Большинство биологических движений обеспечивается белковыми машинами, называемыми молекулярными моторами. Некоторые моторы м. появляться в виде больших ансамблей, напр., в наших скелетных мышцах, другие оперируют как одиночные молекулы. Некоторые осуществляют линейное движение вдоль субстрата, другие ротируют вокруг своей оси (Box.1). Некоторые из линейных моторов управляют субклеточным транспортом. Все они испытывают зависимые от энергии конформационные изменения, что обеспечивает им однонаправленное движение

Boxes

Box 1 | Many protein machines undergo ordered conformational changes to execute vectorial processes. Ion pumps, translocation pores that move proteins across membranes, ribosomes, DNA helicases, nuclear pores - in a sense, they all are motors. Even though the design principles differ and certainly do not suggest a common origin of these machines, some properties may be shared by otherwise distinct devices. Therefore conventional kinesins and many DNA or RNA polymerases have in common the ability to move along their respective tracks (microtubules or DNA) for long distances without dissociating, taking hundreds or even thousands of 'steps' in the process^{38,
80,
83-85}. This characteristic feature is termed 'processivity' . In the case of polymerases, contact with the track is facilitated by protrusions that clamp around the DNA strand^{86,
87} (see the review by Hingorani and O'Donnell on page 22of this issue). A different type of movement results when the molecules that constitute the 'track' are arranged in a circular fashion and the motor rotates in the centre. Such is the case in ATP synthase, where a single γ-subunit rotates against a surrounding cylinder of three α- and three β-subunits, a process driven by a proton gradient⁸⁸. This is the smallest known 'rotary' motor. A larger but even more remarkable rotary machine is the bacterial flagellar motor, where a corkscrew-like flagellum is attached to a rotating ring-shaped assembly inserted into the membrane. This complex is powered by proton or sodium gradients, and although it is only composed of about 20 proteins, it can rotate at rates exceeding 1,000 Hz, propelling a bacterium at speeds of several hundred micrometres per second^{89,
90}.

A 'motor' of completely different design is used by certain intracellular pathogenic bacteria or viruses. They exploit the complex cellular machinery normally used for lamellipodial extension during cell migration and modify it to create an intracellular 'rocket propulsion' system⁹¹. By nucleating the assembly of a network of actin filaments and actin-associated proteins near their surface to generate a cushion of crosslinked fibres, the intruder is pushed through the cytoplasm^{92,
93}. This machinery differs from the other motors described here in that it is composed of a massive three-dimensional cytoskeletal network rather than a compact macromolecule.

Box 3 | Microtubule structure
Microtubules are built from α/ β-tubulin dimers that are stacked in linear arrays termed protofilaments, 13 of which form the wall of a microtubule in most cell types. Owing to the stereotyped stacking of subunits, these protofilaments (and therefore the microtubules) possess an intrinsic molecular polarity, with one end exposing the α-subunit, and the other the β-subunit. Although the end exposing the α-subunit, called the minus end, is usually anchored near the centrosome, the cell's microtubule-organizing centre, a microtubule can grow or shrink rapidly at the end exposing the β-subunit, called the plus end. The motor domain of kinesin possesses a microtubule-binding face that interacts with tubulin dimers (mostly the β-subunit) in the microtubule wall in always the same orientation, thereby recognizing (and exploiting) the intrinsic molecular polarity of microtubules.

Box 4 | Duty ratio and processivity
The velocity of a molecular motor is restricted by the velocity of the catalytic events that supply the energy. Many kinesins, myosins and dyneins presumably move in a stepwise manner along their respective tracks. If one step is coupled to one ATP hydrolysis event, as generally believed^{81,
82}, the stepping frequency cannot be higher than the ATPase rate.

To calculate the gliding velocity from ATPase rates, you must consider the working distance per step. For conventional kinesin it is about 8 nm, so given an ATPase rate of 20-40 ATP per second per head, we obtain a gliding velocity of 320-640 nm s^-1 for a two-headed kinesin^42-44. In the case of muscle myosin, the ATPase rate of about 20 s^-1 and a step-size of 5.5 nm gives 110 nm s^-1 - a value 80-fold too small to explain the observed velocity of movement. The answer to this paradox lies in the concept of the duty ratio. It is defined as the fraction of time that a motor remains attached to its track during one full
CROSSBRIDGE CYCLE ⁹⁵. All molecular motors are proposed to undergo a working stroke during the attached phase, and then to recover their initial conformation in a detached (or weakly bound) phase. Conventional kinesin has a high duty ratio, meaning that the attached phase is long (over half of the full cycle), allowing a single molecule to transport a microtubule for several micrometres without falling off. Skeletal muscle myosin, on the other hand, has a low duty ratio, as shown by its inability to work as a single molecule. Rather, several tens of molecules are required to generate continuous movement. This seems to be an adaptation to the arrangement in sarcomeres, where myosin filaments interdigitate with large ensembles of actin filaments, ensuring the close proximity of many potential binding sites for myosin heads.

The duty ratio is intimately linked to the ability of a motor to operate processively, that is, to undertake many steps in succession without dissociating from the track. For kinesin, a high duty ratio and high processivity are thought to be an adaptation to its function as a single-molecule motor that transports cargo over long distances along a microtubule. Processivity is believed to require two heads that move in a 'hand-over-hand' fashion where the chemo-mechanical coordination between the duty cycles of the two motor domains ensures that there is always one head bound.

Links
DATABASE LINKS
myosin | dynein | kinesin | ncd | myosin VI | myosin V | KIF1A
FURTHER INFORMATION
Kinesin home page | Structure and function of microtubules | Online animation: Kinesin stepping
ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES
Dynein and kinesin | Cytoskeleton | Intracellular transport | ATP-binding motifs

ORIGINAL RESEARCH PAPERS Tomishige, M. & Vale, R. D. Controlling kinesin by reversible disulfide cross-linking: identifying the motility-producing conformational change. J. Cell Biol. 151, 1081-1092 (2000) | PubMed | ISI |
Thorn, K. S., Ubersax, J. A. & Vale, R. D. Engineering the processive run length of the kinesin motor. J. Cell Biol. 151, 1093-1100 (2000) | PubMed | ISI |

Обычный кинезин м. транспортировать молекулярный груз на длинную дистанцию. Это происходит по ж.д. путям - микротрубочкам. Конвенциональный кинезин является димером, с двумя каталитическими моторными доменами, соединенными посредством ножки с груз-связывающим С-терминальным хвостом. Каждая моторная головка соединена с ножкой с помощью гибкой 'шейной' области, состоящей из двух частей - 'neck linker', которая взаимодействует с мотором и соседней 'neck coiled-coil'. Neck linker управляет характерным hand-over-hand 'stepping' движением двух кинезиновых головок, т.е. механизмом, который гарантирует, что обе головки не будут отсоединены от микротрубочки одновременно.
Этот механизм покоится на конформационных изменениях и имеются два теории о том, как это м. происходить - или neck linker оказывается отстегнутым ('unzippered') от мотора, или происходит частичное разматывание neck coiled-coil. Tomishige and Vale манипулировали с движениями шейной области, используя дисульфидные поперечные связи цистеиновых остатков для получения рекомбинантных кинезиновых моторов.
Используя эту систему для иммобилизации neck linker, авт. обнаружили, что кинезин перестает двигаться лишь в одном направлении. Поперечное связывание устраняет однонаправленную диффузию кинезина. Это указывает на то, что частичное движение neck linker достаточно для детерминации направления движения, но полное движение нуждается в активном processive movement. Подтверждением того, что конформационные изменения в neck linker необходимы для пошагового перемещения (processivity), служит то, что иммобилизация neck coiled-coiled области оказывает незначительный эффект на двигательную активность кинезина.
Tomishige и Vale отметили, что степень processivity - или длина шага ('run length') - снижается до 50%, если neck coiled-coil иммобилизирована. Thorn et al. исследовали этот процесс далее путем добавления положительного заряда к neck coiled-coil, чтобы создать 'ultra-processive' мутантов кинезина. Шаг (gain) в processivity уменьшался при высоких концентрациях солей или при отщеплении негативного С-конца у микротубулярного белка тубулина, указывая тем самым, что м. иметь место электростатическое взаимодействие между этой областью тубулина и neck coiled-coil. Это взаимодействие очевидно слабое, однако, оно устраняется добавлением относительно низких нагрузок на кинезин в optical-trap assay.
Итак, если neck coiled-coil соединения кинезина осуществляются вблизи поверхности микротрубочки, то neck linker участвует в конформационных изменениях, отвечающих за processive движение.

WEB SITE The kinesinhome page

Известно три класса цитоскелетных моторов: myosin, который взаимодействует с актиновыми филаментами и микротрубочковые моторы, dynein и kinesin

Кинезин является одной из многих двигательных молекул, существенных для антероградного транпорта по аксонам. Кинезин-I является тетрамером, состоящим из двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Тяжелая цепь кинезина обладает моторной активностью. Предполагается, что легкая цепь кинезина необходима для связывания груза или негативной регуляции тяжелой цепи.

У млекопитающих полипептидные компоненты кинезина-I кодируются тремя КНС генами (KIF5A,KIF5B и KIF5C) и тремя KLC генами (KLC1-3). Цепи КНС и KLC формируют только гомодимеры.
(Рис.1.)Все цитосклетные моторы обладают каталитическим моторным доменом, обозначаемым как 'головка', и характеризующимся присутствием двух сайтов связывания, один для АТФ и один для трека. Этот домен довольно мал у кинезинов (около 350 аминокислотных остатков), промежуточного размера у миозинов (около 800 аминокислот) и большого размера у динеинов (около 4000 аминокислот). Помимо моторного домена три класса моторов отличаются существенно, что указывает на их функциональные отличия.

(Рис.1.) | Overview of three molecular motor 'prototypes'.

Три мотора представлены сверхсемействами с десятками членов. Млекопитающие в своем организме содержат по крайней мере 40 кинезиновых моторов, примерно столько же миозинов и с полдесятка динеинов. Некоторые из этих моторов м. ассоциировать с полипептидами, которые помогают специфицировать функцию. Напр., животные конвенциональные кинезины ассоциируют с легими цепями, из которых некоторые изоформы ведут к дальнейшему функциональному разнообразию.

Different makes, same engine

На базе филогенетического анализа моторного домена сверхсемейство кинезинов представлено по крайней мере десятью семействами ( Рис.2). Многие моторы не м.б. отнесены к существующим группам о обозначаются как сироты 'orphans'. Все еще обнаруживаются новые члены.

(Рис.2.) | Overview of the domain organization, heavy chain molecular weight, polarity of movement and velocity of the main kinesin families.

Каталитический моторный домен обнаруживает примерно 35% идентичных последовательностей среди всех кинезинов. Он обладает
P-LOOP-TYPE ATP-BINDING SITE и рядом signature последовательностей, которыеобнаруживаются толкько в кинезинах. Некоторые из них отвечают за взаимодействие с микротрубочками, функция других неизвестна. Как видно на (Рис.2), размеры кинезиновых моторов широко варьируют даже среди членов одного и того же семейства, тогда как др. семейства имеют более законсервированные размеры.

Области вне моторного домена являются специфичными для семейства. Они часто включают один или несколько сегментов должных давать coiled-coil, что м. облегчать олигомеризацию. Разнообразие этих немоторных областей коррелирует с широким размахом биологических функций кинезиновых моторов.

Getting started

Члены семейства стандартных кинезинов, идентифицированных и очищенных первыми, служат 'gold standard'. Стандартный кинезин является гомодимером из двух тяжелых цепей, каждая из которых обладает N-терминальным моторным доменом длиной в (60–80 nm), ножкой с флексибельным и coiled-coil сегментами, и малым глобулярным хвостовым доменом, он обнаруживает структурную гомологию с миозином и малыми G-белками, которые также являются P-loop nucleotidases. Это указывает на то, что у этих трех классов белков каталитическая основа обладает сходной функцией, как машина, эксплуатирующая энергию гидролиза АТФ для управления конформационными изменениями. У кинезиновых моторов она контролируется путем взаимодействия с микротрубочками. Свободная в растворе, ATPase неактивна и молекула остается в своей АДФ-связанной форме. Цикл гидролиза м. начаться после связывания с микротрубочкой.

(Рис.3.) | Domain organization of the conventional kinesin heavy-chain dimer, showing the crystal structure of the catalytic domains and the neck.

Каталитический домен - это не более чем аллостерический энзим. Другие домены необходимы, чтобы превратить энзим в мотор. В стандартных кинезинах шейка и neck linker и возможно также шарнир (hinge) (Рис.3), переводят небольшие конформационные изменения , которые генерируются в АТФ-сязывающем сайте, в значительно большее механическое движение. Скорость и способность удерживаться на треке нарушаются, если эти домены делетированы или изменены. Шейка и neck linker, по-видимому, амплифицируют события в стержневом моторном домене, продуцируя физиологическое поведение. В этом отношении кинезин напоминает миозин, где небольшие конформационные изменения в каталитическом сайте транслируются в большие конформационные изменения механических элементов
(Box.2.)

Knowing which way to go

Одно семейство кинезинов обнаруживает удивитеьное свойство - его члены движутся в противоположном направлении по сравнению со стандартными кинезинами.

Микротрубочки являются полярными ансамблями α/β-tubulin димеров (Box 3). Стандартные кинезины и большинство других движутся по направлению плюс конца
(Рис.2.). Поэтому открытие кинезинов, движущихся к минус концу, non-claret disjunctional (ncd) мутантов у Drosophila melanogaster, было сюрпризом, т.к. все эти моторы имели моторный домен на carboxyl конце.

Используя моторный домен ncd, соединенный с ножкой стандартного кинезина оказалось возможным перенаправить ncd's физиологическую к минус концу подвижность. Противоположный эксперимент заставлял кинезин двигаться в обратную сторону. Выявлены области, которые ответственны за направление движениея к минус-концу в ncd шейке.

Итак, neck linker и шейка ответственны за определение направления движения. Хотя общим для стержня кинезинов является слабое внутренне присущее свойство очень медленного движения к плюс-концу, законсервированная спираль, предшествующая моторному стержню 'reverse' мотора способна преодолеть это свойство, заставляя молекулу двигаться к минус-концу микротрубочки. Напротив,шейка и neck linker стандартных кинезинов усиливают внутренне присущее свойство движения к плюс-концу.

Анализ трехмерных структур димерных кинезинов выявляет различия в шейной области (рис.4). У ncd, водородные мостики заставляют головки лежать близко к шеечной coiled-coil, генерируя 180° ротационную симметрию вокруг ее оси в форме, которая напоминает противоположно ориентированные 'P's. За исключением небольшого углового отклонения эта кристаллографическая структура сравнима с трехмерным изображением motor-decorated микротрубочек, полученным с помощью электронной микроскопии. Стандартный кинезин, напротив, димеризуется через шейку в точке, удаленной от стержневых моторных доменов, и две головки образуют угол примерно в 120°. Это пространственное расположение несогласуется с ЭМ картиной. Эти различия в паттерне димеризации стандартного и ncd кинезинов связаны с различиями в шейной области.
(Рис.4.) | Crystal structures of dimeric Ncd and conventional kinesin.

Моторный белок м. ограничивать Броуновские флюктуации несвязанной головки, направляя ее к соседнему новому сайту связывания на микротрубочке и позволяя ей 'находить' этот сайт с помощью диффузного механизма (молекулярный храповик). Или шейка м. активно подталкивать несвязанную головку в направлении следующего сайта связывания (конформационые изменения ригидных механических элементов). Эти модели не являются взаимоисключающими (см. online animation).

Найден и миозин, который "идет другим путем". Известно, что в скелетном мышечном миозине структурные изменения, инициированные в каталитическом стержне транслируются в перепад плеч рычага (swing of the lever arm), чье движение координируется конверторным доменом
(Box.2.). Теоретически за счет изменения силы связи в основании рычага м. сконструировать миозин, чей механизм трансдукции от активного сайта не меняется, но чья конвертерная область заставляет рычаг двигаться в противоположном направлении. 'Reverse' миозин, член семейства myosin VI, движется вдоль актиновых филамент в противоположном направлении, т.к. рычаг склоняет его на другой путь. Так как все члены класса VI миозинов обладают большой вставкой в конвертерной области, то возможно, что все они движутся в противоположном направлении.

Предполагается, что м. существовать и 'reverse' dyneins.

Staying on track

Кинезин движется водоль микротрубочки по ступенькам, которые связывают соседние тубулиновые субъединицы и должен пройти несколько ступеней от одного димера к следующему и не сорваться. Эта форма движения дублирована и связана с
DUTY RATIO (Box 4). Способность удерживаться на треке позволяет кинезину двигать микротрубочку в
GLIDING ASSAY

Подвижность конвенционального кинезина базируется на точной координации между двумя моторными доменами, где одна головка определяет следующий сайт связывания, тогда как мотор остается связанным с микротрубочкой другой головкой в каждый момент времени.

Согласно 'alternating site model', кинезин использует нуклеотид-зависимые изменения в своем сродстве к микротрубочкам, чтобы регулировать поведение двух головок ( Рис. 5). В растворе кинезиновый димер содержит один АДФ на головку. После свзывания с микрорубочкой только одна головка (скажем, head A) блокируется на микротрубочке и теряет свой ADP. Головка A сможет отсоединиться только, если она связывает и гидролизует новую молекулу АТФ . Во время этого процесса гидролиза головка А позволяет головке В найти следующий сайт связывания на микротрубочке, где она потеряет свой ADP. После прикрепления головки В , головка А заканчивает гидролиз в слабо закрепленном ADP state и отсоединяется от микротрубочки (см online animation). так, processive движение кинезина совершается в три этапа: во-первых, модуляция сродства к микротрубочке посредством гидролиза ATP , во-вторых, механизм, держащий головки в разных фазах и , наконец, "сильный удар"( 'power stroke'), связанный с циклом гидролиза. В стандартном кинезине power stroke влечет за собой конформационные изменения в шейке и neck linker области, тогда как в миозине это вызывает перепад плеч рычага в соединении с конвертерной областью
(Рис.5.) | Processive catalysis of conventional kinesin.

Stepping of other motors

Одиночная молекула миозина не является processive и, по-видимоу. чтобы прыгать вдоль своего трека контактирует с актиновой филаментой только короткий промежуток времени (Box 4).

Димерный кинезин-подобный Ncd также не processive. С другой стороны, по крайней мере один димерный миозин клесса V является processive. По аналогии с конвенциональным кинезином, myosin V м. управлять транспортом пузырьков как одиночная димерная молекула. На базе
OPTICAL TRAP ASSAY и ЭМ, myosin V, по-видимому, движется большими шажками (благодаря длинной шейной части) около 36 nm.

Неожиданным явилось наблюдение, что мотор с одной головкой м.б. processive. Мономерный мышиный кинезин KIF1A, участвующий в аксональном транспорте, м обеспечивать processive подвижность, хотя и мономер. KIF1A обнаруживает фазы движения взад-вперед с net directional bias. Контакт с поверхностью микротрубочек, по-видимому, поддерживается с помощью позитивно заряженной поверхностной петли в головке, которая взаимодействует с негативно заряженным С-концом тубулина. Это взаимодействие делает возможной однонаправленную диффузию вдоль микротрубочки во время состояния слабого соединения, м-м которого неясен. Будет ли этот мотор все еще processive , если он движется против
RETAINING FORCE

Одиночные молекулы dynein из ресничек Tetrahymena 8-nm шагами и являются processive при низких конц. АТФ, напоминая кинезин. Однако, в отличие от него мотор обнаруживает часто шаги назад, а при высоких конц. АТФ становится nonprocessive. Динеин с одной головкой из флагелл Chlamydomonas reinhardtii также processive, но он ведет себя как мотор с низкой пользой (low duty ratio), неспособен к processive движению в gliding assays, но в лазерной ловушке он ведет себя как единственный мотор, способный сделать 8-9 непрерывных шагов , даже против слабой retaining force. Механизм неизвестен, но очевидна координация двух независимых сайтов связывания микротрубочки внутри большой головки динеина. Итак, processivity м. базироваться на разных механизмах, отличных от 'hand-over-hand' координационной модели димерного кинезина.

Getting (in)activated

Легкие цепи кинезинов, которые взаимодействуют с тяжелыми цепями вблизи глобулярных carboxyl концов, по-видимому. участвуют в обеспечении функции кинезинов. Мутации легких цепей вызывают тот же фенотип, что и мутации тяжелых цепей, указывая тем самым, что обе молекулы м. кооперировать на одном и том же клеточном пути. Как легкие цепи нарушают функцию кинезинов неясно, известно. что они м. ингибировать связывание тяжелых цепей с микротрубочками, возможно зависимым от фосфорилирования способом. Они м. также участвовать в нахождении груза и в связывании груза.

Основной уровень регуляции кинезина - это кинезиновый димер, взаимодействие головки и хвоста, обеспечиваемое сворачиванием. В компактной конформации, которая превалирует при физиологической ионной силе, активность ATPase моторного домена ингибирована. Само-ингибирование не нуждается ни в ассоциации с белками ни в пост-трансляционных модификациях, но сильно зависит от присутствия подвижного перегиба в средине ножки. После связывания груза ингибирование хвоста облегчается. Способность ненагруженного кинезина связываться с и двигаться вдоль микротрубочек не теряется, но движение инициируется менее часто и заканчивается раньше. Выраженное ингибирование активности ATPase свернутого мотора обусловлено селективным ингибированием инициального продуктиного взаимодействия с микрорубочками.

На молекулярном уровне сворачивание нуждается во взаимодействии между доменом вблизи С-конца и областью вблизи моторного домена. В свернутом состоянии глобулярный хвостовой домен оказывается в тесной близи к каталитическому моторному домену. Законсервированный мотив глобулярного хвоста м. непосредственно вовлекаться в модулирование активности ATPase моторного домена, тогда как груз-связывающая область локализуется в coiled-coil рядом с глобулярным хвостовым доменом. Модель того, как связывание груза м.б. связано с активацией мотора представлена на

(Рис.6.) | Model for how cargo binding might be linked to motor activation.

Модель ингибирования хвоста позволяет объяснить поведение стандартного кинезина in vitro и in vivo и основной уровень регуляции.

Несовсем ясно, как кинезин связывает соотв. груз. Разнообразие кинезиновых хвостов уазывает натакое же разнообразие механизмов связывания грузов.

КИНЕЗИНЫ

WALKING ON TWO HEADS: THE MANY TALENTS OF KINESIN