Последовательности леворучной (left-handed) супер-спирали характеризуются периодичностью в 7 остатков (heptad повторы), представляющей выражение (a-b-c-d-e-f-g), и последовательность области стержня имеет такую же периодичность [36]. Аполярные остатки преимущественно появляются в первой (a) и четвертой (d) позициях heptad. Упаковка типа 'knobs-into-holes' аполярных боковых цепочек в гидрофобную сердцевину является главным механизмом, с помощью которого стабилизируются coiled-coils. На базе аминокислотных последовательностей, предсказывается прерывистость в heptad повторах из-за half-pitch сдвига [37] (см. Figure 2b) в [34] на полпути вдоль along the outward ?-спирали стебля цитоплазматических динеинов. Напротив, heptad повтор является высоко упорядоченным вдоль всей inward ?-спирали. Эта дискретность, по-видимому, модулирует стабильность супер-спирализованного стебля, хотя large-scale melting супер-спирали в нуклеотид-связанном состоянии, по-видимому, мало вероятно. В нуклеотид-связанном состоянии ЭМ аксонем указывает на то, что стебель остается интактным и сохраняет контакты с микротрубочкой даже тогда, когда аксонемы фиксированы в присутствии АТФ [38,39] и стебель остаётся той же самой длины в изолированном dynein [18].
Суперскрученный пептид обладает ригидностью к изгибам порядка 400 pN·nm
2 [40]. Он сгибается под действием силы F на рассотояние y подобно ригидному лучу длиной L, где y = FL
3/3EI, где E является Young's модулем, а I вторым моментом инерции поперечника (cross-section). Продукт E и I является ригидностью к изгибу. Т.о., суперскрученный пептид длиной 15nm, закрепленный с одного конца обладает жесткостью
0.36 pN·nm
-1. Т.к. пределы конформаций для аксонемной молекулы dynein, наблюдаемые в негативно окрашенных выборках [18,19], зависят от распределения тепловой энергии, то эти пределы позволят подсчитать жесткость стебля. Жесткость было определена равной 0.5 pN·nm
-1 у apo молекул и 0.14 pN·nm
-1 у АТФ-vanadate молеекул [41]. Поперечная сила в 1-5 pN, соответствующая максимальной силе dynein [7,42,43], приложенная к свободному концу суперспирали отклоняет её на расстояние
3-14 nm. Негативно окрашенные ЭМ картины также показывают, что хвост молекулы динеина обладает гибкостью при жесткости 0.1 pN·nm
-1 [41]. Т.к. жесткость стебля и хвоста связаны последовательно (in series), то это даёт общую ригидность в 0.05-0.08 pN·nm
-1 [41], которая сходна с той, что определена с помощью экспериментов оптических ловушек [43]. Т.о., dynein является довольно гибкой молекулой, это указывает на то, что в условиях низкой или нулевой нагрузки он способен делать более крупные шажки, чем средний размер шага в 15 nm, выявляемый при ЭМ [19]
Conformational changes of dynein coupled with ATP hydrolysis
Базируясь на законсервированных последовательностях и структурном сходстве между аксонемным и цитоплазматическом dynein, можно предположить, что оба подсемейства dynein используют один и тот же механизм для генерации силы. Предложено, по крайней мере, три модели генерации силы dynein (Figure 2). Во-первых, ротация вокруг соединения между головным кольцом и стеблем, возникающая в результате связанной с ATPase перестройки AAA модулей в голвном кольце, как предполагается поворачивает связывающий микротрубочку стержень относительно хвоста (Figure 2a) [17,31,44]. Вторая модель предполагает, что связанная с ATPase ротация вокруг соединения между головным кольцом и хвостом также поворачивает головку и связывающий микротрубочки стержень (Figure 2b) [34]. Согласно третьей модели скоординированные множественные конформационные изменения умножают небольшие конформационные изменения между первым ААА доменом и его соседями по путем закрепления (docking) головного кольца на линкере, который соединяет хвост и головное кольцо [18]. В результате ротация головного кольца поворачивает стержень (Figure 2c).
Не смотря на Гауссовское распределение угла стержня аксонемного динеина [18,19], стержень цитоплазматического динеина обнаруживает три дискретных угловых распределения в apo состоянии [17]. Угловые изменения в положении стержня, по-видимому, скоррелированы с позиционными сдвигами среди семи основных плотностей кольца. Вероятности наблюдений в трех угловых состояниях были, однако, почти равными, указывая тем самым, что (согласно правилу Boltzmann's), что энергетические различия между тремя состояниями составляют 0.2-1.3
kBT. Если эти угловые изменения отражают разные механохимические состояния dynein, то эти энергетические различия кажутся слишком маленькими, чтобы приписать им конформационные изменения, связанные с гидролизом АТФ.
Ключевой структурой третьей модели является линкер [18]. Если этот механизм присущ всем dyneins, то последовательности линкерного домена д.б. у них законсервированы. Vanadate фоторасщепление рекомбинантных тяжелых цепей dynein [11,12] показало, что ключевые последовательности содержат остатки 1137-1455 в цитоплазматическом dynein крыс. Консервативный элемент, R/KXRHWXXI/L, обнаружен внутри существенной последовательности. Хотя потенциальный вклад этой последовательности в структуру или функцию динеина пока неясен, он может быть частью линкера.
Mechanical properties of dyneins
С помощью техники оптических ловушек механические свойства некоторых dyneins были измерены с пространственно-временными разрешениями в нанометрах и миллисекундах. Одно-головчатый inner-arm dynein-c обнаруживает поступательность движения и размеры шага в 8 nm [43]. Оuter-arm dynein ресничек
Tetrahymena - гетеротримерный 22S dynein - обнаруживает поступательный момент с размером шага в 8 nm при низких концентрациях АТФ, тогда как при высоких концентрациях он обнаруживает пульсо-подобную генерацию сил, сходную с той, что наблюдается в скелетно-мышечном миозине [42]. В обоих случаях эти dyneins часто пропускают шаг вперед и обнаруживают соскальзывание назад при тяжелых грузах[42,43]. Недавно движение одиночного цитоплазматического динеина было измерено и размер его шага снижался с 32 nm до 8 nm с увеличением груза или концентрации АТФ [45].
Некоторые inner-arm dyneins обладают способностью генерировать вращательный момент, который вызывает ротацию микротрубочек во время перемещения вперед [5,6]. Покрытые цитоплазматическим динеином кусочки осуществляют крупные и более частые боковые перемещения между протофиламентами микротрубочек, чем те, что наблюдаются с кинезином [46]. Следовательно, они лишены привязки к одной протофиламенте.
Эти механические эксперименты ставят множество вопросов. Напр., как осуществляет мономер поступательное движение? Поступательное движение одно-головчатых моторов по микротрубочке было описано для кинезин-подобного мотора KIF1A [47,48]. В этом случае, поступательное движение достигалось посредством электростатических взаимодействий между негативно заряженным т. наз. 'E-hook' тубулина и позитивно заряженной K-петлей в KIF1A [49]. Сходный механизм может быть приложим и к dynein-c. В самом деле, outer arm dynein, как было установлено, взаимодействует с микротрубочками таким способом, который позволяет последнему диффундировать только вдоль их продольных осей [50]. Однако, эквивалентные K-петле последовательности не были выявлены в dynein.
Дополнительные вопросы касаются того, как димер или тример координирует свои множественные моторные домены во время вышагивания и как размеры шагов изменяются в зависимости от груза. При изучении др. поступательных моторов, таких как myosin V (rev. [51]) и конвенционного kinesin (rev. [52]), были предположены механизмы, согласно которым два идентичных моторных домена альтернативно поворачиваются (swing) в направлении каждого шага, при этом один моторный домен остается прикрепленным к треку. Моторные домены альтернативно используют идентичные треки. Экспериментальное подтверждение для такого hand-over-hand механизма представлено [51]
Однако, dynein существенно отличается от kinesin или myosin своими большими размерами, он, по-видимому, освобожден от потребности перемещаться вдоль одного и того же трека, и своей значительной гибкостью. Хотя физиологическое значение гибкости dynein's пока неясно, но учитывая его огромные размеры и предполагаемый рабочий ход в связи с тубулиновой решеткой [18,19], он может осуществлять шаги разной длины даже без альтернативного поворачивания крупных моторных доменов. Это контрастирует с hand-over-hand походкой, т.к. размер шага у моторов, за исключением myosin VI [53], может быть предположен пропорциональным длине его рабочего хода [54,55]. Более того, моторные домены динеиновых гетеродимеров не имеют нужды вести себя таким же образом. Хотя поступательное движение dynein может быть описано просто с помощью модели гусеницы (inchworm), согласно которой dynein перемещается медленной походкой путем выдвижения своей ведущей головки и подтягивания тыла до встречи с ней в купе с diffusion search.
В аксонемах активность молекул динеина распространяется по линейным или двумерным наборам динеиновых молекул, плотно упакованных на периферических дублетах микротрубочек. Поведение аксонемного динеина интегрировано по большому счету, оно вызывает биение flagellum и распространение волн. Описаны некоторые важные исследования этого типа сочетанных операций множественных динеинов (включая смеси из разных типов динеинов). Одиночное динеиновое плечо dynein на выпячиваемом (extruded) дублете микротрубочек способно к осциллирующим движениям [7]. Аксонемы, обездвиженные на поверхности стекла вдоль всей своей длины обнаруживают осцилляции взад-вперед пучка наружных дублетов с высокими частотами, управляемыми динеинами [56]. Эти продольные осцилляции аксонем сочетаются с поперечными осцилляциями [57]. Кроме того, реальные подсчеты скоординированных движений ресничек и flagella были проведены на базе солидных доказательств механики и биохимии динеина и аксонем [58-61]. При этих подсчетах силы, осуществляемые динеинами на эластичных компонентах аксонем, были оценены и движения аксонем компьютеризированы. Эти подсчеты позволяют нам сделать новые предположения, которые не могут быть получены за счет прямого описания механических частей и их взаимоотношений.
Conclusions
Data presented to date indicate that the structure and force-generating mechanisms of dynein are quite different from those of the other linear motors, kinesins and myosins. We now have a powerful armory of techniques enabling the expression of recombinant cytoplasmic dynein with full motor activity [13] and molecular dissection of cytoplasmic dynein [27,28]. Although axonemal dynein awaits the establishment of an expression system, this armory will bring us to a better understanding of the dynein conformational cycle during motility and of the mechanism for transmission of conformational changes through the stalk.
Important questions awaiting further work concern the possible coordination between two or three motor domains connected by a presumably flexible tail and the mechanical feedback or modulation of force generation in dynein, which may play an important role in the bending and propagation of flagella. To describe the coordinated sequence of conformational changes and kinetics of two heads, single-molecule studies combined with the expression of genetically engineered dyneins will be a powerful experimental approach
Сайт создан в системе
uCoz
and Hitoshi Sakakibara