Association of human aging
with a functional variant of klotho Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99, Issue 2, 856-861, January 22, 2002 | |
|
Мыши, дефицитные по гену Klotho обнаруживают синдром, похожий на преждевременное старение человека. Использовав два новых микросаттелитных маркера человека, фланкирующие ген, было показано, что имеются достоверные различия между частотами избранных маркеров у новорожденных и пожилых индивидов(P < 0.05). Был начат поиск функциональных вариантов klotho. Идентифицирован аллель, названный KL-VS, содержащий 6 вариантов последовательностей при полной неравновестности сцепления (linkage disequilibrium), две из которых являются результатом аминокислотных замен F352V и C370S. Гомозиготные пожилые (elderly) индивиды встречаются в недостаточном количестве в трех различных популяциях: Bohemian Czechs, Baltimore Caucasians, Baltimore African-Americans [комбинационное odds ratio (OR) = 2.59, P < 0.0023]. В экспериментах с временной трансфекцией, секретируемые уровни klotho harboring V352 снижены в 6 раз, тогда как внеклеточные уровни S370 оказываются повышенными в 2.9 раз. Двойные V352/S370 мутанты обладают промежуточным фенотипом (увеличением в 1.6 раз), редкий пример внутригенной комплементации в cis в результате полиморфизма по одному нуклеотиду у человека. Заметная консервация F352 среди гомологичных белков указывает на то, что он является функционально важным. Соответствующие замены F289V у самого ближайшего к человеческому klotho паралогу с известным субстратом, cBGL1, полностью элиминирует его способность расщеплять p-nitrophenyl-β-D-glucoside. Эти результаты указывают на то, что аллель KL-VS влияет на трафик и каталитическую активность klotho, и что изменчивость функции klotho вносит вклад в гетерогенность начала и тяжести зависимых от возраста фенотипов у человека. | Sequence variation in the KLOTHO locus. | Kaplan-Meier survival curve for Czech elderly stratified by genotype. Error bars depict standard error. | Extracellular and intracellular levels of klotho from transiently transfected HeLa cells. | Enzymatic activity of wild-type and F289V substituted human cytosolic β-glucosidase (cBGL1). | KLOTHO allele distribution in newborn and elderly individuals | KLOTHO genotypes in newborn and elderly individuals | |
Мыши, гомозиготные по сильно гипоморфному аллелю гена Klotho
(klotho mice), обнаруживают синдром, напоминающий старение человека, включая атеросклероз, остеопороз, эмфизему и бесплодие. Мыши онтогенетически нормальны вплоть до 3-4 недельного возраста. Затем они начинают обнаруживать задержку роста и постепенно становятся неактивными и погибают преждевременно в возрасте 8-9 недель.
Ген klotho кодирует предположительно типа I мембранный белок, который состоит из N-терминальной сигнальной последовательности, внеклеточного домена с двумя внутренними посторами (KL1 и KL2), одиночного трансмембранного домена и короткого внутриклеточного домена. Два внутренних повтора обнаруживают гомологию с членами семейства 1 glycosidases и обладают 20-40% идентичных последовательностей с β-glucosidases бактерий и растений, а также с lactase glycosylceramidase млекопитающих.
Анализ кДНК выявил, что ген klotho экспрессирует также секретируемую форму, лишенную KL2, трансмебранного и внутриклеточных доменов, результат альтернативного сплайсинга РНК. Т.о., klotho м. дейстовать также как гуморальный фактор. Установлено, что экспрессия мРНК klotho не обнаруживается в большинстве органов, в которых обнаруживаются тяжелые изменения у мышей klotho. Сходным образом трансгенная экспрессия klotho, ограниченая головыным мозгом и тестисами, существенно восстанавливает все микроскопические признаки, обнаруженные у мышей klotho.
Установлено, что зависимая от эндотелия вазодилятация (vasodilation) аорты и артериол замедлена у гетерозигот klotho мышей, но восстанавливается при парбиозе с мышами дикого типа. Кроме того, nitric oxide метаболиты (NO2 и NO3) в моче существенно снижены у гетерозиготных klotho мышей. Это указывает на то, что klotho белок м. защищать сердечнососудистую систему благодаря продукции эндотелием NO. In vivo доставка гена klotho м. усиливать дисфункцию сосудистого эндотелия, усиливать продукцию nitric oxide, снижать повышенное кровяное давление и предупреждать медиальную гипертрофию и периваскулярный фиброз у модельных крыс со множественными атерогенными факторами риска, включая гипертензию, диабет, тучность и гиперлипидемию.
Человеческий klotho обнаруживает 86% идентичных аминокислот с белком мыши, он кодируется геном, который занимает свяше 50 kb на хромосоме 13q12. Не известны синдромы, связанные с преджевремннм старением, в этой области. Как и у мышей ген KLOTHO у людей кодирует и связанную с мембранами и секретируемую формы; однако, у людей секретируемая форма предоминирует. Экспрессия KLOTHO мРНК обнаруживается в первую очередь в плаценте, почках, простате и тонком кишечнике.
Изучали ассоциацию двух вновь охарактеризованных микросаттелитных маркеров в популяциях человека. Marker 1 это ~11 kb 3' из последнего экзона и Marker 2 это ~ 66 kb 5' из первого экзона. Получены доказательства того, что локус KLOTHO ассоциирует с жизнеспособностью человека, определяемой как вероятная продолжительность постнатальной жизни и продолжительностью, определяемой как вероятность жизни после 75. Кроме того идентифицировали и функциональнго охарактеризовали варианты klotho, которые ассоциируют со снижением жизнеспособности в гомозиготном состоянии в трех независимых популяциях: богемских чехов,
белых из Балтиморы и американских африканцев из Балтиморы.
Разрушение гена klotho мыши вызывает синдром, напоминающий старение у человека, включая атеросклероз, остеопороз и бесплодие. Выясняли роль KLOTHO в старении человека. Идентифицирован аллель KLOTHO, названный KL-VS, определяемый по наличию 6 SNPs при полном linkage disequilibrium. Неблагоприятные последствия для гомозиготных носителей KL-VS анализировали в трех географически и/или этнически отдельных популяциях (P < 0.0023). Выявлены гетерозиготные преимущества в популяции чехов в Богемии, но не в Балтиморских популяциях(P < 0.04). Существуют многочисленные примеры преимущества гетерозигот и вредности гомозигот, включая CFTR аллель ΔF508 и hemoglobin S. Преимущества гетерозигот этих аллелей ассоциированы со специфическим средовым давлением, холерой и малярией, соотв. Следовательно, скорее всего обнаруживаемое отсутствие преимуществ у гетерозтигот в двух Baltimore группах м. отражать отсутствие средового давления, которе специфично для чехов Богемии. Неблагоприятное воздействие гомозигоьтности обычно обнаруживается независимо от средовых факторов.
Одна из теорий старения, antagonistic pleiotropy, предполагает, что индивиды с аллелями, которые способствуют выживанию в течение репродуктивного возраста будут отбиральться эволюцией, даже если эти же самые аллели оказывают негативные эффекты в более позднем возрасте. Чтобы определить, следует ли KL-VS аллель KLOTHO этой модели, определяли кривуюю выживания Kaplan-Meier для пожилых чехов и было установлено, что гетерозиготность по KL-VS участвует в удлиннении продолжительности жизни, определяемой по возможности и способности достигать возраста более 75 (P < 0.05 для индивидов =80 годам).
Хотя скрытая стратификация популяции имеет потенциал подтвердить интерпретацию ассоциированных исследований, она вряд ли является существенным фактором в исследованиях, описанных здесь. Во-первых, одно и то же неблагоприятное воздействие гомозиготновти KL-VS аллеля выявлено в трех разных популяциях [odds ratio
(OR) = 2.70, 2.40, 2.66]. Во-вторых, большие разлдичия в астотах аллелей обнаруживаются между этнически и/или географически различными популяциями для данной возрастной группы. Напр., частоты KL-VS генотипа отличаются недостоверно для детей белых из Балтиморы и чехов (P > 0.20) или для пожилых людей из тех же популяций (P > 0.93). Однако, различия в частотах аллелей между комбинированными популяциями детей белых из Балтиморы и Чехии и пожилыми из той же объединенной популяции были достоверными (P < 0.006). В-третьих, если принять в целом сходство внутри возрастных групп, то различия между возрастными группами нуждаются в настоящих массивных миграциях в течение одного поколения.
Димеризация, являющаяся наиболее общей характеристикой семейства 1 glycosidases и большинства интегральных мембранных белков, существенна для экспорта из endoplasmic reticulum (ER). В самом деле, внеклеточные уровни белка klotho с V352снижены в 6 раз. Влияет ли эта мутация на димризацию или взаимодействие klotho с др. белками, которые необходимы для экспорта klotho, такими как ER chaperones.
Неожиданно, внеклеточные уровни klotho с S370 увеличены в
2.9 раз. Эта замена вызывает появление способности комплементировать V352 фенотип в цис-положении, как это обнаруживается у V352/S370 двойных мутантов, которые обнаруживают промежуточный фенотип (1.6-кратное увеличение). При скриниге более 300 индивидов из географически и/или этнически отдельных когорт не найдено индивидов, которые обладали бы только V352 или S370. Хотя индивиды, имеющие только одну из этих мутаций м. существовать в популяции с низкой частотой, возможно также, что ни один из генотипов нежизнеспособен. Эта гипотеза требует, чтобы секреция была достаточной для функционирования klotho. В этом сценарии V352 фенотип д. соответствовать сильному гипоморфу, сходному с таковым у мышей klotho, и должен подвергаться негативной селекции. Сходным образом, если неблагоприятные эффекты гомозиготности у индивидов, содержащих KL-VS аллель, обусловлены, по крайней мере, частично увеличением внеклеточных уровней klotho, тогда индивиды, обладающие только S370 должны ощущать ддаже более высокую отрицательную селекцию. Т.к. мутации, идентифицированные в C370 дают остаток серина, который присутствует в этом же положении у мышей и крыс, то возможно, что эта замена вносит вклад в межвидовые различия связанных с возрастом фенотипов. Существуют дополнительные примеры, включая α-synuclein, в котором белок-кодирующие изменения, связаные с появлением аминокислоты, характерной для др. организмов, м. приводить к фенотипической изменчивости у людей, включая болезни.
Эволюционная консервация F352 аминокислоты среди гомологичных белков указывает на то, что она скорее всего важна для функции klotho. В самом деле, замена валинаe на фенилаланин в соотв. остатке в самом ближайшем человеческом паралоге klotho с известным субстратом, cBGL1, полностью элиминирует способность расщеплять p-nitrophenyl-β-D-glucoside. Введение серина в позицию, соответ. klotho aa 370 не способно восстанавливать энзимную активность. Эти резулдьтаты указывают на то, что KL-VS аллель м. обладать как измененной секрецией, так и потерей каталитической активности. Тогда как и KL1 и KL2 не содержат один из двух законсервированных глютаминовых остатков, обнаруживаемых в активных центрах большинства glycosidases, то м. предположить, что др. остатки, вообще N239 и S872 в klotho человека м. служить в качестве доноров протонов и nucleophile, соотв., или поддерживать альтернативные пути гидролиза. Новый мышиный белок, названный βklotho также не имеет соответствующих глютаминов и вообще относится к отдельному субнабору внутри семейства 1 glycosidase сверхсемейства. Т.о., гомозиготы по KL-VS аллелю д. обладать тяжелой недостаточностью функции внеклеточного klotho несмотря на повышенную секрецию белка. Этот сценарий рекапитулирует ситуацию у гипоморфных модельных мышей с преждевременным старением.
Множественные модели старения исходят из ускоренной или избыточной посттрансляционной модификации белков, включая glycation. Возникающие в результате advanced glycation end-products (AGEs) обнаруживают широкий круг реакций, которые, как полагают, вносят вклад во многие связанные с возрастом фенотипы, включая атерорсклероз, болезнь Алцгеймера, диабетические осложненимя и микрососудистые изменения. Возможно, что предполагаемая glycosidase активность klotho задерживает накопление AGEs. Или klotho м. вносить вклад в или регулировать сигналmyst каскады с нижестоящими мишенями, которые влияют на старение.Исходя из наблюдений klotho-дефицитных мышей, эти мишени м. включать факторы, участвующие в продукции NO и поддержании собственно функции эндотелия. Эта гипотеза нуждается в проверке на людях и модельных мышах с нормальным и ускоренным старением.