих. Здесь мф будем использовать TAF_II145 и TAF_II250 для обозначениф дрожжевого и metazoan белков, соотв. Инактивация TAF_II145 у дрожжей или TAF_II250 в клеточной линии хомячков вызывает арест в G1 фазе клеточного цикла, а нулевые мутации у Drosophila TAF_II250 ведут к гибели во время эмбриогенеза или раннего линочного развития. Более того, гомозиготные мутантные клоны TAF_II250 не образуются у Drosophila, это указыает на то, что он участвует в пролифереции или выживаемости клеток.

Это м.б. связано с потребностью в TAF_II250 во время RNA-pol-II-зависимой транскрипции. У Drosophila, TAF_II250 экспрессируется во всех ядрах и соединяется с большим числом эухроматиновых сайтов в политенных хромосомах. У дрожжей экспрессия 14-27% RNA-pol-II-транскрибируемых генов подавляется вдвое при инактивации TAF_II145. Наконец, в ts13 клетках хомячка с температуро-чувтвительным аллелем TAF_II250, сходный анализ выявляет, что транскрипция 18% генов, транскрибируемых с помощью RNA pol II, подавляется вдове при непермиссивной температуре. Многие гены, обнаруживающие TAF_II250-зависимую экспрессию кодируют белки, участвующие в регуляции клеточного цикла и в контроле роста.

TAF_II250 должен играть болеважную роль в транскрипции, чем это предполагается, т.к. температуро-чувствительные мутации не м. инактивровать все функции TAF_II250.

Растет лист факторов, которые м. высвободить клеточный цикл из ареста, или блокировать апоптоз вts13 или tsBN462 клетках хомячка, которые содержат идентичные glycine-to-aspartate миссенс-мутации в TAF_II250. Этот лист включает вирусные белки (simian virus40 (SV40), большой Т антиген, hepatitisB virus pX, human cytomegalovirus (HCMV), immediate-early (IE) белки IEP86 and IEP72 и human papilloma virus (HPV) 16 E7 и клеточные белки (E2F-1, CIITA и D-type cyclins. Участвуют два отдельных механизма: избыточная экспрессия вирусных белков или CTIIA восстанавливает клетки путем активирования TAF_II250-зависимых промоторовв отсутствие функционального TAF_II250, тогда как избыточная экспрессия E2F-1 и D-type циклинов восстанавливает клетки путем востановления активности нижестоящих TAF_II250 мишеней. SV40 large T antigen, HCMV, IE и CIITA белки связывают TAF_IIs in vitro и in vivo, а мутации, которые затрагиваюи их взаимодействия с TAF_II неспособны восстанавливать ts13 или tsBN462 транскрипционные дефекты. Более того, восстановление с помощью CTIIA зависит от ацетилтрансферазной активности. Т.к. TAF_II250 acetyltransferase активность нарушена в tsBN462 клетках, то это указывает на то, что CIITA замещает TAF_II250 выполняя две его функции: ассоциацию с TFIID ацетилирование белков. Т. обр., др вирусные и клеточне, белки которые восстанавливают ts13 или tsBN462 клеточне дефекты и ассоциируют с TFIID м. также быть ацетилтрансферазой или взаимодействовать с ацетилтрансферазой.

TAF_II250 is not the only scaffold for TFIID in vivo

Комплекс TFIID держится вместе благодаря TAF_II-TAF_II и TAF_II-TBP взаимодействиям. В частности, Drosophila TAF_II250 вовлечен в строгие взаимодействия с TBP, TAF_II30α, TAF_II30ß, TAF_II60, TAF_II80,TAF_II110 and TAF_II150 (Рис. 1). Иммобилизированный TAF_II250 м. служить как остов для сборки TFIID субкомплексов и holo-TFIID из рекомбинантных субъединиц, которые указывают на то, что сборка и интеграция TFIID зависят от TAF_II250. Соотв., инактивация TAF_II250 у дрожжей ведет к деградации др. субъединиц TFIID. Однако, инактивация всех исследованных TAF_IIs вызывает деградацию др. TAF_IIs, это указывает на то, что каждый TAF_II необходим для интеграции TFIID in vivo.

TAF_II250 function is regulated by activators

Первоначальная находка, что TFIID, но не TBP, м. опосредовать активатор-управляемую транскрипцию в восстановленной RNA pol II системе указывала на то, что одна функция TAF_IIs отвечает на энхансером-связанные активаторы. В случае TAF_II250, взаимодействия активаторов увеличивают оккупацию промотора TFIID (т.е. рекрутацию) и модулируют TAF_II250 регуляторную и энзиматическую активности (т.е. регуляцию). Физические взаимодействия между TAF_II250 и активаторами являются критическим компонентом этого механизма. TAF_II250 связывает активаторы (напр., HIV Tat, adenovirusE1A ), Herpes simplex virus type 1 ICP4 и JUN ), и др. транскрипционные регуляторы (retinoblastoma tumor suppressorprotein RB, MDM2 proto-oncogeneи cyclin D ) (Рис. 1).

Отдельная линия доказательств точки зрения на механизм, с помощью которого активаторы связываются с TAF_II250 чтобы соединить TFIID с определенными промоторами (Рис. 2).(1) Область ICP4, необходимая для транскрипционных активаций, нужна также для ассоциации TAF_II250.(2) Ген-специфическая оккупация промотора TAF_II145 у дрожжей увеличивается в ответ на сигнал активации и снижается после удаления энхансерного сайта.(3) Энхансеры м. вызвать TAF_II250 зависимость промоторов, которые обычно TAF_II250 независимы. Однажды рекрутированный на промотор, TAF_II250 должен участвовать в сборке PIC путем связывания с RAP74 субъединицей (обозначаемой также TFIIFα из TFIIF, на это указывает то, что TAF_II250 мутанты, которые неспособны взаимодействовать с RAP74 неспособны восстанавливать ts13 днфекты клеточного цикла. Соединение TFIID с определенным геном посредством активатор-TAF_II250 связывания обладает преимуществами, поскольку TFIID ограничен в клетках. Важность TAF_II250 взаимодействий с активаторами и GTFs указывает на то, что TAF_II250 фукнкционирует как классический ко-активатор, который открывает дорогу активаторам к сборке PIC .

Имеются также подтверждения механизма, при котором активаторы модифицируют активности TAF_II250, чтобы усилить формирование или стабильность PIC на промоторе ДНК (Рис. 2). Конкурентное взаимодействие между активаторами и TAF_II250 должны контролировать связывание TFIID со стержневыми промоторами. N-концы TAF_II250 связываются с ДНК-связывающей поверхностью TBP и ингибируют TBP-ДНК взаимодействия. Однако, кислые активаторы, JUN и TFIIA конкурируют с TAF_II250 за соединение с TBP, и тем самым меняют ДНК-связывающие свойства TFIID. Более того, некоторые репрессоры ингибируют TAF_II250 энзиматические активности, которые м. способствовать сборке PIC путем модификации структуры GTFs и хроматина. Соединение HIV Tat, активатора и репрессора транскрипции вирусного гена, с TAF_II250 ингибирует TAF_II250 HAT активность. Сходным образом, соединение RB с TAF_II250 ингибирует TAF_II250 N-терминальную киназную активность. Напротив, E1A и cyclin D1 супрессируют TAF_II250-kinase-inhibitory эффект RB. т.обр., регуляция активности TAF_II250 с помощью взаимодействий с активаторами и GTFs является интегральным по отноешнию к процессу активации транскрипции.

TAF_II250 binds to core promoter initiator sequences

Установлено, что TAF_II250 интимно контактирует со стержневым промоторным инициаторным элементом как в содержащих TATA-box, так и не содержащих TATA стержневых промоторах (Рис. 2). Инициатор (Inr) это элемент с законсервированными последовательностями, который охватывает стартовую точку транскрипции и м. управлять правильностью инициации транскрипции в отсутствие TATA box. Роль TAF_IIs в распознавании Inr подтверждается находкой, что TFIID, содержащий субъединицу TBP, которая не м. связываться с ДНК не м. функционировать на TATA-only промоторах, но м. поддерживать транскрипцию с TATA-less, Inr-содержащих промоторов. Область C-терминальная по отношению к HAT домену дрожжего TAF_II145 необходима для связывания промотора in vivo. In vitro, рекомбинатные TAF_II250-TAF_II150, TBP-TAF_II250 и TBP-TAF_II250-TAF_II150 комплексы эффективно связывают Inr-содержащие промоторы. Более того, TAF_II250-TAF_II150 комплекс м. поддерживать Inr-опосредованную транскрипцию и специфически соединяться с последовательностями, которые сочетаются с Inr консенсуной последовательностью из пула случайных последовательностей олигонуклеотидов. Эти результаты указывают на то, что TAF_II250 вместе с TAF_II150 обеспечивает связывание TFIID с Inr и что TBP несущественен для этой активности. Дальнейшим подтверждением является то, что TBP-free TFIID комплекс из клеток млекопитающих, который поддерживает транскрицию с TATA-less и TATA-содержащих промоторов, содержит Inr элементы.

Анализ основных промоторов генов, чья экспрессия затрагивается мутациями TAF_II250, не поясняет роли TATA элемента в спецификации TAF_II250 зависимости. Некотрые TAF_II250-зависимые промоторы содержат нетрадиционный (nonconsensus) TATA элемент, тогда как др. содержат консенсусный TATA элемент. Инсерция канонического TATA элемента в TATA-less промотор м. обойти зависимость от TAF_II145, но мутация слабого TATA элемента в консенсусную последовательность не меняет потребности в TAF_II145.По-видимому, сложный код, состоящий из вкладов от TATA и Inr элементов основного промотора, специфицирует TAF_II250 зависимость.

TAF_II250 post-translationally modifies histones and GTFs

Показано, что TAF_II250 обладает протеин киназной, HAT, и ubiquitin-активирующей и -конъюгирующей энзиматическими активностями (Рис. 1, 2). Интересно, TAF_II250 не обладает существенным сходством последовательностей с др. членами этих семейств энзимов, это делает возможным предположить, что и др. TAF_IIs, и др. белки в целом обладают энзиматическими доменами, которые остаются неидентифицированными т.к. они не выявляются при анализе мотивов первичных последовательностей.

TAF_II250 is a bipartite protein kinase
TAF_II250 содержит два независимых serine/threonine протеин киназных домена: один на N-конце (NTK) и др. на С-конце (CTK; (Рис. 1). Киназная активность продемонстрирована in vitro для белков Drosophila, человека и дрожжей. Дрожжевые киназные домены располагаются в джвух отдельных белках. TAF_II145 и Bromodomainfactor 1 (Bdf1) содержат NTK и CTK, соотв.

TAF_II250 NTK и CTK домены аутофосфорилируются, а NTK домен трансфосфорилирует RAP74 и большую субъединицу TFIIA (TFIIA-L) in vitro. RAP74 и TFIIA являются кандидатами на роль субстратов для TAF_II250 киназной активности и in vivo:эндогенный RAP74 гиперфосфорилируется;дефосфорилирование RAP74 снижает сго способность поддерживать транскрипционную элонгацию in vitro; а фосфорилирование TFIIA стимулирует формирование комплекса TFIIA-TBP-TATA-element in vitro (Рис. 2). Автофосфорилирование TAF_II250 м. также играть роль в регуляции транскрипции, как было показано для TFIIF. Несмотря на отсутствие определенного субстрата, ясно. что киназная активность необходима in vivo, т.к. рекомбинатный TAF_II250 белок, у которого отсутствует NTK домен не м. восстанавливать ts13 фенотипы. Более того, делеция CTK у Drosophila ведет к гибели..

TAF_II250 is a histone acetyltransferase and binds to acetylated histones
Установлено. что TAF_II250 обладает HAT активностью. HAT домен картируется в центре наиболее законсервированной у metazoan TAF_II250 и в C-терминальной части дрожжевого TAF_II145 (Рис. 1). Выявлена корреляция между ацетилированием высоко законсервированного лизинового остатка в N-терминальных хвостах гистонов и активацией транскрипции. Одна модель объясняет, как ацетилирование гистонов влияет на экспрессию генов, исходя из того, что степень конденсации хроматина напрямую связана с уровнем ацетилирования гистонов. Соответственн, гиперацетилирование редуцирует сродство гистоновых хвостов к ДНК в результате образуется менее компактный хроматин и повышается доступность транскрипционных фактров к ДНК.

In vitro, Drosophila TAF_II250 ацетилирует свободные гистоны и нуклеосомные гистоны слабо по сравнению с дрожжевой HAT1 и P/CAF человека. Lys14 гистона H3 является преимущественным сайтом ацетилирования, хотя др. лизиновые остатки в H3 и H4 являются прекрасным субстратом TAF_II250. TAF_II250 ацетилирует также TFIIEß и TFIIF in vitro. Способность мутантов TAF_II250 ацетилировать гистоны in vitro температуро-зависма, это указывает на то, что энзиматическая активность улаживается в ts13 клетках при непермиссвной температуре и что клеточный цикл и транскрипционные дефекты, наблюдаемые при непермиссивной температуре результат снижения HAT активности.

Хотя гистоны и GTFs являются субстратами для TAF_II250 acetyltransferase активности in vitro, но неясно являются ли они субстратами, имеющими отношение к транскрипции. Две линии доказательств указывают на то, что гистоны м. и не быть имеющими к делу отношение субстратами: (1) активация транскрипции температуро зависима с нехроматиновых матриц в экстрактах ts13 клеток; и (2) ингибирование TAF_II250 ацетилтрнасферазной активности с помощью HIV Tat репрессирует транскрипцию с нехроматиновых матриц в экстрактах клеток HeLa. Т. обр., TAF_II250 acetyltransferase активность необходима in vitro , даже в отсутствие гистонов. Более того, TFIIEß и TFIIF м. не быть актуальными сусбстратами in vitro. Однако, остается открытым вопрос ацетилируются ли GTFs и гистоны с помощью TAF_II250 in vivo. Ацетилирование гистонов с помощью TAF_II250 in vivo могло бы вызывать локальные изменения структуры хроматина, чтобы увеличить доступность и связывание TFIID и др. PIC компонентов (Рис. 2).

В дополнение к ацетилированию белков TAF_II250 связывает множественные ацетилированные гистоны с помощью двух тандемных bromodomains, расположенных в С-терминальной области белка (Рис. 1). Bromodomainis - мотив ~120-остатков, присутсвующий в разных белках, которые связаны с хроматином. TAF_II250 doublebromodomain (DBD) связывается наиболее тесно с гистоном H4, ацетилированным по lys5 и lys12 . Это согласуется с кристаллической структурой DBD, которая показывает, что имеющиеся карманы для acetyllysine расположены на расстоянии, эксивалентном семи остаткам. Следовательно, TAF_II250 bromodomains м.направлять TFIID к хроматин-упакованным промоторам (Рис. 2).

TAF_II250 is a ubiquitin-activating/conjugating enzyme
Недавно было продемонстрированао, что TAF_II250 обеспечиваетe monoubiquitination гистона H1, линекрного гистона, который соединяется с ДНК между соседними нуклеосомами. Invitro, monoubiquitination нуждается в последовательной активации ubiquitin-активрующих (E1) и ubiquitin-конъюгирующих (E2) энзимов. TAF_II250 обладает обеими этими активностями: он ковалентно связывается , посредством thioester мостика с ubiquitin АТФ-зависимым способом (E1 активность), и переносит активированый убмквитин на гистон H1 посредством изопептидного мостика (E2 активность). E1 и E2 активности Drosophila и человечьего TAF_II250 обнаруживаются в центральной области белка (Рис. 1). Интересно, что эта область отсутствует у дрожжевого TAF_II145 и Bdf1, тогда как гистон, подобный H1 (HHO1) у дрожжей обнаружен.

Мутации Drosophila TAF_II250, которые нарушают гирстон H1 ubiquitination активность in vitro и in vivo выделедены при скрининге генов. которые модулируют способность Ras GTPase специфицировать судьбу клеток. Гены-мишени для TAF_II250 у Ras сигнальном пути не идентифицированы, но TAF_II250 мутации затрагивают транскрипцию в эмбрионе Drosophila , редуцируя экспрессию Dorsal и Caudal генов-мишеней. Неясно, как monoubiquitination гистона H1 с помощью TAF_II250 влияет на транскрипцию. Возможно H1 облегчает складывание нуклеосомных рядов в структуры высшего порядка, а ubiquitination меняет хроматин-связывающие свойства H1 и тем самым дестабилизирует как локальную, так и высшего порядка структуры и меняет взаимодействия между стержневыми гистонами и ДНК (Рис. 2). И в само деле, связывание гистона H1 с хроматином высоко динамично в живых клетках и модуляция связывающей активности H1 м.б. важной ступенью в регуляции доступа транскрипционнй кухни к ДНК .

Т.к. TAF_II250 не нуждается в E3 ubiquitin-лигазе для убиквитилирования гистона H1 in vitro, то возможно он использует один для убиквитилияции др. белков in vivo. Кандидатом на роль такого энзима является MDM2 ubiquitin ligase, чье связывание с TAF_II250 коррелирует с активацией транскрипции. In vivo, MDM2 м. направлять E1 и E2 активности TAF_II250 на белки, такие как p53.

Conclusions and perspectives: a model for the role of TAF_II250 during transcriptional activation

На основании описанных выше исследований мы предлагаем следующую модель, как TAF_II250 регулирует экспрессию генов (Рис. 2).

Сигнал, инструктирующий TFIID, где связатьсься с геномом, возможно идет от активаторов, которые связывают как cis-регуляторные области генов-мишеней, так и TFIID, чтобы поместить TFIID на определенные гены. TAF_II250 играет фундаментальную роль в этом процессе рекрутации, служа как партнер по связыванию для активаторов и как остов для др. TAF_II субъединиц TFIID. Более того, взаимодействия активатор-TAF_II250 м. регулировать время или субстрат специфичность энзиматической активности TAF_II250
Будучи рекрутированным, TFIID распознает и связывает основной core промотор. TAF_II250 играет двойственную роль в этом процессе, регулируя TBP-ДНК взаимодействия и, с помощью TBP и/или TAF_II150, распознает и связывается с Inr элементами. Арсенал TAF_II250 энзиматических функций м.б. применен и в этой точке, обеспечивая доступ к nucleosome-embedded core promoters. Потребности в индивидуальных TAF_II250 активностях д.б. ген-специфичными, т.к. нарушение NTK или HAT активности влияет на экспрессию разных генов.
TAF_II250-обеспечивает monoubiquitination гистона H1 и ацетилирование гистонов H2B, H3 и H4, это м. вызывать динамические изменения в структуре хроматина, которые облегчают связывание TFIID.
Связывание TAF_II250 двойного bromodomain с ацетилированными гистонами м стабилизировать взаимодействие TFIID с нуклеосомами во время процесса ремодлирования хроматина.
Будичи связанным с ДНК, TFIID nucleates сборку PIC в стартовой точке транскрипции. TAF_II250-обусловленные структурные изменения в хроматине должны позволять взаимодействовать PIC с ДНК, которое необходимо для инициации и элонгации транскрипции.
Во время или после сборки PIC TAF_II250 м. модифицировать TFIIFα и TFIIA-L путем фосфорилирования и TFIIEßи TFIIF путем ацетилирования, регулируя тем самым вклад TFIIA, TFIIE и TFIIF в инициацию транскрипции и элонгации.

В заключение, эта простейшая модель описывает, как отдельный инструмент, содержащийся в TAF_II250 "toolbox" вносит вклад в превращение активирующего сигнала, получаемого TFIID в ферментативный синтез мРНК.

TAFII250: a transcription toolbox

TAFII250 is a broadly acting regulator of transcription

TAFII250 is not the only scaffold for TFIID in vivo

TAFII250 function is regulated by activators

TAFII250 binds to core promoter initiator sequences

TAFII250 post-translationally modifies histones and GTFs