Посещений:
Многофункциональность Emerin

Роль в Emery-Dreifuss Мышечной дистрофии

Multiple and surprising new functions for emerin, a nuclear membrane protein
Luiza Bengtsson and Katherine L Wilson (klwilson@jhmi.edu)
Current Opinion in Cell Biology
Volume 16, Issue 1 , February 2004, Pages 73-79

Emerin is an integral protein of the nuclear inner membrane. Emerin is not essential, but its loss of function causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy. We summarize significant recent progress in understanding emerin, which was previously known to interact with barrier-to-autointegration factor and lamins. New partners include transcription repressors, an mRNA splicing regulator, a nuclear membrane protein named nesprin, nuclear myosin I and F-actin. These interactors imply multiple roles for emerin in the nucleus, some of which overlap with related LEM-domain proteins.


Рис.1.  |  Название

Классические мышечные дистрофии обусловливаются мутациями компонентов dystroglycan или sarcoglycan комплексов на поверхности мышечных клеток [1]. Напротив, X-linked Emery-Dreifuss muscular dystrophy (X-EDMD) обусловливается мутациями emerin, интегрального белка ядерной inner membrane (IM) [1]. Emerin экспрессируется в большинстве тканей человека, но неожиданно оказалось что EDMD затрагивает только три из симптомов, связанных с контрактурами локтей, коленей, шеи и Ахилесовых сухожилий, медленно прогрессирующем истощением скелетных мышц и дефектами проводящей системы сердца, способными вызывать летальную остановку сердца несмотря на вставленный электрокардиостимулятор [1]. Дефекты кардиального проведения обнаруживаются также у женщин носителей [2].
Emerin закреплён на IM ядерной оболочке (NE), где он связан с ядерными промежуточными филаментами, которые образуются lamin белками [1,3,4] (Рис. 1). Lamin филаменты обеспечивают механическую стабильность и форму ядра и поддерживают существенные функции, включая репликацию ДНК и синтез мРНК [3,4]. B-type lamins являются существенными [3-5]. A-type lamins, напротив, несущественны и экспрессируются только в дифференцированных клетках, указывая тем самым на свою потенциальную роль в специализированном статусе или функциях дифференцированных клеток [6]. Подтверждают эту модель миссенс мутации в LMNA, гене, кодирующем A-type lamins, которые вызывают EDMD (аутосомно доминантную) и 6 др. заболеваний, наз. в целом laminopathies [6-16], но др. болезнь-обусловливающие мутации не оказывают подобного эффекта; поэтому не выявляется чёткий паттерн.



Figure 1. Schematic diagram of emerin anchored at the nuclear inner membrane (IM) and interacting with lamin A, GCL, BAF, actin and a nesprin dimer. The seven SR domains in nesprin 1α are numbered 1–7, beginning at the N-terminus. The image is not drawn to scale. Each partner is described in the text.

Emerin (34 kDa) принадлежит к семейству ядерных белков, включающему LAP2, MAN1 и не охарактеризованных членов [17,18]. Каждый член семейства обладает LEM-доменом примерно из 40 остатков [19], который связывает barrier-to-autointegration factor (BAF), законсервированный хроматиновый белок [20,21]. В отличие от emerin, BAF является существенным для жизнеспособности клеток. BAF связывается с ДНК, выполняя структурную роль во время сборки ядра и предписывает высшего порядка хроматиновую структуру с помощью неизвестного механизма [22-24]. LEM-домен, по-видимому, является единственной областью emerin со стабильной глобулярной структурой [19]. Остальная часть emerin позволяет лучше проследить предполагаемую вторичную структуру (Рис. 2). Предполагается, что вне LEM-домена emerin является гибким и воспринимает специфические структурные конфигурации только тогда, когда связан со своими партнёрами.



Figure 2. Binding sites on emerin. Emerin has few regions of predicted secondary structure, outside the LEM-domain. Regions of predicted α-helical (α) and β-sheet (β) secondary structure are indicated by bars. TM, transmembrane domain. Secondary structure was predicted using NPS@ software [54]. Stars indicate residues 76–83 and 207–208; clusters of alanine-substitutions at these sites reduce (but do not eliminate) emerin’s binding to BAF [21]. Black and gray bars for actin depict regions in which mutations in emerin either abolish or reduce, respectively, binding to actin. Data are summarized from studies on emerin binding to: lamin A [21], GCL [47], Btf (T Haraguchi, JM Holaska, M Yamane, T Koujin, N Hashiguchi, C. Mori, KL Wilson, Y Hiraoka, unpublished), YT521-B [48] and F-actin [JM Holaska, AK Kowalski, KL Wilson, unpublished).

Do cells need emerin?


Emerin является несущественным для клеточной жизнеспособности у людей, а RNAi-индуцированная потеря emerin не оказывает обнаружимого эффекта на клетки человека (HeLa) [5] или эмбрионы Caenorhabditis elegans embryos [25]; однако, эксперименты с emerin-дефицитными эмбрионами C. elegans показали, что LEM-доменовые белки все вместе существенны [26]. C. elegans имеет тоолько 2 закрепленных на мембране LEM-доменовых белков: emerin и MAN1 [26]. Emerin и MAN1 червей непосредственно соединяются с lamin и BAF in vitro [26], что согласуется со всеми исследованиями LEM-доменовых белков человека [6,17]. Интересно, что на 90% сниженная экспрессия MAN1 всегда летальна для эмбрионов червей, лишенных emerin [26]. Погибающие эмбрионы имеют аномально сконденсированный хроматин и фенотип 'cell untimely torn', при котором анафазный, соединённый мостиками, хроматин дробится во время митоза. Т.о., emerin и MAN1 имеют, по крайней мере, одну перекрывающуюся функцию, которая существенна для деления клеток и сегрегации хромосом. Избыточная экспрессия полного нуклеоплазматического домена emerin увеличивает у млекопитающих клеточный цикл на 7 часов, подтверждая участие emerin в регуляцию клеточного цикла [27]. Др. исследования предполагают потенциальную структурную роль для эмерина во время сборки ядра, т.к. нуклеоплазматический домен эмерина оказывает доминантные эффекты на ядерную сборку в экстрактах у Xenopus [28]. Эти находки подтверждают, что emerin, хотя и несущественен, вносит всё же вклад в витальные функции, включая сборку ядра и ход клеточного цикла.

New partners for emerin


Хотя emerin не является существенным в клетках человека, его специфические функции безусловно важны для скелетных мышц, сухожилий и сердца [29]. Идентификация этих ткане-специфических функций является критической для нашего понимания EDMD. Emerin м. иметь уникальных партнёров по связыванию в тканях, поврежденных болезнью. Напротив, исследования C. elegans показывают, что болезнь м. воздействовать на ткани, которые естественным образом лишены др. LEM-доменовых белков, которые функционально перекрываются с эмерином [1,29]. В согласии с этой гипотезой, альтернативно сплайсированные изоформы LAP2 имеют ткане-специфические паттерны экспрессии [30]. Чтобы понять EDMD, необходимо понять как 'normal' функции эмерина, так и степень, с которой др. LEM-доменовые белки перекрывают эти же функции.
Первоначально lamins рассматривались как важные, но возможно не достаточные сами по себе, чтобы удерживать и локализовать emerin на IM [3,6,17]. Сходным образом, BAF, в качестве emerin- и ДНК-связывающего белка рассматривался как якорь ('anchor') для хроматина на IM [21,23]. Т.к. затем было описано несколько новых партнёров для emerin, включая репрессоров транскрипции, регуляторы сплайсинга мРНК, ядерный мембранный белок, названный nesprin-1α, ядерные myosin I и F-actin.

Emerin and BAF influence each other's localization and dynamics


Законсервированные остатки LEM-домена эмерина существенны для связывания BAF [21]. Интересно, что мутации в остатках 76-83 и 207-208, которые находятся вне 'официального' LEM-домена [19], ослабляют связывание [21]. Сходным образом, мутации в остатках 152-161 в Xenopus LAP2β также ослабляют его связывание с BAF [20]. Т.о., физиологически BAF-связывающий домен м. расширяться за пределы складки в 40-остатков, что определено с помощью изучения NMR [19,31], гипотеза подтверждена также с помощью мутации по emerin L64F, которая ослабляет взаимодействие с BAF во время сборки ядра in vivo [32] (Рис. 2).
Emerin д. соединяться с BAF, чтобы повторно собираться на NE после митоза [32]. Во время телофазы, GFP-BAF и emerin взаимно обогащены временно в т.наз. 'стержневых' областях сегрегирующих хромосом. Эмериновые белки, которые не м. связывать BAF, не рекрутируются на стержень и , следовательно, не способны осуществлять сборку на IM. В противоположность длительному связыванию BAF's с emerin на ранних стадиях сборки NE, FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) и сходные эксперименты показывают, что BAF является высоко мобильным в интерфазных клетках [33]. Во время интерфазы, BAF обнаруживает пониженные скорости диффузии вблизи NE, обусловленное частым, но временным соединением с emerin [33] и возможно с др. LEM-доменовыми белками. BAF немного на NE в emerin-and-MAN1-дефицитных клетках C. elegans [26], это подтверждает BAF 'задержки' вблизи LEM-доменовых белков во время интерфазы.
Emerin тесно соединяется с nesprin-1α [34], который также является интегральным белком IM [35,36]. Nesprin-1α принадлежит к семейству вновь открытых белков, которые кодируются двумя генами , nesprin-1 и nesprin-2, которые транскрибируются и подвергаются альтернативному сплайсингу, чтобы дать разнообразные ткане-специфические изоформы, некоторые из которых являются гигантами (megaDalton mass) [36]. Nesprins имеют множественные домены spectrin repeat (SR) с низкой гомологией др. др., плюс С-терминальный трансмембранный домен. Nesprin-1α (известный также как Myne-1 [37] или Syne-1 [38]) экспрессируется широко, имеет 7 SR доменов, образует гомодимеры и соединяется непосредственно с lamin A и emerin [34]. Сродство nesprin-1α к emerin равно 4 nM [34], т.е. наиболее тесный из всех известных партнёров, это указывает на то, что nesprin-1α м. помогать закреплять эмерин на IM.

Emerin influences actin dynamics


Emerin и lamin A каждый соединяется с актином [39-41]. Более того, actin, emerin и lamins A и C ко-преципитируются из ядерных лизатов cycling миобластов с помощью антител против или emerin или lamins A и C [42]. Интересно, что actin-emerin взаимодействия в миобластах м. регулироваться с помощью фосфорилирования [42]. A-kinase anchoring protein, AKAP149, protein phosphatase 1 и protein kinase A ассоциируют с emerin-lamin-actin комплексом в мышечных трубках [43,44], указывая, что ядерный актин является биологически подходящим партнёром для эмерина. Недавно это было подтверждено.
Emerin соединяется и с α- и с β-actin и распознаёт как мономерный, так и филаментозный актин in vitro (JM Holaska, AK Kowalski, KL Wilson, unpublished). LEM-домен является единственной областью эмерина, которая не участвует в связывании актина (Рис. 2). Emerin соединяется с pointed (минус) концом F-actin. Флюорометрия с pyrene-меченным актином показала, что emerin усиливает полимеризацию actin in vitro в 10-15 раз. В самом деле, связывание актина м.б. специальной функцией emerin, т.к. LAP2β оказывается в 20 раз менее активным, чем эмерин в усилении полимеризации (JM Holaska, AK Kowalski, KL Wilson, unpublished). Увеличение скорости полимеризации, как полагают, возникает в результате 'capping' эмерином pointed концов актина, тем самым снижается скорость оборота. Т.о., emerin обладает потенциалом стабилизировать актиновые полимеры на NE. Emerin соединяется также непосредственно со специфичной для ядра изоформой myosin I (JM Holaska, AK Kowalski, KL Wilson, unpublished), которая необходима для транскрипции с помощью polymerase II [45]. Ядерный myosin I является альтернативно транслируемым продуктом гена myosin I, который идентичен цитоплазматическому миозину за исключением того, что ядерный миозин I имеет 16 дополнительных остатков на своём N-конце [45]. Эти находки предоставляют прямые доказательства существования актиновой кортикальной сети на IM (JM Holaska, AK Kowalski, KL Wilson, unpublished) и участие эмерина в организации этой сети.
Функции актина в ядре лишь недавно стали выясняться (см. обзор [39]). Актин является существенным компонентом хроматин ремоделирующих комплексов и необходим для транскрипции (обзор [40]). Krauss и др. показали, что экстракты из Xenopus, истощённые по белку 4.1, цитоплазматические изоформы которого сцепляют короткие актиновые филаменты со spectrin на клеточной поверхности, оказываются дефектными по ядерной сборке [40]. Интеречно, что ядерная форма spectrin IIα и др. 'цитоскелетных' белков, м.б. affinity-очищены, используя кусочки, смоченные emerin (JM Holaska, AK Kowalski, KL Wilson, unpublished).
Полное значение связывания emerin с actin и myosin I ещё не выяснено. Однако, мы предполагаем, в дополнение к его общеизвестному потенциалу влияния на ядерную структуру, emerin-myosin соединение м. также иметь отношение к транскрипции.

Emerin interacts with gene regulatory proteins


LAP2β является репрессором транскрипции in vivo, a его активность усиливается путём связывания GCL (germ-cell-less), повсеместно экспрессирующегося репрессора E2F-DP регулируемых генов [46]. GCL ко-преципитируется с эмерином из экстрактов клеток HeLa, а также соединяется непосредственно с эмерином in vitro с 30 nM сродством и 1:1 стоихометрией [47]. Сайт связывания для GCL был картирован в двух областях emerin: остатки 34-83 и 175-217, которые перекрываются с предполагаемыми областями для связывания BAF и lamin A, соотв. [21,47]. Установлено, что emerin формирует стабильные четвертичные комплексы или с lamin A плюс BAF, или с lamin A плюс GCL. Однако, эмерин не м. связываться одновременно и с GCL и BAF. Подсчитанные концентрации BAF's на NE м. оказаться достаточными для ингибирования связывания GCL с emerin in vivo [47], это предположение согласуется с высокой скоростью on/off взаимодействия BAF с эмерином [33]. Отметим, что BAF сам также репрессирует транскрипцию. В клетках сетчатки, BAF соединяется с Crx и родственными paired-подобными гомоедоменовыми транскрипционными факторами и блокирует их активность in vivo [24].
Emerin соединяется непосредственно с двумя др. белками, которые участвуют в экспрессии генов: Btf (T Haraguchi, JM Holaska, M Yamane, T Koujin, N Hashiguchi, C. Mori, KL Wilson, Y Hiraoka, unpublished) и YT521-B [48], оба обнаружены при двугибридном скрининге с использованием полной длины эмерина в качестве затравки. YT521-B участвует в выборе места для альтернативного сплайсинга мРНК, a emerin влияет на выбор места сплайсинга с помощью YT521-B in vivo [48.].
Btf является репрессором транскрипции, который индуцирует клеточную гибель в случае избыточной экспрессии [49]. Эмерин, как полагают, секвестрирует Btf и тем самым супрессирует апоптоз [50]. Emerin не расщепляется во время апоптоза ни у C. elegans [50] ни в Jurkat T клетках млекопитающих [51], но он расщепляется во время апоптоза в пролиферирующих мышиных миобластах и дифференцирующихся мышечных трубок [52]. Протеолиз эмерина начинается в течение 24 ч. после индукции апоптоза с помощью staurosporine и блокируется с помощью ингибиторов caspase-6. Пока непонятно, почему emerin специфически нацелен на апоптическую деградацию мышечных клеток, этот вопрос нуждается в детальном исследовании, т.к. EDMD, как полагают, результат апоптоза [41].
Открытие, что эмерин взаимодействует со множественными транскрипционными регуляторами и факторами сплайсинга РНК, указывает на то, что он м. регулировать транскрипцию непосредственно или косвенно. В самом деле, это подтвердили эксперименты с микромассивами ДНК, по сравнению профилей генной экспрессии фибробластов от X-EDMD пациентов и контрольных людей [53]. Приблизительно 60 генов было затронуто у X-EDMD пациентов, большинство из них имело усиленную активность. Нормальная экспрессия восстанавливалась для 28 из этих генов при экспрессии эмерина дикого типа в клетках X-EDMD. Гены, которые оказались 'восстановленными' в этом эксперименте, включали и те, которые кодировали lamins A и C, αII-spectrin, актин-связывающий белок filamin, лёгкая цепь миозина и protein phosphatase 2A [53].

Emerin mutations and disease mechanism(s)


Имеется специальный субнабор мутаций, вызывающих EDMD, в emerin, которые не нарушают ни стабильности, ни NE локализации: S54F, P183H/T, Q133H и делеция остатков 95-99. Пациенты с любой из этих мутаций имеют типичный (нулевой фенотип) болезни EDMD, причём их мутации разрывают связи только с одним или немногими известными партнёрами эмерина по связыванию (Рис. 3). Делеция остатков 95-99 нарушает связывание эмерина с lamin A [21], a также с GCL [47], Btf (T Haraguchi, JM Holaska, M Yamane, T Koujin, N Hashiguchi, C Mori, KL Wilson, Y Hiraoka, unpublished) и actin (JM Holaska, AK Kowalski, KL Wilson KL, unpublished). Мутации S54F и Q133H, как было установлено, нарушают связывание только с Btf (T Haraguchi, JM Holaska, M Yamane, T Koujin, N Hashiguchi, C. Mori, KL Wilson, Y Hiraoka, unpublished) и actin (JM Holaska, AK Kowalski, KL Wilson, unpublished), соотв. Некоторые мутации усиливают связывание с YT521-B [48]. Эти специальные аллели проливают свет на молекулярные механизмы EDMD и добавляют доказательства, что EDMD м. возникать в результате разрушения белковых комплексов, которые включают, но не ограничены emerin и lamins. Большинство EDMD-вызывающих мутаций в lamins A и C не нарушают связывание lamin-emerin, но м. нарушать связывание с др. партнёрами. Более половины (60%) от всех пациентов с EDMD имеют гены дикого типа для emerin и lamins A и C [43]. Предпринимаются усилия по скринингу таких пациентов в отношении дефектов по др. NE белкам или партнёрам по связыванию [43].



Figure 3. Effect of EDMD-causing mutations on emerin binding to each named partner. The strength of binding is indicated by +/?, relative to wild-type emerin. Nd, not done. See Figure 2 legend for references.

Conclusions


New findings support the idea that emerin anchors a variety of protein complexes at the IM. These complexes, and emerin itself, are likely to have multiple and distinct functions, including roles (direct or indirect) in gene expression, roles in regulating a functional actin cortical network at the NE and roles in nuclear assembly. It is not yet clear if any of emerin’s functions or partners are unique to emerin; lamins, BAF, and GCL can also interact with LAP2β, at least in vitro. Other, ‘newer’ partners (e.g. F-actin, nesprin-1α and myosin I) have not yet been tested for binding to other LEM-domain proteins. Despite their overlapping functions in C. elegans, emerin and MAN1 have been strongly conserved during metazoan evolution, suggesting there is something special about each of them. It is interesting that genes encoding some of emerin’s ‘structural’ partners (e.g. αII-spectrin, lamins) are upregulated in cells that lack emerin. Is this a new key to the ‘unique’ functions of emerin in muscle cells and other affected tissues? Recent progress is highly encouraging and we hope that continuing work on emerin and other LEM-domain proteins will lead to a direct understanding of emerin and the molecular mechanisms of EDMD.
Сайт создан в системе uCoz