Посещений:
Гиалуронан

Роль в Морфогенезе

Hyaluronan and Morphogenesis
A.P.Spicer (andrewp_spicer@hotmail.com), J.L.Tien
Birth Defects Res. (Part C) V.72, P. 89-108, 2004



 | Disaccharide structure of hyaluronan. Hyaluronan is a linear, non-branching polysaccharide chain consisting of the disaccharide unit beta-1,4-N-acetylglucosamine linked beta-1,3 to residues of glucuronic acid. This disaccharide unit is repeated from approximately 2000-13000 times resulting in hyaluronan chains with molecular mass ranging from 1 - 6 x 106 Dalton



Hyaluronan (HA) не модифицированный glycosaminoglycan (GAG), обычный компонент внеклеточного матрикса (ВКМ). НА является критическим структурным компонентом большинства поддерживающих тканей у позвоночных, включая хрящи, кожу, гладкие мышцы и др. соединительные ткани. Подобно целлюлозе и хитину НА играет и инструментальную роль по определению размеров, очертаний, формы у позвоночных. Во-вторых, эти биополимеры м. действовать как мощные сигнальные молекулы, вызывающие выраженные изменения на клеточном уровне, которые транслируются в морфогенез на уровне ткани. НА, как теперь известно, передает сигналы по многим путям. В-третьих, энзимы, которые ответственны за биосинтез этих полимеров сходны на уровне первичных последовательностей и, по-видимому, обладают общим способом катализа и м. происходить от общего предшественника. Т.к. простой по структуре НА остаётся одним из наиболее сложных компонентов DRV в терминах мириадов путей и функций, с которыми он ассоциирует. Известно, что НА играет центральную роль во многих морфогенетических процессах. Считается, что способность синтезировать НА появилась относительно поздно у метазоа, непосредственно перед появлением ветви позвоночных. Этим он отличается от др. GAGs, таких как гепаран и хондроитин-сульфат, которые обнаруживаются и у чрезвычайно примитивных метазоа.

Biophysical Properties


Слова "гиалуроновая кислота" или что правильнее гиалуронан часто ассоциируются в голове с большой "липучкой" ("goo"), которая сидит в соединительной ткани, осуществляя свой действие пассивным образом. В действительности НА является одним из наиболее функционально разносторонних полимеров. Во-первых, он чрезвычайно прост, будучи синтезирован как гомополимер из [β1,3-GlcNAc-β1,4-GlcA]n в виде одной молекулы, имеющей до 104 дисахаридных субъединиц и мол. массу до мегадальтон. Т.к. он синтезируется в виде большого гомополимера, то НА м.б. деградирован на более мелкие формы, которые обладают иными биофизическими свойствами и биологическими ролями. Во-вторых, НА является полианионом, что делает его молекулой, заполняющей большое пространство. Если сравнить такого же веса фибриллярный коллаген с НА, то объём, занимаемый НА, будет примерно в 10000 раз больше объёма, занимаемого коллагеном. Т.к. НА оказывает существенное влияние на объём и архитектуру ткани, то делает он это как менее многочисленный (на молярном уровне) компонент ВКМ. В-третьих, благодаря своему большому размеру и зарядам повторяющейся природы, одиночный НА полимер способен осуществлять взаимодействия с умеренным связывающим сродством со многими связываемыми белками, даже образуя мостики для рецепторов на соседних клетках или закрепляя матричные комплексы на клеточной поверхности посредстом рецепторов. В-четвёртых, высокая молекулярная масса НА м. формировать само-ассоциирующиеся, четвертичные структуры, формирующие гидрофобные участки и большие запутанные сети. Это является общим свойством высокомолекулярной массы НА. НА с низкой мол. массой не обладают таким свойством, НА олигосахариды (о-НА) обычно становятся свободными агентами. Это м. объяснить частично сигнальный потенциал НА низкой молекулярной массы по сравнению с высокомолекулярными НА. В-пятых, о-НА чрезвычайно изменчивы в растворе и способны воспринимать многомерные конформации, на которые влияет катионовая среда и полипептиды, с которыми они связаны. Возможно, что некоторые структуры, принимаемые НА, представляют собой решения биологических проблем, которые ещё не невозможно себе представить.

Biosynthesis


Биохимики по хим. структуре НА быстро предсказали, что, по крайней мере, два энзима необходимы для его биосинтеза: один энзим и один glycosidic linkage. Установив, что биосинтез происходит на внутренней стороне плазматической мембраны, так что вновь синтезированный полимер быстро оказывается на клеточной поверхности, было предположено, что ферментативная кухня д.б. тесно связана с механизмом экспорта или трансмембранными каналами на клеточной поверхности. В противоположность этим предположениям биосинтетическая и экспортная machinery биосинтеза НА ,по-видимому, кодируется одиночным полипептидом как у прокариот, так и эукариот. В прис3тствии достаточного субстрата плюс источника ионов металла (обычно магния) НА synthase (HAS) м. катализировать быстрый биосинтез продукта высокой мол. массы in vitro. Более того, если она экспрессируется в гетерологических интактных клетках, то одна HAS м. управлять как биосинтезом, так и появлением на клеточной поверхности высокомолекулярной массы НА. Это указывает на то, что, во-первых, одиночный полипептид обладает двумя отдельными glycosyltransferase активностями и, во-вторых, тот же самый полипептид каким-то образом специфицирует или координирует механизм транслокации.
Впервые ген HAS был мол. клонирован у Xenopus laevis (xlHAS1) благодаря дифференциальной экспрессии при скринировании генов, которые экспрессируются во время гаструляции. Т.к. паттерн его экспрессии был выявлен во время гаструляции и нейруляции и получены поликлональные антитела, то настоящее биологическое значение этого полипептида оставалось неизвестным пока не был клонирован второй HAS ген из группы А стрептококков S.pyogenes (spHAS). Оба фермента обладали общими последовательностями и были сходны с chito-oligosaccharide synthase, NodC, из Rhizobium meliloti. Это привело к идентификации семейства HAS позвоночных. Три отдельных, но родственных HAS гена выявлены у позвоночных HAS1-3 и клонированы. Теперь известно, что каждый из трёх кодируемых полипептидов достаточен для катализа биосинтеза НА, если достаточно субстрата. Далее было установлено, что имеются определенные различия в значениях Vmax и Kmax и степени полимеризации помимо различий в относительной стабильности каждого полипептида. По стабильности три энзима были ранжировны HAS3 → HAS2 → HAS1. Точно также они располагаются и в отношении Vmax. Km значение для uridine 5'-diphosphate (UDP)-GlcNAc было значительно выше для HAS1. Следовательно, возможно, что т.к. любой HAS полипептид способен управлять биосинтезом НА, то эти три полипептида не являются функционально перекрывающимися in vivo , несмотря на перекрывание доменов их экспрессии. Первоначально было предположено, что HAS3 м.б. ответственным за биосинтез низкомолекулярных (<2 x 105 Da) HA. Было подтверждено in vitro, что HAS3 действительно синтезирует НА низкомолекулярной массы по сравнению с HAS1 или HAS2. Однако, в интактных трансфицированных клетках все три HAS белка управляли биосинтезом и высвобождали НА с высокой мол. массой (менее 1 х 106). Различия в степени полимеризации, которые наблюдаются in vivo и in vitro для HAS3 указывают, что использование субстрата или доступ м.б. изменены, когда клетки фрагментированы. Возможно, что доступность субстрата in vivo м. оказывать влияние на степень полимеризации, в частности для НА. синтезированного с помощью HAS3. Следует отметить, что так как др. GAGs , такие как гепаран и хондроитин сульфат синтезируются внутри цистерн Гольджи, НА синтезируется на внутренней стороне плазматической мембрны. Т.о., НА синтазы используют предположительно цитозольный пул субстрата. На биосинтез НА м. влиять флюктуации в доступности субстрата в значительно большей степени, чем на биосинтез др. GAGs. Описан курьёзный случай в отношении утилизации субстрата и активности HAS. Обработка α-hemolysin создаёт 1-2 nm поры в клеточной мембране, через которые свободно диффундируют АТФ, UPD-сахара и многие др. малые молекулы. Биосинтез хондроитин-сульфата в хондроцитах их хондросаркомы крыс снижался до 5% от контрольного уровня в течение 2-4 ч (как и уровни АТФ), когда клетки обрабатывали α-hemolysin. Напротив биосинтез НА поддерживался на уровне 80% от контроля в течение 8 ч и снижался только до 65% через 24 ч. более того, биосинтез НА возвращался к контрольному уровню при добавлении свежей среды, тогда как биосинтез хондроитин-сульфат не восстанавливался. Исходя из предположения, что HAS используют цитозольный пул субстрата, то эта находка ничего нового не добавляет. Как м. синтез НА существенно не меняться, когда клетки истощены по АМФ и, по-видимому, по UDP-сахарам? Происходит ли секвестрация UPD-сахаров в месте биосинтеза НА за счёт нового механизма упаковки?
Каждый HAS белок позвоночных имеет мол. массу около 63 rLf b? по-видимому, кодирует интегральный трансмембранный белок с 5-7 трансмембранными доменами. Эта топология сходна с той, что известна для др. членов семейства II glecosyltransferases, включая spHAS, NodC и curdlan synthase/ Эксперименты по рентгеновскому инактивированию показали, что и xlHAS1 и spHAS существуют в виде мономеров внутри плазматических мембран. Трудно сопоставить относительно небольшие размеры HAS полипептидов с их множественными функциями. Has1 мыши был очищен и подобно белку spHAS он способен синтезировать НА высокой мол. массы in vitro при добавлении Mg2+, UPD-GlcA, UPD-GlcNAc при соотв. буфферных условиях. Более того, xlHAS1 обладает сильной HAS активностью при экспрессии у пивных дрожжей S.cerevisiae при обеспечении субстратом. S.cerevisiae один из редких эукариот, лишенный UPD-GlcA и неспособный синтезировать НА в обычных условиях. Помимо HAS активности мышиный Has1 обладает низкой, но обнаружимой glycosaminyl-transferase activity, которая ведет к синтезу коротких chito-олигосахаридов [-GlcNac-β1, 4-]1-5. Это согласуется с идентичностью последовательностей, которой HAS белки обладают с chitin synthases и др. родственных семейств II glycosyltransferases, большинство из которых обладает β1,4 гликозилтрансферазной активностью. Первоначально исследователями было предположено, что xlHAS1 и ген Has2 рыбок данио кодируют chitin synthases скорее, чем HAS? и что эти энзимы синтезируют и секретируют chito-олигосахариды, играющие, по-видимому, критическую роль непосредственно после гаструлции у позвоночных. Это остаётся спорным, возможно, что один или несколько HAS белков позвоночных м. действовать как синтазы хито-ологосахаридов при определенных условиях, напр., при ограничении UPD-GlcA или благодаря взаимодействию с модифицирующими или акцессорными белками.
Биохимические исследования показали, что три самостоятельные HAS полипептида м. обеспечивать гибкость в контроле относительных количеств и длин НА полимеров. Кроме того, с тремя отдельными генетическими локусами пространственный и временной контроль доменов экспрессии м. варьировать. Во время эмбриогенеза мыши три Has гена экспрессируются в виде самостоятельных пространственных и временных паттернов. Has1, ортолог xlHAS1 у млекопитающих, экспрессируется только во время гаструляции и ранней нейруляции, как и xlHAS1. Has2 является доминирующей HAS во время эмбриогенеза. Его паттерн экспрессии хорошо соответствует ранее описанному пространственному и временному распределению НА во время эмбриогенеза. Основные сайты экспрессии включают развивающееся сердце, где он специфически экспрессируется в эндокарде и клетками внутри эндокардиальных подушек, развивающийся скелет, где он экспрессируется на ключевой стадии во время хондрогенеза. Has2 экспрессируется также в во вновь возникающих клетках нейрального гребня. Has3 экспрессируется более ограничено у эмбрионов мышей, внутри развивающихся зубов, усах и волосяных фолликулах. В каждом случае экспрессия ограничивается клетками конденсирующейся мезенхимы. В развивающихся эмбрионах Xenopus Has3 экспрессируется только в развивающемся внутреннем ухе и цементной железе.
Биосинтез НА м. стимулироваться многими ростовыми факторами и цитокинами. В подавляющем большинстве случаев транскрипционное усиление транскрипции HAS2 осуществляется преимущественно за счёт механизма стимуляции биосинтеза НА. Экспрессия HAS2 усиливается с помощью членов семейства TGF-β/BMP, interleukin-1 β (IL-1β), TNF-α, EGF, kerationocyte growth factor (KGF) и многих др. факторов. HAS2 потенциально ингибируется с помощью глюкокортикоидов посредством комбинации транскрипционной репрессии и увеличения оборота мРНК. HAS2 является ключевым энзимом для нескольких взрослых тканей, таких как дерма и яичники.
Фенотипы, возникающие в результате целенаправленной инактивации мышиных Has генов, представляют важные указания на функции НА во время эмбриогенеза. Has2 является ключевым энзимом во время эмбриогенеза и нехватка Has2 ведет к эмбриональной летальности на Е10.5. Среди прочих выделяются дефекты желточного мешка, эмбрионального васкулогенеза, уменьшение DRV-предопределяемых пространств и отсутствие образования эндокардиальных подушек.

Degradation


Способность деградировать или обменивать НА также важна как и способность синтезировать молекулу. НА м.б. деградирована вне клеток с помощью химическо/механического расщепления или с помощью ферментативной деградации и внутриклеточно в лизосомах с помощью hyaluronidases. Способность ферментативно деградировать НА м. возникнуть до способности синтеза НА у метазоа. Нематоды C.elegans, напр., обладают гиалуронидазой, но не синтезируют НА. Более того, большинство ядов ос и пчёл содержит гиалуронидазный компонент, который гомологичен гиалуронидаза позвоночных. Большинство гиалуронидаз м. действовать также на родственные GAGs, такие как хондроитин сульфаты, очевидно, что гиалуронидазная активность энзимов беспозвоночных используется вторично по отношению к первичной ферментативной активности на хондроитин сульфат и др. GAGs. У позвоночных семейство генов ген hyaluronidase (HYAL) описано с двумя кластерами генов, расположенными на хромосомах 3 и 7 человека. Эти кластеры генов включают HYAL1-4, HYALP1 и РН-20 (Spam in the mouse). Только HYAL1, HYAL2 и РН-20, как было установлено, кодируют гиалуронидазную активность. HYAL3, HYAL4 и HYALP1 м. обладать активностями против др. GAGs, таких как хондроитин сульфат, но это ещё не доказано. Основным метом действия для HYAL1 являются лизосомы, тогда как РН-20 появляется на клеточной поверхности в виде GPI-прикрепленного белка, а HYAL2 м.б. обнаружен на клеточной поверхности в GPI-связаной форме, а также внутри лизосом. Интересно, что HYAL2 неспособна деградировать НА высокой мол. массы на дисахариды, это делают HYAL1 и РН-20. Скорее всего HYAL2 переваривает НА и даёт НА полимеры низкой молекулярной массы в 20-кДа.
Некоторые люди лишены активности HYAL1 из-за наследования двух функционально нулевых HYAL1 аллелей. У таких индивидов не выявляется в сыворотке гиплуронидаза, они имеют низкий рост, легкие черепнолицевые аномалии и часто вынуждены оперироваться для удаления околосуставных масс мягкой ткани (Natowitcz et al., 1996). у мышей потеря функции Hyal2 вызывает раннюю эмбриональную летальность, указывая тем самым, что или деградация НА и/или передача сигналов через Hyal2 посредством НА и/или др. лигандов необходимы для эмбриогенеза. Возможно, что Hyal2 действует на клеточную поверхность, чтобы расщеплять НА высокой мол. массы на маленькие в 20 кДа фрагменты, которые высвобождаются из локального матрикса и действуют в исполнение своих сигнальных способностей или посредстовм Hyal2 или с ней взаимодействующих белков, или посредством др рецепторов НА клеточной поверхности. HYAL2 человека, как было показано, взаимодействует с рецепторной тирозин киназой, RON. Соединение на клеточной поверхности GPI-закрепленной HYAL2 с RON ведет к тому, чтобы удержать RON в неактивном состоянии. Неизвестно, вызывает ли взаимодействие НА с HYAL2 смещение RON, активацию тирозин киназной активности, или напротив, усиливает связывание HYAL2 с RON. Возможно, что HYAL2 м. действовать и как hyaluronidase и как рецептор. Многие GPI-закрепленные белки ассоциируют с членами семейства src тирозин киназ. Т.о., HYAL2 м. действовать осуществляя свою сигнальную способность посредством RON и/или члено семейства src. PH-20 м. действовать как НА рецептор на спермиях с связыванием НА, инициирующим возрастание внутриклеточного кальция.
Кластер генов HYAL идентифицирован также как супрессор опухолей. Потеря гетерозиготности по этому сайту наблюдается при многих раках, включая мелкоклеточную лёгочную карциному и сквамозно клеточные крациномы головы и шеи. При определенных опухолях наблюдается неправильная регуляция экспрессии.

Binding Proteins: Hyaladherins


НА координировано синтезируется и выдавливается через клеточную мембрану, появляясь быстро на клеточной поверхности. Считается, что все НА сначала синтезируются в виде высокой молекулярной массы (более 1 х 106) полимера. Появившись на клеточной поверхности НА м. иметь множественные судьбы. Во-первых, он м. взаимодействовать аутокринным способом с НА рецепторами клеточной поверхности на той же самой клетке. Это м. приводить к его эндоцитозу. Это м.б. нормальным путём для НА, который синтезируется мигрирующими или делящимися клетками; прежде чем подвергнуться рециклингу НА делает свою работу. Напротив, хотя и менее распространено, вновь синтезированный НА включается в довольно стабильный околоклеточный1 матрикс вокруг клетки из которой он произошёл. Период полу-жизни на клеточной поверхности вновь синтезированного НА зависит как от типа клетки, так и повреждения клетки. Напр.. на клеточной поверхности мигрирующих и делящихся клетках НА оборачивается очень быстро. Во-вторых, вновь синтезированный НА м. действовать паракринным способом на рецепторы клеточной поверхности соседней клетки или клеток. Благодаря своим большим физическим размерам одиночный полимер НА высокой мол. массы способен вступать в связующие взаимодействия с более чем одной клеткой. Это м.б. важным для межклеточной адгезии, которая происходит во время некоторых морфогенетических процессов. В-третьих, вновь синтезированный НА м. высвобождаться и включаться в локальный DRV благодаря взаимодействиям со специфическими НА связывающими белками. Формируемые комплексы м. иметь чрезвычайно длинный период полу-жизни до 10 лет или они м. иметь сравнительно небольшой период полу-жизни. НА создаёт общий остов, вокруг которого собирается варьирующий ассортимент комплексов ВКМ. Внутри многих тканей НА создаёт организующее ядро, вокруг которого собирается обширный матрикс, хотя сам НА м. составлять минимальную концентрацию среди компонентов DRV/ Одни НА полимер м. б. соединён с сотнями белков DRV? которые в свою очередь м. взаимодействовать с др. белками матрикса и т.д. Эти большие матричные комплексы м. также быть связаны с клеточной поверхностью посредством НА рецепторов.
Большинство из известных рецепторов НА и связывающих белков приходится на сверхсемейство полипептидов, наз. link protein superfamily. Эти белки обладают общим глобулярным связывающим доменом, называемым связующим модулем. Этот модуль структурно сходен со связывающим доменом С-типа лектина, но он не зависит от Са2++ при связывании НА. Помимо законсервированных остатков, которые обеспечивают контакт с полимером НА, каждый связующий модуль содержит 10 цистеиновых остатков, которые формируют 5 внутримолекулярных дисульфидных мостиков. НА рецепторы обладают одним связующим модулем, тогда как почти все остальные связующие модули у членов сверхсемейства представлены тандемами сцепленных модулей. Link module сверхсемейство включает предположительно 5 рецепторов и 9 белков DRV. Рецепторы включают СВ44б lymphatic vein endothelium receptor-1 (LYVE), Styabilin-1 и -2 и не охарактеризованный ген человека 0527 (KIAA0527), тогда как белки DRV включают: 4 лектина ( аггрекан, бревикан, неурокан и версикан); 4 НА and proteoglycan binding link белки (HAPLN1-4); и tumor necrosis factor stimulated gene 6 (TSG6). Ясно, что связующие модули внутри каждого гена имеют общее эволюционное происхождение. Более того, ген первого связующего белка (HAPLN), по-видимому, возник как частичное удвоение исходного гена lectican . Удвоение этого гена снова произошло непосредственно перед появлением ветви позвоночных.
CD44 описан как принципиальный рецептор для НА. В самом деле CD44 экспрессируется широко и играет основную роль во многих типах клеток и тканей. CD44 экспрессируется в виде множественных отличающихся форм благодаря альтернативному сплайсингу множественных вариантов экзонов. По крайней мере, один из этих вариантов создаёт частичный (part-time) гепаран сульфат протеогликан со сплайст-доменом, включающим сайт GAG прикрепления. Экспрессия др. вариантов коррелирует с плохим прогнозом или метастазами при некоторых типах рака. Наиболее распространённой формоё CD44 является CD44s (standard) или CD44H (hematopoetic). CD44 соединяется с НА посредством одиночного внеклеточного домена сцепления и взаимодействует с актиновым цитоскелетом посредством своего цитоплазматического домена, которые соединяется с группой ERM белков, erzin, radixin и moesin. Минимальным участком связывания НА на CD44 является НА6 (три дисахарида). о-НА м. эффективно вытеснять на клеточной поврехности связанный с CD44 НА и блокировать функцию CD44. Помимо образования гомодимеров CD44 м. димеризоваться с др белками, ассоциированными на клеточной поверхности, включая рецепторную тирозин киназу erbB2, члена семейства EGF рецепторов. Соединение НА с CD44 м. активировать erbB2. Кроме того, CD44 м. формировать комплекс с фактором обмена гуанинового нуклеотида, Tiam1, посредством которого НА-CD44 связь м. активировать передачу сигналов Rac1, ведущую к реорганизации цитоскелета. Взаимодействие НА-CD44 м. играть роль в адгезии клеток с клеточным матриксом, регулируя аспекты клеточного движения и клеточной адгезии. CD44 представляет собой один из основных эндоцитотических рецепторов для НА. В самом деле, важность CD44 в привлечении и обмене НА продемонстрирована на CD44-/- животных.
Фенотип CD44-дейицитных мышей указывает на то. что дополнительные рецепторы НА м. существовать, которые возможно м. замещать функцию CD44. Недавно идентифицировано несколько дополнительных рецепторов. LYVE-1 наиболее близок к CD44, но обладает уникальными трансмембранными и цитоплазматическим доменами. Он преимущественно экспрессируется эндотелием лимфатических вен и способен связывать и интернализовать НА. Stabilin-1 и -2, известные также как FEEL-1 и FEEL-2/FEX2 или НА receptor for endocytosis (HARE) являются двумя новыми рецепторами НА на клеточной поверхности, каждый из которых содержит множество fasciclin (F) доменов, EGF link repeats (E), laminin-type EGF repeats (E), single link module (L), который локализован непосредственно внеклеточно от трансмембранного домена. Мультидоменовая структура внеклеточной части этих полипептидов указывает на то, что оба осуществляют связующие взаимодействия с НА плюс с некоторыми др. белками или углеводами. Показано, что эти белки являются уборщиками рецепторов, соединяясь и эндоцитозируя advanced glycation end products (AGEs) и acetylated low density lipoproteins (Ac-LDL) в дополнение к Грам- и Грам+ бактериям. Возможно, что быти белки играют также роль в межклеточной или клетка-матрикс адгезии.

TABLE 1. Database Information for Genes Directly Involved in Hyaiuronan
Biosynthesis, Degradation and/or Function
- Human Mouse
Gene/protein unigene/ unigene/acc Human EST acc # Mouse EST ace #
name acc#a # (IMAGE)b (IMAGE #)
HASl Hs.57697 Mm.2542 BM543754 (5589083) AW488161
HAS2 Hs. 159226 Mm.5148 W21505 (307903) CF535266 (30533251)
HAS3 Hs.85962 Mm.56986 CA487249 (6718301) CA324064 (6822281)
HYAL1 Hs.75619 Mm.10305 BM924343 (5760636) AI116996 (1481836)
HYAL2 Hs.76873 Mm.4834 BQ954719 (6419982) BI157139 (5062350)
HYAL3 Hs.129910 Mm.214645 BC012892 (3860558) BC018457 (3592874)
HYAL4 Hs.28673 XM_132998 BX117836 (140198) XM-.132998
HYALP1 Hs.381305
PH-20 (SPAM1) Hs. 121494 Mm.4688 BG773088 (4838230) BY705833
MGEA5 Hs.5734 Mm.122725 BC047877 (5580702) BC054821 (6515250)
CD44 HS.3O6278 Mm.24138 BM020134 (5430193) BE37113 (3587932)
LYVE1 (XLKD1) Hs.17917 Mm.10817 BI763579 (5190393) BE847124 (3417397)
STAB1 Hs.301989 Mm.220821 AI824507 (2274999) AI641915 (1097600)
STAB2 Hs.408249 Mm.40289 H49088 (274310) BQ952114 (6466509)
KIAA0527 Hs. 196647 Mm.243704 AI417579 (2115030) BF780667 (4221992)
TSG6 (TNFAIP6) Hs.407546 Mm.3509 BI755270 (5193219) BF147368 (3168607)
HAPLNl'(CRTLl) Hs.2799 Mm.266790 BG283479(4519886) BQ900511 (6314898)
HAPLN2(BRAL1) Hs.410719 Mm.84180 BI824586 (5174906) BU534446 (6561734)
HAPLN3 Hs.447530 Mm.178759 BI911432 (5212427) BG342747 (4482089)
HAPLN4 (BRAL2) AY262756 Mm.152048 AA984368 (1629878) BF323156 (3813088)
AGGRECAN Hs.2159 Mm.2759 BG720087 (4823544) BE531368 (3595033)
BREVICAN Hs.158515 Mm.4598 BG911491 (4941075) BM944051 (5695027)
NEUROCAN HS. 169047 Mm.268079 R25707 (36464) BM950354 (5686677)
VERSICAN Hs.434488 Mm.4575 BI910988 (5218295) BF178504 (4038424)
RHAMM (HMMR) Hs.72550 Mm.116997 BF029349 (3997460) AW321225 (2616154)
HABP1 (C1QBP) Hs.78614 Mm.30049 BG741236 (4778914) AW911746 (3157420)
CDC37 Hs. 160958 Mm.4117 BF183054 (4040382) BF023079 (3470486)
IHABP4(HABP4) Hs.301839 Mm.40989 BI547135 (5261539) AW742381 (2780069)
ITI (AMBP) Hs.76177 Mm.2197 BQ646651 (6300544) AI595801(1925228)
LAYILIN Hs.317614 Mm.213428 BI821869 (5176719) CB574305 (30277189)

aUnigene entries can be accessed through the National Center for Biotechnology Information (NCBI) web address: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=unigene. Once in the database, simply type the Unigene accession number in the search window. Use the entire number with the Hs or Mm prefix to denote human or mouse Unigenes. Where Unigene entries havVnot yet been created (mouse Hyal4 and human HAPLN4), Accession Numbers for the respective nucleotide sequences are provided rather than Unigene numbers.
bIMAGE clone numbers can be used to rapidiy obtain the respective cDNA clones from a variety of sources, usually as frozen bacterial stocks or stab cultures. Ace #s represent database Accession Numbers for each nucleotide entry.

Значение свойств связывания НА Stabilin-1 и -2 неясно. Однако, STAB2/FEEL-2/FEX2, по-видимому, м.б. главным рецептором для привлечения НА в печени, а STAB1/FEEL-1, по-видимому, участвует в ангиогенезе. Наконец, KIAA0527 полипептид кодирует новый НА рецептор с одиночным связывающим доменом и высоко законсервированным уникальным цитоплазматическим доменом. Неясно. является ли этот полипептид компетентным связывать НА, т.к. связующий модуль содержит добавочный непарный цистеин, а один из 10 законсервированных цистеинов смещен по отношению к остальному связующему домену. Очевидно, что белок кодирует НА рецептор или рецептор для тесно родственного GAG, такого как хондроитин сульфат и что он димеризуется благодаря одиночному непарному цистеину. KIAA0527 обладает также фибронектин связывающей трипептидной последовательностью, известной как мотив RGD внутри внеклеточной порции, что делает возможной связь интергина.
Имеется, по крайней мере, 6 дополнительных НА связывающих белков, 4 из которых имеют в основном внутриклеточную локализацию. Сообщения о внутриклеточных НА являются интригующими. Наши данные предполагают. что внутриклеточный НА не возникает благодаря непосредственному синтезу и высвобождению НА в цитоплазму с помощью субпопуляции HAS . Т.о., путь с помощью которого НА достигает цитоплазмы полностью неизвестен, но предполагается, что он начинается с внеклеточных НА.
Внутриклеточные НA связывающие белки включают Receptor for hyaluronan-mediated motility (RHAMM), hyaluronan binding protein 1 (РФИЗ1) (splicing factor 2 and its co-purified protein 32 [SF2/P32]), cell division control protein 37 (CDC37) и intracellular hyaluronan binding protein 4 (IHABP4). Большинство из этих белков дополнительно связывает и др. лиганды. RHAMM локализуется в первую очередь в микротрубочках, но действует также как рецептор на клеточной поверхности для НА. Передача сигналов через RHAMM вызывает быструю разборку фокальных контактов посредством передачи сигналов src. Кроме того RHAMM связывается с extracellular signal regulated kinase (ERK) внутри клетки и регулирует активность ERK. Неизвестно, происходит ли взаимодействие RHAMM и НА внутри клетки действительно исключительно через взаимодействие RHAMM с ERK. Layilin является не связывающим НА рецептором, который накапливается в мембранных ruffles. Тогда как этот белок не имеет связующего модуля, он имеет С-типа lectin связывающий домен, который наиболее вероятно представляет собой НА связывающий домен. Внеклеточная часть layilin связывает НА, но не др. GAGs , тогда как его цитоплазматических домен связывает talin, связующий белок для актинового цитоскелета.
В целом имеет 6 известных рецепторов клеточной поверхности (CD44, RHAMM, LYVE-1, STAB1, STAB2, layilin) для НА плюс один предполагаемый не охарактеризованный рецептор (KIAA0527). Множесвенные рецепторы делают возможными многочисленные альтернативные пути, с помощью которых НА м. сигнализировать об изменениях в клеточном поведении и/или м.б. эндоцитозирован данной клеткой.

Signaling: Angiogenesis


o-HAs являются мощными индукторами ангиогенеза. Высокой мол. массы НА является ингибитором в этом отношении, указывая тем самым, что имеется действительно важное функциональное различие между HAs, различающихся по мл. массе. о-HAs из 3-10 дисахаридных субъединиц стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток, миграцию и образование их врастания и является ангиогенным при оценке методом chorioallantogenic membrame (CAM) кур и при инфаркте миокарда. Установлено, что о-HAs действует на эндотелиальные клетки посредством, по крайней мере, двух рецепторов, а именно CD44 и RHAMM, хотя возможно, что один или белее из др. 5 рецепторов также м. играть роль. В некоторых типах клеток, низкомолекулярной массы или о-HA м. индуцировать ras/protein kinase (PKC) зависимую активацию nuclear factor-kappa B (NF-κB) посредством CD44. Антитела, блокирующие функцию CD44 были способны снижать клеточную реакцию пролиферации и миграции эндотелиальных клеток на о-HA, o-HA-RHAMM связывание , были также способны индуцировать быстрое фосфорилирование/дефосфорилирование focal adhesion kinase (FAK), paxillin и ERK1/2, вызывая реакцию клеточной пролиферации.
Идентифицировано большое разнообразие сигнальных путей, посредством которых НА м. влиять на поведение эндотелиальных клеток. На Рис. 3 продемонстрированы некоторые свойства НА сигнальной системы. В bovine aortic endothelial cells (BAEC) o-НА м. активировать множественные пути посредством CD44, включая PLCγ1/PKCα/Raf-1/ERK1/2, src/Shc/Ras/Raf/ERK1/2 и Shc-Grb2-Sos/PKCξ/NF-κB, вызывающие пролиферативный ответ клеток, и PLCγ1/PKCβ и PKCε/cytoskeleton, ведущие к реакции заживления ран и клеточной миграции. Т.о., одиночный НА рецептор м. передавать сигнал, изменяя клеточное поведение посредством разных путей. Общим свойством передачи сигналов НА является клеточная пролиферация и миграция клеток. Др. общим свойством является быстрота реакции на НА и мощь (potency) НА низкой мол. массы. Мы полагаем, что это наиболее вероятно, что даже в тех примерах, в которых НА высокой мол. массы обнаруживают очевидный эффект в терминах клеточного поведения, НА высокой мол. массы или загрязнены небольшими количествами НА низкой мол. массы или деградирует внеклеточно перед передачей сигналов.
В одном из исследований было установлено влияние НА на поведение клеток и экспрессию генов в модельной in vitro системе . НА высокой мол. массы оказывает существенный эффект, если он добавляется к коллагеновому гелю, в который засеяны клетки уретрического зачатка. НА увеличивает пролиферацию и рост клеток трехмерных трубочек, которые растут в геле и число формирующихся веточек. Выявлен эффект НА на экспрессию анти-апоптических генов, маркеры пролиферации, матричные металлопротеиназы и матричные рецепторы, включая усиление экспрессии CD44.

Development of the Vertebrate Skeleton


Три эмбриональных клона участвуют в создании скелета. Склеротом генерирует аксиальный скелет, латеральная пластинка мезодермы генерирует скелет конечностей, а краниальный нейральный гребень даёт бранхиальные дуги, черепнолицевые кости и хрящи. НА ассоциирует с мигрирующими клетками во время морфогенеза всех трёх клонов. Во всех случаях предсуществующая мезенхима в конечном итоге замещается костью одним из двух способов, эндохондральной оссификацией или внутримембранозной оссификацией. Большинство скелетных элементов формируется с помощью эндохондральной оссификации, что связано с трансформацией мезенхимной популяции в хрящевые промежуточные образования, которые действуют как калька для последующего образования костей и суставов. Остальные кости, подобно костям черепа и лица, формируются с помощью внутримембранозной оссификации, где хрящевые промежуточные образования полностью отсутствуют, а кость образуется непосредственно из мезенхимных конденсатов. Между костями образуются три типа сочленений (неподвижные, смешанные сочленения и подвижные или синовиальные суставы).

Chondrogenesis and Joint Development in Vertebrate Skeleton


Морфогенез хряща заключается в быстрой пролиферации, конденсации и дифференцировке мезенхимы, он м.б. подразделен на отдельные события. В конечностях хондрогенез начинается в результате пролиферации субнабора мезенхимных клеток, которые становятся предетерминированными стать хондрогенными клетками. Эти клетки затем продуцируют компоненты ВКМ и агрегируют, формируя конденсированные области в позиции будущих скелетных элементов. Внутри конденсатов мезенхимные клетки дифференцируются в хондроциты. В некоторых местах хондроциты инструктируются сформировать промежуточную зону, будущие места образования суставов и суставных компонентов. Кавитация происходит внутри промежуточной зоны, приводя к образованию заполненного жидкостью пространства. В местах, где происходит обязательно образование кости, хондроциты дифференцируются через пролиферативную, пре-гипертрофическую и гипертрофическую стадии. Внутри гипертрофической зоны обмен ВКМ и локальная продукция vascular endothelial growth factor (VEGF), как полагают, создают мишени для ангиогенеза, необходимого для образования кости. Обязательно рост длинных костей зависит от продолжающейся пролиферации и созревания хондроцитов внутри эпифизных ростовых пластинок, расположенных с обоих концов этого скелетного элемента.

Cell Proliferation and Condensation


Конденсация означает уменьшение межклеточных пространств между клетками и в результате агрегации данная популяция клеток инициирует программу клеточной дифференцировки. Первоначально размер, форма, положение и количество конденсатов д.б. запрограммированы в недифференцированных мезенхимных клетках. Факторы, которые контролируют это включают членов семейств Wnt, Hedgehog, FGF, TGF-β и семейств транскрипционных факторов Нох, Рах, Forkhead и bHLH. Эти факторы экспрессируются в виде специфического пространственного и временного паттерна. Мезенхимные клетки получают специфическую комбинацию сигналов, чтобы мигрировать в соответствующую область, пролиферировать и секретировать обильно ВКМ, богатый коллагеном типа I, HA, tenascin, fibronectin.
Во время ранней ст. роста почки конечности мезенхимные клетки разделены более чем на один клеточный диаметр с помощью ВКМ, богатого НВ и коллагеном типа I. HA м.б. необходим для обеспечения миграции деления клеток. Предполагается, что постоянный синтез НА необходим для поддержания мезенхимных клеток в пролифератисном состоянии до конденсации. Has2 специфически экспрессируется пролиферирующей мезенхимой почки конечности и выключается на время конденсации (Рис. 4). Has2 экспрессия тонко регулируется во время клеточного цикла во многих типах клеток, включая фибробласты и кератиноциты, а нарушения экспрессии Has2 вызывают дефекты клеточной пролиферации, клетки накапливаются в G1. Трансфицированные кератиноциты, которые экспрессируют только слегка повышенные уровни Рыф2 пролиферируют и мигрируют быстрее. Поддержание биосинтеза НА и время выключения экспрессии Has2 м. играть критическую роль в детерминации обязательных размеров и позиции будущего скелетного элемента, это м.б. общим признаком событий конденсации во время эмбриогенеза позвоночных. Животные, дефицитные по гену Hoxb13, имеют более длинные хвосты с дополнительными хвостовыми позвонками. Hoxb13-/- животные имеют повышенные уровни НА в коже взрослых и обладают ускоренной репарацией ран без рубцов. Возможно, что Hoxb13 или др. Нох белки являются репрессорами экспрессии Has2-/-. Has2 экспрессируется на выском уровне в развивающейся каудальной мезодерме, п потеря репрессора м. расширять домен экспрессии Has2 временным или пространственным образом. Предполагается, что поддержание экспрессии Has2 необходимо для пролиферации прехондрогенной мезенхимы и что этот эффект на клеточную пролиферацию плюс время выключения Has, играют роль в детерминации окончательных размеров, формы и количества скелетных элементов, что целиком согласуется с фенотипом хвоста у Hoxb13 эмбрионов.
Когда предхрящевые мезенхимные клетки подвергаются конденсации, то они увеличивают экспрессию Sry-box containing gene 9 (Sox9) транскрипционного фактора, а также growth differentiftion favtor 5 (GDF5) и ВМР2,4 и 7. Морфологические клетки выглядят плотно упакованными, что обусловлено изменением ВКМ или молекул клеточной адгезии, включая versican, tenascin, heparan sulfate, chondroitin sulfate protroglycans, связующих белков и thrombospondin-4, а также syndecan, N-CAM, N-cadherin, межклеточных щелевых соединений, фокальных клеточных адгезивных киназ и paxillin. Некоторые из этих факторов необходимы для детерминации и/или поддержания формы конденсатов. На периферии конденсируемые клетки маркированы гликопротеином tenascin и его протеогликоновым рецептором на клеточной поверхности, syndecan. Поддержание краёв конденсата и регуляция его размеров также обеспечивается FGF, BMP2 и 4 и msh-kike homeobox protein (Msx) 1 и 2.
НА необходим для ранних межклеточных взаимодействий в мезенхиме зачатков конечностей во время хондрогенеза. Во время конденсации высокие уровни НА остаются на периферии конечности, тогда как низкий уровень НА присутствует в конденсирующейся мезенхиме (Рис. 5) Высокие концентрации НА способны блокировать агрегацию определенных типов клеток, тогда как низкие концентрации м. оказывать противоположный эффект. Эта НА-обеспечиваемая агрегация зависит от поперечного связывания эндогенных НА с НА рецепторами (возможно CD44, но CD44 дефицитные животные не обнаруживают скелетных аномалий), присутствующими на соседних клетках. В самом деле, экспрессия CD44 увеличивается в хрящевых конденсатах, возможно увеличивается оборот НА за счёт эндоцитоза и последующей лизосомной деградации с помощью hyaluronidases. Физически сводя клетки вместе, усиливаются межклеточные взаимодействия и усиливается клеточная адгезия с помощью адгезивных молекул клеточной поверхности, таких как N-cadherin, N-CAM, CD44 и syndecan-3. Поддержание экспрессии HAS в культуре хондроцитов во время обычно конденсации добивались существенного биосинтеза НА и задержки начала конденсации.
СВ44 участвует в сборке и поддержании околоклеточного матрикса суставных хондроцитов, но во время конденсации м. функционировать в первую очередь м процессе оборота НА, для снижения расстояний между клетками. Продукты распада нА также м. активировать сигнальный каскад, который влияет на расположение актиновых филамент и , следовательно, на форму клеток и распределение НА рецепторов на клеточной поверхности. Хондроциты экспрессируют moesin и ankyrin, белки, связывающие актин, которые также связываются с цитоплазматическим доменом CD44. Т.о., НА соединение с CD44 м. обеспечивать взаимодействия с цитоскелетом во время хондрогенеза и ремоделирования хряща.

Matrix Organization and Differenciation: Hypertrophy and Joint Cavitation


Инициация дифференцировки предшественников хондроцитов регулируется с помощью BMP2, 4 и 5 и и активации Msx1 и 2. Дифференцирующиеся хондроциты секретируют noggin, чтобы противодействовать BMPs, тем самым регулировать их сигналы. Они также секретируют протеогликаны и коллаген типа II в ВКМ. В предхрящевой ткани и ростовых пластинках организованный ВКМ состоит в основном из коллагена типа II и протеогликановых агрегатов, собираемых, чтобы обеспечить развивающиеся хрящи с с силой растяжения и резистентностью к компрессии. Ген α1 (II) коллагена (Col2a1) экспрессируется в прехондроцитах и пролиферирующих хондроцитах и его продукт необходим для хондрогенеза. Расположенные внутри коллагеновой сети макромолекулярные агрегаты, каждый состоящий из одиночного НА полимера, соединяются с примерно 140 полипептидами aggrecan и стабилизируются с помощью эквивалентного количества связывающих белков. Дифференцирующиеся хондроциты обнаруживают пониженную экспрессию N-cadherin, соответствующую окончанию конденсации и началу пролиферации хондроцитов.
Пролиферирующие хондроциты начинают экспрессировать Indian hedgehog (Ihh), который регулирует гипертрофию и индуцирует parathyroid hormone-related protein (PTHrP) и PTHrP-receptor (PTHrP-R), которые действуют в виде негативной петли обратной связи, регулируя экспрессию Ihh и безусловно контролируя размеры ростовых пластинок. Набухшие, округлившиеся, гипертрофические хондроциты д. секретировать коллаген типа Х (ColX) в матрикс и в конечном итоге д. подвергаться апоптозу. Перед гибелью они секретируют VEGF, сигнализирующего инвазию кровеносных сосудов в будущую кость (Рис. 6). Кровеносные сосуды транспортируют остеобласты, чтобы начать строительство кальцифицируемого матрикса.
НА играет центральную роль в организации хрящевого матрикса, т.к. он является остовом хрящевых протеогликановых агрегатов, связывающих и связующий белок и aggrecan. Эти макромолекулярные агрегаты делают возможными вискоэластичные свойства, которые контролируют осмотическое давление хрящевого матрикса. Каждая субъединица агрегата является критической для собственно образования такой матричной структуры. Удаление любого из компонентов хрящевого протеогликанового агрегата ведет к драматическим дефектам скелета. Спонтанные мутанты, дефицитные по функции aggrecan (cartilage matrix deficiency [cmd]) у мышей и nanomelia у эмбрионов кур), и мыши с целенаправленными мутациями в связующем белка 1 (cartulage linl protein 1 [Crtl1], Hapln1) характеризуются карликовыми конечностями и черепнолицевыми аномалиями и погибают вскоре после рождения из-за неспособности дышать. Такие животные обнаруживают аномалии ростовых пластинок с дизорганизованными хондроцитами. Более того, экспрессия Ihh и PTHrP-R снижена в пре-гипертрофической зоне, указывая на то, что протеогликановые агрегаты м.б. существенными для структурной организации и регуляции экспрессии генов во время развития хряща. Мыши cmd имеют хрящи с плотно упакованными хондроцитами с небольшим количеством матрикса. Хотя уровни связующего белка и типа II коллагена в хряще кажутся нормальными, ростовая пластинка имеет существенные отличия по экспрессии мРНК связующего белка, синдекана 3 и коллагенов типа II, IX,X и XI. Интересно, что гетерозиготные cmd мыши также имеют аномальный фенотип. Гетерозиготы выглядят нормально при рождении, но развивается лёгкая карликовость и с поздним началом misaligment несмотря на то, что имеется 80%+ от нормального уровня aggrecan. Хрящевой протеогликан является чрезвычайно стабильным комплексом с периодом полу-жизни в десятки лет у людей. Возможно, что легкое снижение количества молекул aggrecan у cmd гетерозигот ведет к меньшей гидратации и/или ленее стабильному матриксу хряща.
Интересно, что некоторые из Crtl-/- животных переживают перинатальный период, ростовые пластинки у них постепенно становятся всё более организованными. Это спонтанное восстановление м.б. обусловлено тем фактом, что aggrecan всё ещё присутствует, также как и НА. Вообще-то менее стабильные околоклеточный матрикс преимущественно из НА и aggrecan м.б. всё ещё достаточным для выживания хондроцитов после критической фазы по установлению ростовой пластинки. Альтернативно, изменчивость в экспрессии одного их др. связующих генов, наиболее вероятно Hapln3, м. позволить протеогликановым агрегатам сформировать у Crtl-/- дефицитный хрящ.
Ранние гипертрофические хондроциты являются факторией для биосинтеза НА. Большие количества НА синтезируются под управлением HAS2. Более того, экспрессия двух др. генов, кодирующих энзимы, которые находятся выше HAS на биосинтетическом пути, UDP-glucose pyrophosphorylase и UDP-glucose dehydrogenase, также заметно увеличена при гипертрофии. Высокая концентрация НА в околоклеточном матриксе гипертрофических хондроцитов м. играть роль в продольном росте хрящевых элементов, просто путём обеспечения давления от разбухания. Также очень вероятно, что высокая концентрация НА в гипертрофической зоне д. обязательно приводить к сходной высокой локальной концентрации продуктов распада НА, включая олигосахариды. НА низкой мол. массы м. увеличивать экспрессию многих факторов роста и цитокинов, включая VEGF. Более того, o-HAs м.действовать синергично с VEGF, чтобы активировать ангиогенез. Возможно, что продукты распада НА играют критическую роль в целенаправленной инвазии кровеносных сосудов в ростовую пластинку.

Joint Development and the Requirement of НА Synthesis


Внутри постоянно развивающегося скелетного элемента, формируются синовиальные соединения, регулируемые разнообразными факторами, такими как Wnt14, GDF5, noggin и chordin. Субнабор дифференцирующихся мезенхимных клеток внутри элемента инструктируется к формированию нехрящевой области, называемой interzone. Промежуточная зона из уплощённых клеток становится сигнальным центром и реорганизует свой матрикс в результате Wnt14 индукции и\или поддержания панели суставных маркёров, включая секретируемые phosphodiesterase/pyrophosphatase , auto-toxin, chordin, CD44 и GDF5.
N/r/ область промежуточной зоны возникает, чтобы обозначить место будущего синовиального сустава, то хондроциты, которые находятся на любой из сторон interzone подвергаются волне пролиферации, пре-гипертрофии и гипертрофии. Из этого инициального центра событий волна созревания хондроцитов распространяется в направлении концов индивидуальных скелетных элементов по мере роста центра.
Прогресс развития суставов следует с самого начала кавитации промежуточной зоны, образуя карман, богатый молекулами ВКМ, тогда как хондроциты по краям сустава начинают дифференцироваться в суставной хрящ (Рис. 7).
Процесс сегментации зачатка хряща с образованием сустава м. испытывать влияние со стороны разнообразных факторов. Эти факторы м.б. факторами клеточной гибели, ферментативной деградации, дифференциального роста оппозитных элементов, изменений в матричном синтезе и механическими влияниями или комбинацией их всех.
Подтверждается дифференциальный синтез НА под влиянием механических стимулов во время кавитации. Взаимодействие между НА и hyaladherins является существенным во время развития суставов. Наблюдения высокого уровня экспрессии НА и повышенной активности uridine diphidphoglucose dehydrogenase (UGDH, энзима, необходимого для для синтеза UPD-glucuronate из UPD-glucose) в суставах перед кавитацией указывает на важную роль локального синтеза НА в кавитации. НА в сочетании с НА рецепторами способен облегчать разделение клеток in vitro и м. обеспечивать разделение слоёв интерзоны во время кавитации. Эффект НА на поведение клеток м.б. обеспечен посредством его взаимодействия с CD44, который экспрессируется на высоком уровне на fibrofrticular поверхностях развивающегося сустава. В зависимом от движения образовании суставной полости координация локального биосинтеза НА и его взаимодействий со связывающими белками является кардинальной. Механические усилия, необходимое условие для развития нормальных суставов, если прикладываются к клеткам фиброхряща, то увеличивается активность UGDH, экспрессии HAS и связывания НА с CD44.
РФ и CD44 дифференциально экспрессируются в суставной промежуточной зоне и на развивающихся суставных поверхностях. Взаимодействие между НА и CD44 м. индуцировать как клеточную адгезию, так и разделение клеток в зависимости от концентрации НА в окружающей популяции клеток. Т.о., экспрессия CD44 в промежуточной зоне и усиление синтеза НА м. облегчать разделение ткани.
Согласуется с этим наблюдаемое образование синовиальных суставов в среднем ухе, incudomalleal и incudostapedial articulations. Их развитие происходит под влиянием Gdf5 и 6. Предполагается, что эти процессы образования суставов образуют полости после начала воздействия механических стимулов ( проведения звуковых волн) и что эта кавитация также зависит от НА.
предполагается, что НА действует в биофизическом контексте. Большие количества высоко мол. масс полианионов вызывает межклеточное разделение и обеспечивает образование заполненной жидкостью полости. Возможно, однако, что НА действует значительно более активно, передавая сигналы, напр., изменяющие цитоскелетную организацию посредством CD44 и/или др. НА рецепторов, чтобы вызывать изменения клеточной формы и облегчить подвижность клеток и дифференцировку .

Transformation: Endocardial Cushion Formation


Во время развития трансформация является нормальным и необходимым процессом и обычно обозначает изменение клеточного фенотипа от статического фенотипа эпителиальных клеток к мигрирующим мезенхимным или фибробласт-подобным клеткам, которые удаляются от своих обычных соседей. Этот процесс обозначается как epithelial-to--mesenchymal transformation (EMT). Большинство исследований было сфокусировано на сигнальных каскадах, которые активируют трансформацию, они выявили ступенчатообразные цепочки активации и участников. Недавно было показано, что простая избыточная продукция НА эпителиальными клетками м. давать в результате индукцию мезенхимных и трансформированных клеток. Повышенная продукция НА за счёт избыточной экспрессии Has2 способствует независимому от прикрепления росту и инвазивности, индукции продукции металлопропротеаз и стимуляции phosphoinositide 3-kinase (PI3-kinase)/serin-threonin kinase protein kinase В (PKB или Akt) пути в нормальных Madin-Darby canine kudney (MDCK) и в клетках эпителиальной карциномы молочных желез MCF-10A человека. Более того, было показано, что эффекты трансформации и hepatocyte growth factor (HGF) и β-catenin зависели от НА-клеточных взаимодействий.
Has2-/- эмбрионы мышей полностью лишены эндокардиальных подушек. В дополнение к впячиваниям (infolding) стенки желудочков отсутствуют трабекулы. Has2-/- сердца выглядят дилятированными, пустыми сокращающимися мешками. Аномалии образования эндокардиальных подушек приводят и к дефектам атриовентрикулярной перегородки, это является наиболее частым кардиальным дефектом у детей. Кардиальный фенотип, наблюдаемый у Has2-/- эмбрионов очень сходен с тем, что наблюдается у versican-дефицитных hdf мышей, демонстрируя тем самым критическое значение организованного НА-зависимого ВКМ в кардиальном морфогенезе. Ни версикан, ни НА в отдельности не достаточны для образования нормальных подушек. Версиикан, НА и, по-видимому, связующие белки и др. матричные белки, такие как fibulins, являются составными частями ВКМ внутри подушек. Этот матрикс продуцируется как эндокардом, так и миокардом и собирается между двумя слоями клеток, разделяя физически два слоя. В этом контексте НА действует как организатора матрикса и заполнитель пространства (Рис. 8).
Выявлена роль НА в ЕМТ событии, сопровождающегося отложением и сборкой матрикса подушек. Было показано, что in vitro эндокардиальные клетки внутри Has2-/- эксплантов неспособны мигрировать или трансформироваться. Этот фенотип м.б. нормализован несколькими путями, включая экспрессию дикого типа Has2, добавление НА высокой мол. массы в культуральную среду или в коллагеновый гель, или экспрессией активированных ras. Версикановые (hdf) экспланты были компетентными к трансформации в тех же самых условиях in vitro , это указывает на то, что процесс трансформации не зависит от событий сборки ВКМ, которые осуществляют физическое разделение эндокарда и миокарда. предполагается, что НА связывание с рецептором, напр., CD44, активирует нижестоящие пути, которые конвергируют на активации ras. Хотя CD44-дефицитные мыши не обнаруживают каких-либо сердечно-сосудистых проявлений, но наблюдается замедленная трансформация эндотелиальных клеток CD44-/- кардиальных эксплантов. Доминантно негативный ras способен блокировать трансформацию кардиальных эксплантов дикого типа. Доминантно негативный ras не способен, однако, полностью блокировать восстанавливающую активность экзогенного НА на Has2-/- экспланты. Эндокардиальные клетки внутри этих эксплантов всё ещё способны мигрировать из эксплантата, но не способны трансформироваться, когда экспрессируется доминантно негативный ras. Это указывает на то, что передача сигналов ras находится иерархически ниже НА в процессе трансформации, но не в процессе миграции, который также зависит от НА.
НА м. выступать в качестве ко-стимулирующей молекулы, действующей сочетанно с известными рецепторами-обеспечиваемыми сигнальными путями. Хорошо известно, что процесс трансформации во время развития подушек зависит от передачи сигналов факторов роста, особенно членов сверхсемейства TGF-β. В этих простых моделях TGF-β продуцируются миокардом и сигналы передаются в эндокард. Подтверждено, что члены рецепторных тирозин киназ erbB также играют роль в дополнение к mitogen-activate protein (map) kinase, Mekk3. Установлено функциональное соединение между передачей сигналов НА и активацией мути рецепторных тирозин киназ erbB. Соединение НА с CD44 также активирует ras-родственный GTP-связывающий белок, Rac1 посредстом Tiam1 (T-lymphoma invasion and metastasis 1), способствующего образованию ламеллиподий в эпителиальных клетках мышей. Все эти наблюдения указывают на то, что НА-зависмое, рецепторами-обусловленное сигнальное событие, использующее НА, CD44, потенциально и др. НА рецепторы и erbB receptors/ligands, является существенным для морфогенеза актриовентрикулярного канала. НА действует, стимулируя внутриклеточные сигнальные пути, включая ras и возможно используя Mekk3 в качестве нижестоящей мишени. Возможно, что Hyal2 или др. гиалуронидазы также м. играть роль в этом процессе, так Hyal2, напр., разрезает НА высокой мол. массы на более мощные сигнальные фракции (Рис. 8).

Disease: Tumor Biology


Хорошо известно, что взаимодействия клеток со своими НА-зависимыми околоклеточными матриксами и ВКМ в конечном итоге сбалансированы в обычных условиях. Нечто, что смещает шкалу в одном или др. направлении, достаточно для разбалансировки системы, при этом меняется широкий круг клеточных поведений таким образом, что создаются условия для прогрессирования опухолей. Напр., усиление биосинтеза НА м. приводить к клеточной трансформации или к способности определенных опухолевых клеток связываться с рецепторами на эндотелии или к росту. Усиление биосинтеза НА ассоциирует также с более пермиссивным внеклеточным или околоклеточным матриксом, который м. действовать как способствуя клеточной миграции, так и поддерживая клетки в пролиферативном состоянии и способствуя васкуляризации опухолей. Поэтому HAS экспрессируются на чрезвычайно низких уровнях в нормальных клетках и экспрессия её тонко регулируется. Как увеличение, так и снижение экспрессии hyaluronidase ассоциирует с различными аспектами туморогенеза. Потеря локальной активности гиплуронидазы м. оказывать сходное влияние, усиливая биосинтез НА, позволяя тем самым накапливаться высоким уровням НА локально вокруг клеток и внутри ВКМ. Это м. модифицировать силу и/или временную регуляцию событий передачи сигналов НА для данной клетки в этих условиях и м. модифицировать ВКМ так, что будет облегчаться миграция клеток. Напротив, увеличение экспрессии гиалуронидазы м. позволять клеткам инвазировать такие ткани с богатым, НА-зависимым ВКМ. Повышенная или несоответсвующая экспрессия рецепторов м. позволять клеткам связываться с НА-зависимым матриксом, чтобы предать НА-зависимый матрикс более быстрому рецепторами-обусловленному эндоцитозу и в ответ на НА сигналы вести к пролиферации клеток, клеточной миграции и клеточной трансформации.

CONCLUDING REMARKS: HYALURONAN AND MORPHOGENESIS


Hyaluronan has come a long way from its "goo" days, when it was viewed as a largely uninteresting and passive component of the connective tissue. The biosynthesis, uptake, and degradation of this molecule are exquisitely balanced under normal homeostasis. HA can be thought of as both the beginning and the end, an alpha and omega, of many major developmental or morphogenetic processes. First, HA can signal via as many as seven different receptors to effect changes in cellular shape, form, and function, such as EMT, as well as changes in cellular behavior, such as cell proliferation and cell migration. In these contexts, HA is acting as the initiator. Second, biosynthesis of HA can also have rapid and direct effects on tissue architecture. In these contexts, local biosynthesis of a hydrated, HA-dependent matrix may be one of the final steps in a developmental program. There is no question that local biosynthesis of a hydrated HA-dependent matrix has a profound influence on tissue volume. Tissue volume increases are required during numerous aspects of embryo-genesis, beginning as early as ovu-lation, when HA biosynthesis is required for the expansion of the cumulus-oocyte-complex (COC) immediately prior to ovulation. Later, local production of an HA-dependent matrix is required to create a hydrated and permissive environment into which many celt types migrate, including neural crest cells and transformed endocardial cushion cells. Third, HA is the central organizing nucleus of many matrices, and its numerous binding proteins may allow for unrealized flexibility in matrix architecture, structure, and function. Indeed, due to its long length, - it is possible that a single HA polymer may be able to bind to different proteins, organizing specialized micro-environments within the ECM.
The timing of this review is fitting, as the understanding of HA biology entered the molecular arena 10 years ago. For those individuals who, after reading this review, are also encouraged to enter this field or to expand the scope of their current research endeavors to include HA biology, we have provided a table of genetic database information for all those genes encoding enzymes involved in HA biosynthesis and degradation, and HA receptors or binding proteins (Table 1). In addition to simple database numbers, Integrated Molecular Analysis of Genomes and their Expression clone numbers are provided for representative human and mouse cDNA clones that are publicly available for each gene. We encourage readers to follow the continued explosion of interest in this often misunderstood, biochemically simple, yet functionally complex carbohydrate polymer. We have encountered many twists and turns in our 10 years of investigation, but have invariably been treated to something new and exciting at every level. We have been truly fortunate to witness a renaissance in our understanding of this molecule. "HA, coming soon to a journal near you— We've only just begun."



Cleavage of hyaluronan by GBS hyaluronan lyase. Hyaluronan (I), shown here as it exists after processive degradation has begun, with an unsaturated glucuronic acid residue at its non-reducing terminus, is sequentially degraded in the direction of the reducing terminus yielding the disaccharide product 2-acetamido-2-deoxy-3-)- (?-D-gluco-4-enepyranosyluronic acid)-glucose (II).

Сайт создан в системе uCoz