FURIN AT THE CUTTING EDGE: FROM PROTEIN TRAFFIC TO EMBRYOGENESIS AND DISEASE
Gary Thomas (thomasg@ohsu.edu)
Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, No 10, 753-766 (2002)


Furin catalyses a simple biochemical reaction — the proteolytic maturation of proprotein substrates in the secretory pathway. But the simplicity of this reaction belies furin's broad and important roles in homeostasis, as well as in diseases ranging from Alzheimer's disease and cancer to anthrax and Ebola fever. This review summarizes various features of furin — its structural and enzymatic properties, intracellular localization, trafficking, substrates, and roles in vivo.


(Рис.1.)  |  Schematic diagram of the proprotein convertase (PC) family.


(Рис.2.)  |  Furin-processing compartments of the trans-Golgi network (TGN)/endosomal system.


(Рис.3.)  |  The furin autoactivation pathway.


(Рис.4.)  |  Model of furin trafficking.


(Рис.5.)  |  The sorting motifs of the furin cytoplasmic domain.


(Рис.6.)  |  Furin in development, homeostasis and disease.


(Рис.7.)  |  Furin activation of the anthrax toxin.

(Табл.1)  |  The proprotein convertase family

Boxes


Box 1 | The discovery of furin

In 1990, the identification of furin as the first bona fide mammalian proprotein convertase (PC) ended a nearly quarter-century-long search for the mammalian enzymes that catalyse the proteolytic maturation of prohormones and proproteins The quest for the PCs began with seminal studies by Donald Steiner in 1967, who showed for the first time that peptide hormones are post-translationally excised from larger prohormones by cleavage of the precursor at doublets, or clusters, of basic amino acids (for example, –Lys–Arg↓– and –Arg–Arg↓–, where ↓ identifies the cleavage site). These studies were as revolutionary as those by Krebs and Fischer, which showed that protein phosphorylation is a universal modification in signal transduction. Concurrent studies by Michel Chrétien and Choh Hoh Li on the structural relationships between β-melanocyte stimulating hormone (β-MSH), γ-lipotropin (γ-LPH) and β-lipotropin (β-LPH) — a subset of peptides derived from a complex pituitary prohormone, proopiomelanocortin (POMC) — provided the first clues to the greater generality of proprotein processing.

Together, these studies set the foundations of subsequent research in protein processing over the next 20 years, which showed that virtually all peptide hormones, numerous bioactive proteins (for example, growth factors, receptors and cell-adhesion molecules), and many bacterial toxins and viral envelope glycoproteins, follow this fundamental maturation scheme to generate the mature and biologically active molecule . The enzymes that catalyse these vital reactions, however, were not identified until 1984, when the yeast endoprotease, kexin or Kex2, was isolated.

Kex2 excises α-MATING PHEROMONE and killer toxin from their precursors in late Golgi compartments. Because Kex2 could also correctly process mammalian proproteins, one or more of the mammalian PCs were anticipated to share structural features with the yeast enzyme. A database search identified a previously reported protein encoded by the FUR ('fes/fps upstream region') locus, an open reading frame adjacent to the fes/fps proto-oncogene, as the first mammalian Kex2 homologue. The product of this gene — furin — was soon shown to correctly process precursors for neurotrophic factors, serum proteins and pathogen molecules. PCR strategies were then used to identify the remaining six members of the PC family (Рис. 1; Табл. 1). Together, the PCs catalyse the proteolytic maturation of an enormous collection of bioactive peptides and proteins that regulate virtually every process controlling homeostasis and disease.



Box 2 | Furin and bioterrorism

The bioterrorism plot following the World Trade Center tragedy on 11 September 2001 attempted to inflict countless deaths by disseminating Bacillus anthracis spores through the mail system. Twenty-two people were diagnosed with anthrax that was contracted from contact with contaminated mail — five died within days of exposure. However, the affected sorting facilities processed 85 million pieces of mail after the contaminated letters were sent, reinforcing just how close we came to disaster. And anthrax is not alone in its capacity to ignite disaster. It is eerily reminiscent of the influenza pandemic that could have erupted in Hong Kong in 1997, when a renegade pathogenic avian influenza virus — able to jump directly from birds to humans — killed six of the 18 people who were clinically diagnosed as having 'bird flu' in a week. If it had not been for the attenuated infectivity of this H5N1 influenza virus, the death toll from the outbreak could have been far worse. As well as illustrating our vulnerability to deadly microbes, there is another link between these two close calls, and that link is furin, a host-cell endoprotease that activates the toxic agents of these pathogens (see text for more details).



Links

InterPro: P domain
LocusLink: AP-1 | AP-2 | AP-4 | BRI | CK2 | filamin | IGF1 | MAPK | PP2A | protein kinase C | TGF-β | TNF
OMIM: Alzheimer's disease | familial British dementia | familial Danish dementia | rheumatoid arthritis
Swiss-Prot: ADAM10 | ADAM17 | ADAMTS-4 | APP | APRIL | ARF1 | ATR | BAFF | BMP-4 | CI-MPR | CPD | EDAR | EF | Furin | gelsolin | GGA3 | HA | IGF1R | KIF13A | Lefty-2 | LF | MMP2 | MT1-MMP | β-NGF | Nodal | PA | PACE4 | PACS-1 | PC5/6A | PC5/6B | PC7 | RAB6 | β-secretase | SMAD2 | SNX-15 | Sortilin | TGF-β1 | TNF-α

FURTHER INFORMATION
Gary Thomas' lab
Furin является клеточной ENDOPROTEASE (Box 1); она протеолитически активирует большое количество PROPROTEIN субстратов в компартментах секреторного пути. Он активирует также патогенные агенты (Box 2), furin играет важную рольв эмбриогенезе и катализирует созревание разных proprotein субстратов. До сих пор он рассматривался как белок домашенего хозяйства (housekeeping); однако, furin's выполняет критическую роль во многих клетоных событиях — болезнях от сибирской язвы и bird гриппа (Box 2) до рака, деменции и лихорадки Ebola. Он отвечает за PATHOGENICITY многих вирусов и бактерий.

The biochemical properties of furin


Domain structure.
Furin - повсеместно экспрессирующийся в 794-amino-acid TYPE-I TRANSMEMBRANE PROTEIN. Его большая просветная/внеклеточная область обнаруживает гомологию с некоторыми областями др членов семейства PROPROTEIN CONVERTASE (PC) (Рис. 1; Табл. 1), которое относится к SUBTILISIN SUPERFAMILY сериновых эндопептидаз. Наивысшее сходство последовательностей в subtilisin-подобном каталитическом домене; aspartate (Asp), histidine (His) и serine (Ser) остатки, которые формируют CATALYTIC TRIAD сильно законсервированы, а каталитические домены др. PCs на 54–70% идентияны последовательностям фурина. Помимо сигнального пептида, который управляет транслокацией про-энзима в endoplasmic reticulum (ER), furin и др. PCs содержат продеомены, которые фланкируются сайтом signal peptidase cleavage с N-терминальной стороны и сайтом аутопротеолитического расщепления с С-терминальной стороны. Этот важный продомен выполняет критическую роль в формировании складок, активации и транспорте PCs и в регуляции активности PC. Furin и др. PCs имеют также общий законсервированный P домен, который важен для энзиматической активности и модулирования pH и потребности в кальции; этот P домен отсутствует в родственных бактериальных энзимах. Цитоплазматический домен фурина контролирует локализацию и сортировку фурина в trans-Golgi сети (TGN)/endosomal системы.

pH and ion requirements.
Furin обладает широким pH оптимумом; более 50% его ферментативной активности осуществляется между pH 5 и 8, в зависимости от расщепляемого субстрата. Подобно др. членам сверхсемейства subtilisin, furin сильно зависит от кальция, ему необходимо ~ 1 mM кальция дл яполной активности. Моделирование структуры furin, исходя из уже известной структуры BACTERIAL THERMITASE — хорошо охарактеризованного subtilisin, который имеет 29% идентичных последовательностей с каталитическим доменом — показало, что фурин имеет два кальций-связывающих кармана: один со средним сродством и др. с высоким сродством. Фурин соединяется также слобо с калием, так, 20 mM калия увеличивают активность фурина за счет усиления скорости деацетилирования, которая важна для каталитического цикла фурина.

Consensus cleavage site.
Консенсус расщепляющего сайта фурина, который находтся после С-терминального arginine (Arg) остатка в последовательности –Arg–X–Lys/Arg–Arg↓– (где Lys это лизин, X любая аминокислота и ↓ означает место расщепления), был определен биохимически при использовании двух bona fide in vivo furin субстрата — защитный антиген против токсина сибирской язвы (PA) и птичий influenza virus haemagglutinin (HA). Т.к. РА токсина сибирской язвы и influenza virus HA расщепляются на клеточной поверхности и на TGN/биосинтетическом пути,соотв., то эти исследования впервые показали, что фурин активен в нескольких клеточных компартментах и является ключевым энзимом в активации различных патогенов (Рис. 2). Arg остаток в P1 AND P4 позициях этого сайта расщепления существенен, тогда как P2 основная аминокислота (Lys/Arg) нет, но она м. существенно увеличивать эффективность процессинга. Следовательно, –Arg–X–X–Arg↓– представляет собой минимальный сайт расщепления фурина, хотя более благоприятные остатки в положении P2 и P6 м. компенсировать менее эффективные остатки в положении P4. Соответственно, в исключительных случаях, –Lys/Arg–X–X–X–Lys/Arg–Arg↓– м.б. расщеплены фурином.
Различные permutations консенсуса сайта расщепления фурина имеют важное значение для пропротеинового субстрата и в терминах компартментной специфичности и порядка последовательностей событий расщепления фурином. Модель каталитического домена фурина, базирующаяся на структуре бактериального subtilisins BPN' и thermitase, предсказывает существование негативно-заряженных остатков в S1, S2 и S4 субсайтах связывающего кармана, которые м. взаимодействовать с основными аминокислотами в субстрате. В отсутствие трехмерной структуры фурина преждевременно говорить что-либо определенное о субстрате и кофакторе связывающего сайта.

Inhibitors.
Были использованы потребности сайта расщепления фурина для продукции мощных пептид- и белок-based ингибиторов, которые блокируют активность фурина in vitro и in vivo. Два наиболее широко используемых ингибитора фурина являются stoichiometric peptidyl ингибитором decanoyl–Arg–Val–Lys–Arg–CH2Cl (где Val валин) и α1-antitrypsin Portland (α1-PDX), биоинженерный вариант α1-ANTITRYPSIN. Decanoyl–Arg–Val–Lys–Arg–CH2Cl ингибирует все PCs с низким наномолярным Ki, хотя алкилирующие свойства реактивной группы ограничивают использование этого реагентаt. Тем не менее, в исследованиях клеточных культур decanoyl–Arg–Val–Lys–Arg–CH2Cl блокирует процессинг некоторых субстратов фурина. α1-PDX ингибитор получен в результате мутирования петли реактивного сайта α1-antitrypsin, содержащей минимальные консенсусные последовательности для расщепления фурином (–Arg–Ile–Pro–Arg–)(где Ile это изолейцин, а Pro - пролин), он высоко избирателен по отношению к фурину in vitro (Ki = 600 pM), хотя при высоких концентрациях он м. ингибировать и др. PCs. α1-PDX используется для блокирования активности фурина и для предупреждения продукции патогенных вирусов, активации бактериальных токсинов и метастазирования.

Multistep furin autoactivation


Продомен фурина в 83 аминокислоты действует как внутримолекулярный хаперон (chaperone), который предопределяет образование складок (folding) и активацию эндопротеазы. Складывание каталитического центра фурина в его корректную конформацию происходит многоступенчато, в результате двух компартмент-специфических расщеплений в продомене, что дает активный энзим (Рис. 3). Для достижения этой цели фурин использует правила своего собственного сайта расщепления и разрезает продомен дважды. Во-первых, и очень быстро (t1/2 = 10 mins) происходит рассечение в нейтральной среде pH в ER после Arg107 в консенсусном сайте расщепления фурина (–Arg–Thr–Lys–Arg107↓– (где Thr это треонин)), который располагается на границе каталитического домена. Во-вторых, медленное (t1/2 < 2 hrs) рассечение после Arg75 в pH-чувствительном сайте расщепления пропептида фурина в продомене (–Arg70–Gly–Val–Thr–Lys–Arg75↓– (где Gly это глицин)) во время переноса propeptide–furin комплекса внутри слабо кислой TGN/endosomal системы. pH чувствительность internal-propeptide-cleavage-site фурина снова выявляется слабо кислыми условиями, которые необходимы для расщепления proalbumin и Pseudomonas exotoxin A сходными сайтами фурина (Рис. 2).
Путь активации фурина обнаруживает эволюционную консервацию с путями активации бактериального subtilisin и α-lytic протеазы, которые используют свои пропептидные сайты вырезания для обеспечения укладывания каталитического центра, это приводит к структурной реорганизации упакованного про-энзима. Метод фурина 'один раз отмерь и дважды отрежь' используется и членами семейства transforming growth factor-β (TGF-β) для контроля передачи сигналовJUXTACRINE VERSUS PARACRINE и paramyxoviruses для продукции способных к слиянию гликопротеинов оболочки.

Furin localization and trafficking


Высвобождение фрагментов пропептида фурина демаскирует его эндопротеазную активность и делает его способным расщеплять субстраты в TRANS. Фурин локализуется в TGN — поздней структуре Golgi, которая отвечает за сортировку белков секреторного пути к их финальному предназначению, включая клеточную поверхность, эндосомы, лизосомы и секреторные гранулы. Из TGN, фурин следует высоко регулируемым путем переноса через несколько TGN/эндосомных компартментов к клеточной поверхности (Рис. 4). Такой маршрут объясняет, частично, способность фурина осуществлять процессинг различных коллекций пропротеиновых субстратов in vivo. Более того, выявляются при этом новые роли фосфорилирования белка, активносого цитоскелета и сортировки адапторов в регуляции переноса белков, которые контролируют клеточный гомеостаз и болезни.

Localization to the trans-Golgi network.
Как и в случае большинства маршрутов type-I мембранных белков, и локализация фурина в TGN и его динамические циклы контролируются последовательностями его цитаплазматического домена в 56 аминокислот (Рис. 5). Локализация фурина в TGN нуждается в двухсоставном мотиве, который состоит из casein kinase 2 (CK2)-фосфорилированного кислого кластера (EECPpSDpSEEDE, где p означает сериновые остатки, которые фосфорилированы) и проксимального к мембране сегмента, содержащих два гидрофибных мотива (YKGL и LI) (Рис. 5). Двухсоставной мотив контролирует две стадии петли локального превращения (cycling) — проксимальный к мембране сегмент необходим для эффективного отпочковывания (budding) фурина от TGN в эндосомы, тогда как фосфорилированнй кислый кластер управляет эффективным возвращением эндосомального фурина в TGN.
Стабильная локализация фурина в TGN ведет к предполоению, что эта эндопротеаза расщепляет пропротеиновые субстраты в этом компартменте. Однако, недавние исследования показали, что процессинг-компартменты м.б. сформированы за счет слияния эндоцитотических, содержащих фурин, компартментов с экспорт-пузырьками, которые содержат белки-субстраты. Какова же тогда роль локализации фурина в TGN? Вообще-то, помимо приюта для процессинга некоторых субстратов этот компартмент м. также служить в качестве стратегически расположенного резервуара для молекул фурина, которые не участвуют в процессинге пропротеинов.

Basolateral sorting.
В поляризованных клетках направление фурина к базолатеральной поверхности сходным образом контролируется двухсоставным сигналом, который состоит из С-терминальной части кислого кластера — EEDE — и FI мотива (Рис. 5). Мотив FI, по-видимому, предназначен для связи с sorting adaptor protein (AP)-4, а AP-4 необходим для базолатеральной сортировки фурина (Рис. 4). Эта роль повсеместно экспрессирующегося AP-4 объясняет отсутствие функционирования эпителиально-специфичного базолатерального сортинг adaptor AP-1B в переносе фурина.

Budding from the trans-Golgi network.
Мало что известно о ццитоплазматической кухне (machinery), которая управляет выталкиванием фурина из TGN. Известно, что фурин локализуется в покрытых клатрином областях TGN, это указывает на роль для сортировки адпторного белка AP-1. В самом деле, и LI, и YKGL мотивы связываются с μ1a цепью AP-1 (Рис.5). Недавно идентифицированs локализованныt в Golgi γ-ear-containing, ADP-ribosylation-factor-binding (GGA) белки, которые контролируют выталкивание mannose-6-phosphate рецепторов из TGN, это открывает возможность для второго пути, с помощью которого фурин м. выходить из TGN. С такой возможностью согласуется то, что фуриновый LI мотив находится внутри GGA3 консенсусных связывающих последовательностей (DXXLI) (Рис. 5).

Retrieval from endosomes.
В отличие от выхода фурина из TGN, выход фурина из эндосом в TGN более понятен. CK2-фосфорилированный фуриновый кислый кластер соединяется с сортинг-белком PACS-1 (phosphofurin acidic cluster sorting protein-1) — sorting connector, который соединяет фурин с AP-1 клатриновым адаптором и транспортирует фурин из эндосом в TGN (Рис. 4). Тот факт, что связывание AP-1 с PACS-1 является критическим для траспорта из эндосом в TGN, согласуется с обнаружением того, что мутация в сайте связывания AP-1 у PACS-1 или генетическая делеция AP-1, оба вызывают сходное неправильное расположение фурина в эндосомных компартментах. PACS-1 не предназначен исключительно для фурина; он контролирует endosome-to-TGN sorting нескольких мембранных белков. которые содержат кислые кластер-сортинг мотивы. Это и клеточные белки, такие как cation-independent mannose-6-phosphate рецептор (CI-MPR), гомолог фурина PC5/6B (Рис. 1), carboxypeptidase D (CPD), Sortilin и некоторые патогенные белки, включая HIV-1 Nef (для 'negative factor') и некоторые гликопротеины оболочки вируса герпеса, такие как varicella zoster virus gE и human cytomegalovirus gB. PACS-1 связывание с HIV-1 Nef необходимо для immunoevasion посредством подавления молекул major histocompatibility class-I (MHC-I) и PACS-1 связывание с гликопротеинами оболочки вируса герпеса для получения инфекционного вируса. Как AP-1 м. вносить вклад и в ANTEROGRADE AND RETROGRADE транспорт между TGN и эндосомами, неизвестно, но показано, что AP-1 соединяется через CI-MPR с anterograde kinesin — KIF13A— для проникновения на клеточную поверхность из TGN, указывая тем самым, что сортинг-белки м. комбинироваться, чтобы обеспечить направленность транспорта.

Endocytosis.
Многие сортинг-мотивы, которые локализуют в фурин в TGN, управляют также его маршрутом эндоцитотической сортировки. Эндоцитоз фурина управляется принципиально YKGL мотивом, который связывается с μ2 ce,]tlbybwtq AP-2 адаптора. Поставка молекул фурина с клеточной поверхности в эндоцитотические компартменты регулируется связыванием с его VY мотива с filamin, субкортикальным актин-связываемым белком, который участвует в локомоции и передаче сигналов клеток (Рис.4, 5). Помимо сортировки nexin-15 (SNX-15) влияет на интернализацию фурина (Рис. 4), а избыточная экспрессия этого белка сортировки препятствует интернализации furin-содержищих химер.
В ранних эндосомах фурин м. или подвергаться рециклингу на клеточную поверхность или переносу в TGN. Возвращение на клеточную поверхность требует фосфорилирования с помощью CK2 кислого кластера фурина и PACS-1, тогда как транспорт в TGN нуждается в дефосфорилировании кислого кластера фурина с помощью специфической изоформы протеин фосфатазы 2A (PP2A), которое, по-видимому. происходит перед транзитом через поздние эндосомы intermediate или через sorting/recycling эндосомы (Рис. 4).
Итак, PACS-1 и CK2, по-видимому, помещают фирин в одну из двух петель локального циклинга — в TGN и между лпзматической мембраной и эндосомами. Выбор между этими двумя петлями требует дефосфорилирования с помощью PP2A. Сортировка CPD сходным образом контролируется с помощью состояния фосфорилирования его кислого кластера. Более того, PP2A связывается непосредственно с цитоплазматическим доменом CPD и это связывание существенно для контроля транспорта CPD между TGN и поверхностью клетки. Высоко скоординированные маршруты сортировки фурина и CPD коррелируют с их последовательной ролью в процессинге пропротеиновых субстратов in vivo.

The regulated secretory pathway.
Изучение переноса фурина в эндокринных и нейроэндокринных клетках вызвало сомнение относительно укоренившегося мнения о раздельности REGULATED AND CONSTITUTIVE PATHWAYS. В клетках этих типов фурин попадает в формирующиеся незрелые секреторные гранулы immature secretory granules (ISGs) вместе с гормонами и др. молекулами, которые предназначены стать стержнем mature secretory granules (MSGs) (Рис. 4). ISGs являются коротко живущими AP-1/clathrin-покрытыми компартментами, которые подвергаются гомотипическому слиянию и экстенсивной перестройке мембран во время базирующегося на микротрубочках транспорта на периферию клеток. На периферии клетки фурин удаляется из ISGs, очевидно благодаря brefeldin A (BFA)-чувствительному, ADP ribosylation factor-1 (ARF1)-зависимому ремоделированию ISG мембраны и возвращается в TGN. BFA блокада ремоделирования ISG скорее всего обусловлена ингибированием ARF1-обусловленного рекрутирования AP-1/clathrin и последующего построения мембран. Удаление furin из ISGs нуждается в CK2-фосфорилированном кислом кластере и PACS-1. Сходные результаты получены для возвращения CPD и vesicular monoamine transporter-2, которые указывают на важную роль CK2 и PACS-1 в созревании гранул. Некоторые фуриновые субстраты сортируются по регулируемым путям, это указывает на то, что фурин и CPD играют критическую роль в процессинге пропротеинов в ISGs.

Furin in development, homeostasis and disease


Известно, что фурин играет важную роль в эмбриогенезе, гомеостазе и болезнях.

To cleave or not to cleave — neuronal innervation and dementia.
16-kDa β-nerve growth factor (β-NGF) является прототипом целенаправленного производного NEUROTROPHIN, а биохимические исследования показали. что фурин является принципиальной эндопротеазой, которая расщепляет про-β-NGF (Рис. 6a). Неожиданно оказалось, что фурином обеспечиваемый процессинг pro-β-NGF контролирует, будет ли нейротрофин активировать путь выживаемости клеток или гибели клеток внутри иннервирующих нейронов. После процессинга β-NGF обеспечивает выживание клеток благодаря с высоким сродством связыванию с Trk proto-oncogene receptor tyrosine kinases, которая и обеспечивает трофические эффекты β-NGF и др.нейротрофинов. Напротив, секретируемый, не подвергшийся процессингу pro-β-NGF обеспечивает апоптоз за счет с высоким сродством связывания с 75-kDa neurotrophin рецептором (p75NTR). Этот рецептор является членом семейства tumour necrosis factor (TNF) receptor/FAS, которое противодействует передаче трофических сигналов с помощью β-NGF и Trk рецепторов. Регуляция активности фурина , следовательно, м. играть центральную роль в предопределении, какие нейроны будут формировать синаптические комплексы и какие нейроны будут погибать (Рис. 6a).
Этот контроль активности фурина м. обеспечиваться дополнительной онтогенетической программой. Напр., расщепление фурином трансмембранного рецептора Notch необходимо для высвобождения внутриклеточного домена Notch с помощью протеолиза γ-секретазой. Этот внутриклеточный домен затем связывается с регулятором транскрипции CSL ('C promoter binding factor/Suppressor of Hairless/Lag-1'), который активирует гены, необходимые для межклеточных коммуникаций во время развития. Напротив, нерасщепленный Notch обеспечивает отдельный сигнальный путь, который ингибирует клеточную дифференцировку.
Роль фурина в α-,β- и γ-секретазами обеспечиваемого процессинга β-amyloid precursor protein (APP) заключается в определении, будут ли APP-производные пептиды усиливать передачу сигналов NGF к иннервирующим нейронам, или будут вызывать массивную нейродегенерацию, которая сопровождает болезнь Алцгеймера. Внеклеточный домен APP расщепляется с помощью α-secretase? чтобы продуцировать растворимые APPs, которые усиливают анти-апоптическую и нейрозащитную активность NGF. Напротив, расщепление APP с помощью комбинации β- и γ-secretases высвобождает amyloidogenic βAPP1–40, βAPP1–42 и родственные пептиды, которые образуют амилоидные бляшки и ответственны за нейродегенерацию, которая характеризует Alzheimer's disease.
Подтверждена важная роль фурина в активации и α- и β-secretase. Два члена семейства ADAMs ('a disintegrin and metalloproteinase-like') zinc metalloproteinases — ADAM10 и ADAM17 — действуют как α-secretase. И ADAM10 и ADAM17 содержат пропептидазы, которые связаны с их каталитическими доменами с помощью консенсусного фуринового мотива и расщепление которых по этому сайту необходимо для их активации. Интересно, что PC7 м. активировать α-secretase в стандартных условиях, тогда как фурин м. активировать ее после активации с помощью protein kinase C, которая увеличивает α-secretase катализируемое высвобождение растворимых APP. β-secretase, называемая также β-site APP-cleaving enzyme (BACE), является type-I мембранным белком, который локализуется в TGN/endosomal системе и нуждается в протеолитическом удалении своего proregion с помощью фурина по минимальному фуриновому сайту (–Arg–Leu–Pro–Arg–↓). Сходство в переносе BACE и фурина еще раз подтверждает идею, что фурин является BACE-активирующим энзимом.
Alzheimer's является единственным типом AMYLOID DEMENTIA? при которой фурин играет критическую роль. Две отдельные мутации в BRI гене, который кодирует широко экспрессируемый type-II мембранный белок, обусловливает или href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/dispmim?176500" target=_new>familial British dementia (FBD) или familial Danish dementia (FDD). У здоровых индивидов, расщепление этого белка с помощью фурина или возможно с помощью PC7, по атипическому фуриновому сайту, который содержит лизин в положении P6 (–Lys–Gly–Ile–Gln–Lys–Arg–↓ (где Gln это глютамин)),высвобождает С-терминальный пептид в 23 остатка, функция которого неустановлена. Однако, нуклеотидная transversion или дупликация decamer в FBD и FDD, соотв., дает аберрантные амилоидогенные пептиды в 34 остатков в результате расщепления фурином.
Установлена роль фурина и в Finnish- и Danish-type семейного амилоидоза. Обе болезни вызываются мутациями, которые разрушают связывание кальция плазматическим gelsolin, который является циркулирующим чистильщиком внеклеточного актина. Нарушение связывания кальция вызывает аберантное расщепление фурином по С-терминальной стороне cryptic –Arg–Val–Val–Arg–↓ сайта, который обычно прячется в сердцевине молекулы дикого типа. Фурином обусловленное расщепление инициирует высвобождение 70-аминокислотного амилоидогенного пептида.

Furin, the TNFs, and the TGF-βs — short- versus long-range signalling in development and disease.

Протеолитическое высвобождение TNF-α из плазматической мембраны с помощью ADAM17 давно считалось ключевым механизмом, обеспечивающим juxtacrine- против paracrine-передачи сигналов этого цтокинового семейства. Недавно, однако, было установлено, что фурин контролирует ранги передачи сигналов др. члена семейства TNF — ectodysplasin-A (Eda-1; Рис. 6b). Eda-1 является типа II белком плазматической мембраны, который контролирует формирование некоторых эпителиальных тканей, включая волосы, зубы и eccrine потовые железы. Самая ранняя экспрессия Eda-1 и его рецептора — EDAR — обнаруживается в частично перекрывающихся регионах утолщенного зубного эпителия. Во время пролиферации эпителия в подлежащую мезенхиму формируется зубной зачаток, экспрессия EDAR обнаруживается на ведущем крае эпителиального слоя и она безусловно ограничивается ENAMEL KNOT, тогда как Eda-1 остается на расстоянии в несколько клеток от наружного эпителия. Фурином обусловливаемый сдвиг с juxtacrine к paracrine передаче сигналов м. сопровождать пространственное разобщение рецептора и лиганда (Рис. 6b). Мутации в фуриновом сайте расщепления у Eda-1 составляют ~20% от всех известных мутаций при X-linked hydrohidrotic ectodermal dysplasia, a блокирует способность Eda-1 передавать сигналы паракринно.
Важность фурина для передачи сигналов от двух др. членов семейства TNF — B-cell activating factor (BAFF) и proliferation-inducing ligand (APRIL) — указывает на распространенную роль фурина в контроле функции TNF.
Роль фурина в активации членов семейства TNF превосходтся его ролью в контроле передачи сигналов TGF-β-семейством. Инактивация гена фурина у мышей дает эмбриональный летальный фенотип с гибелью на ранних эмбриональных стадиях. Фурин необходим как для внеэмбриональных тканей, так и в кардиогенной мезодерме для обеспечения васкулогенеза желточного мешка и ventral closure, образования сердечной петли и аксиальной ротации. Неспособность поддерживать асимметрию эмбрионов скорее всего возникает в результате блокирования фурином-катализируемой продукции членов семейства TGF-β Nodal и Lefty-2. Согласно этой модели фурин ращепляет некоорые члены TGF-β , включая TGF-β1 и bone morphogenetic protein-4 (BMP-4). Более того, нарушение созревания pro-BMP-4 у четырехклеточных эмбрионов Xenopus laevis вызывает дорсализованный фенотип, который воспроизводит фенотип, который обнаруживается, когда нарушен путь передачи сигналов BMP-4.
Метод аутоактивации фурина, по-видимому, используется также и BMP-4 для котроля силы и рангов передаваемых сигналов во время эмбриогенеза. Фурин сначала расщепляет pro-BMP-4 по консенсусному фурновому сайту, который соединяет pro- и BMP-4 домены, (–Arg–Ser–Lys–Arg↓–), это сопровождается вторым расщеплением в минимальном консенсусном фуриновом сайте внутри пептида (–Arg–Ile–Ser–Arg↓–). Контекст двух сайтов гарантирует упорядоченный процессинг pro-BMP-4 и корректную активность этого MORPHOGEN. Присутствие консенсусного и ми нимального фуриновых сайтов в др. родственных BMP-4 сигнальных молекулах указывает на то, что метод 'один раз отмерь и два раза отрежь' используется для контроля сигнальных градиентов у многих организмов. Более того, этот метод м.б. распространен и на вирусный патогенез, при котором для генерация корректно упакованного respiratory-syncytical-virus (RSV) слитого белка необходимо последовательное расщепление в двух фуриновых сайтах, чтобы продуцировать инфекционное потомство.
Хотя фурином катализируемая активация TGF-β и важна для эмбриогенеза, но этот путь вызывает болезни у взрослых. Фурин и TGF-β кооперируют в новой позитивной петле обратной связи, которая усиливает rheumatoid arthritis (Рис. 6c). TGF-β д. связываться со своим собственным рецептором, чтобы стимулировать транскрипцию гена фурина с помощью SMAD2 и mitogen-activated protein kinase (MAPK) конвергентного пути. В synoviocytes, которые являются фибробластами- и макрофаг-подобными клетками, которые выстилают синовиальную оболочку суставов, амплифицированные уровни фурина и TGF-β в комбинации с повышенными уровнями ADAMTS-4 (a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs-4). ADAMTS-4 (ранее обозначаемый как aggrecanase-1) является членом нового семейства ADAMs протеаз и он деградирует белок хряща aggrecan и вызывает ревматоидный артрит (Рис. 6c).

Furin and tumour metastasis.
Фурин усиливает свою экспрессию в некоторых опухолях, включая non-small-cell легочную карциному, squamous-cell карциному головы и шеи, GLIOBLASTOMAS. Более того, повышенные уровни фурина в опухолях коррелируют с увеличениме агрессивности рака головы, шеи и легких и с увеличением уровней его субстратов — membrane type 1-matrix metalloproteinase (MT1-MMP). MT1-MMP активирует внеклеточную pro-MMP2 (pro-gelatinase), чтобы индуцировать выстрый рост опухоли и NEOVASCULARIZATION (Рис. 6d>). Активация MMPs классически использует механизм cysteine-switch, при котором атом цинка каталитического сайта соединяется с цистеиновым остатком в pro-region латентного pro-enzyme, включая связывание молекулы воды в активной протеазе. Однако, активация MT1-MMP и родственных членов семейства, очевидно, более сложная и нуждается в фурином-обуславливаемом расщеплении их pro-region. Ингибиторы фурина, включая α1-PDX, блокируют активацию MT1-MMP в карциномах головы, шеи и oral squamous-cell, это ведет к блокированию и активации MMP2 и метастазированию опухолей у трансплантированных мышей. Тот факт. что MT1-MMP/MMP2 ось существенна для ALVEOLIZATION эмбиональных легких представляет др. примен фурином активированного каскада, существенного для эмбриогенеза, но вредного у взрослых.
Второй фуриновый субстрат, insulin-like growth factor-1 (IGF1), усиливает свою активность в раке толстой кишке, молочных железах, простаты и легких. Его рецептор, IGF1R, который также является субстратом фурина, активируется на поверхности опухолевых клеток. IGF1 и IGF1R процессинг катализируется с помощью фурина или PC5/6A, а ингибирование этого процессинга с помощью α1-PDX снижает показатель числа, размера и васкуляризации развивающихся опухолей у трансплантированных мышей.

Фурин является не только PC, которая ассоциируетс плохим прогнозом для большинства опухолей. Гомолог фурина, PACE4 (Рис. 1; Табл. 1), усиливает свою экспрессию в опухолях груди, и экспрессия этой PC увеличивает инвазивность у мышей squamous-cell карцином за счет превращения их в более агрессивную, плохо дифференцированную, spindle-cell карциному. Все это указывает на то, что ингибирование PCs м.б. новым подходом к борьбе с различными формами агрессивного рака.

Anthrax, AIDS, Ebola — what next?

Анализ активации бактериальных токсинов указывает на разнообразие ролей фурином катализируемого процессинга пропротеинов на клеточной поверхности или в ранних эндосомах. Фурин на клеточной поверхности активирует токсин сибирской язвы — известное оружие биотерроризма (Box 2) — а также aerolysin токсин, агент, вызывающий большинство связанных с пищей забеолеваний и Clostridium septicum α-токсин, вызывающий газовую гангрену (Рис. 2).Расщепление каждого из токсинов с помощбью фурина является обязательной ступенью для приобретения токсином способности формировать поры в клеточной мембране.
Токсин сибирской язвы представлен тремя белками: PA, protective antigen, называемый так из-за его способности настраивать защитную иммунную систему против сибирской язвы; и два токсических белка — lethal factor (LF) или oedema factor (EF). LF является metalloproteinase, которая расщепляет MAPK киназу, тогда как EF является calmodulin-зависимой adenylate cyclase. 83-kDa PA молекула, которая секретируется бактериями, связывается с рецептором токсина сибирской язвы (ATR) и затем расщепляется на клеточной поверхности фурином, образуя ассоциированный с клеткой 63-kDa PA и свободный 20-kDa PA антиген (Рис. 7). Ассоциированная с клетокой PA молекула heptamerizes и связывается с двумя токсическими факторами и тем самым интернализуя их в ранние эндосомы. В ранних эндосомах кислая pH среда, PA гектамер формирует мембранные каналы, по которым токсические факторы выходят в цитоплазму клеток хозяина, это ведет к отеку, системному шоку и гибели (Рис. 7). В отсутствие фурина токсин неспособен осуществлять сборку и не является летальным. Более того, мутации расщепляющего сайта фурина дают доминантно-негативный белок, который связывается с ATR, но неспособен олигомеризоваться. И proaerolysin и Clostridium septicum α-токсин соединяются с glycosylphosphatidylinositol-закрепленными молекулами и также как и в случае PA, фурин расщепляет обе молекулы, чтобы они смогли сформировать ион-проницаемые гептамерные поры в плазматической мембране клеток хозяина, что ведет к отравлению клеток.
В ранних эндосомах фурин активирует и др. бактериальные токсины, включая Pseudomonas exotoxin A (PEA), shiga toxin (ST), shiga-like toxin-1 (ST-1) и diphtheria (DT) toxins (Рис. 2). В отличие от токсинов, активируемых на клеточной поверхности, эти токсинывсе являются A/B-type токсинами, которые содержат активный домен (A) и связывающий домен (B), который соединяется с сайтом расщепления фурина. После связывания рецептора каждый токсин подвергается эндоцитозу в ранние эндосомы, где он и расщепляется фурином. Расщепление ST, ST-1 и PEA с помощью фурина требует кислого pH, который характерен для ранних эндосомных компартментов, тогда как расщепление DT в этом не нуждается. Ингибирование активности фурина за счет внеклеточного высвобождения α1-PDX pfobpftn клетки от PEA и др. бактериальных токсинов. Чувствительность клеток к PEA увеличивается в отсутствие filamin (Рис. 4), который обычно прикрепляет фурин к клеточной поверхности, указывая тем самым, что филамин м. контролировать образование эндосомных furin-processing компартментов. Кристаллическая структура PEA показывает, что экспозиция молекулы кислым pH демаскирует сайт расщепления фурина, это, по крайней мере частично, объясняет потребность в кислом pH-зависимом процессинге фурином.
Неожиданно, расщепление фурином делает PEA, ST/ST-1 и DT неспособными транслоцироваться в цитозоль по трем разным путям. После расщепления DT B домен образует канал в мембране ранних эндосом, через который выходит A фрагмент в цитозоль клеток хозяина. Напротив, для высвобождения в цитозоль и PEA и ST/ST-1 нуждаются в ретроградном переносе в ER, откуда токсины, по-видимому, транслоцируются в цитозоль через through the SEC61 CHANNEL. Ретроградный перенос PEA нуждается в KDEL RECEPTOR, которые связываются с PEA после процессинга и задерживают токсин в ER, тогда как расщепленный ST/ST-1 переносится в ER по пути, который независим и от KDEL-рецепторов и от COPI, это указывает на то, что везикулярные оболочки иные, чем COPI управляют их направлением в ER. Однако, направление ST/ST-1 зависит от RAB6, малой GTPase, которая контролирует транспорт внутри Гольджи и cycling располагающихся в Гольджи glycosyltransferases через ER. Фурин м. направляться в ER, чтобы метаболизировать там неправильно упакованные рецепторы инсулина, это м.б. важным для определения, осуществляется ли сортировка фурина также через ST/ST-1 путь.
Большинство патогенных вирусов, включая avian influenza virus, HIV-1, measles virus и RSV, экспрессируют glycoproteinsоболочки, которые д.б. расщеплены консенсусным сайтом фурина, чтобы сформировать зрелые fusogenic гликопротеины оболочки. Напр., процессинг HIV-1 gp160 открывает N-терминальный gp41 fusogenic пептида, который содержится в трехмерном gp120/g41 комплексе оболочки. Может ли фурин или др. PCs (напр., PACE4, PC5/6B или PC7) конвертировать in vivo gp160, неизвестно. Lovo клетки, в которых отсутствует фурин, осуществляют процессинг HIV-1 gp160. Тем не менее ингибиторы фурина блокируют процессинг HIV-1 gp160 а, следовательно, и продукцию инфекционного HIV-1, также как блокируют и др. вирусы, которые нуждаются в процессинге их оболочечных гликопротеинов на консенсусном сайте фурина. Расщепление фурином HIV-1 gp160 происходит на С-терминальной стороне консенсусных последовательностей –Arg–Glu–Lys–Arg–↓. P3 glutamate этого сайта расщепления снижает эффективность процессинга фурином и консервирование жтого остатка в некоторых изолятах HIV вызывает сомнения о вовлечении фурина в процессинг gp160. В самом деле, мутация этого сайта расщеплния делает этот сайт, содержащим все основные аминокислоты (–Arg–Arg–Lys–Arg–↓)? это усиливает процессинг с помощью фурина. Однако, рекомбинантный HIV, содержащий этот all-basic сайт, является ослабленным, это указывает на селективные преимущества неэффективно расщепляемого –Arg–Glu–Lys–Arg–↓сайта в HIV-1.
HIV-1 ? по-видимому, обладает селективными преимуществами в росте за счет использования субоптимального фуринового сайта в своих оболочечных гликопротеинах, тогда как анализ вирусного тропиза — опредения молекулярных детерминант, которые делают вирус неспособным распространяться по телу — показал, что VIRULENCE многих смертельных вирусов (включая avian influenza virus, Newcastle Diseases virus и потенциально вирус Ebola) непосредственно скоррелирована со способностью этих вирусов включать консенсусный фуриновый сайт расщепления в свои оболочечные белки. Напр., патогенность птичьего influenza viruses непосредственно коррелирует с расщепляемостью его предшественника fusion белка HA0, который разрезается с помощью фурина, чтобы создать компетентный к слиянию HA1–HA2 комплекс. Сходно с HIV-1 gp160, расщепление HA0 экспозирует fusogenic пептид, локализованный на N-конце HA2, который м. сливаться с мембранами клеток мишеней.
Невирулентный avian influenza вирус, у которого отсутствует консенсусный фуриновый сайт в HA0, вызывает локальную инфекцию в кишечном тракте. Однако, мутация HA0 сайта расщепления для консенсусного фуринового сайта делает вирус неспособным активироваться с помощью повсеместно распространенного фурина, это препятствует распространению вируса через птиц. Эта способность связана со смертельными исходами flu в Hong Kong в 1997 (Box 2). Анализ H5N1 influenza вируса, который убил, по крайней мере, 6 людей, показал, что необходимы две мутации, чтобы получить смертельный вирус — мутация в субъединице вирусной RNA polymerase PB2, вместе с созданием тандемного фуринового сайта cleavage junction между HA1 и HA2 (–Arg–Glu–Arg–Arg–Arg–Lys–Lys–Arg–↓). К счастью, ослабленность INFECTIVITY этого вируса препятствует его распространению в популяциях. Тем не менее, склонность к быстрым мутациям и reassortment скорости в птичьем influenza вирусе и его способность непосредственно перкидываться от птиц на людей нель зя недооценивать.
Важность фурина для патогенной вирулентности касается и др. вирусов, включая вирус Ebola. Напр., высокая патогенность Ebola линий Zaire и Ivory Coast — которые вызывают массивную и внезапную (fulminant) геммарагическую лихорадку, которая характеризуется массивными внутренними и внешними кровоизлияниями и которая убивает 90% людей, контактирующих с ними — содержат консенсусный фуриновый сайт в сових оболочечных гликопротеинах (GP). Напротив, GP от относительно слабоай линии Ebola Reston не содержат консенсусного фуринового сайта. Этот изолят не является патогенным для человека. Однако, несмотря на очевидное структурное сходство между HIV-1 gp160, influenza virus HA и Ebola virus GP, фурином катализируемое расщепление GP необязательно для слияния с мембраной в модельных клеточных культурах. Отсутствие потребности в процессинге GP для слияния с мембранами согласуется с присутствием внутренних fusion последовательностей в Ebola GP и родственных flaviviruses. Как м. объяснить фурин-зависимый тропизм вируса Ebola? Это и тяжелая цитотоксичность и заметно увеличенная сосудистая проницаемость для GP в высоко патогенных линиях Ebola из Заира, но не для непатогенной линии Reston. Интересно, что критическая область GP, необходимая для такой токсичности находится рядо с фуриновым сайтом расщепления, указывая, что протеолиз м. открывать цитотоксический домен.


Сайт создан в системе uCoz