Лектины сложные мультидоменовые белки с сахара-связывающей активностью, которая обеспечивается carbohydrate-recognition domain (CRD), который у позвоночных распадается на ряд структурно отличающихся семейств белковых модулей. Некоторые их хорошо охарактеризованных групп суммированы в Табл.1.

Представленные лектины распадаются на 2 категории. Лектины, содержащие CRDs в первых трех сруктурных группах локализуются в основном внутриклеточно, luminal компартментах. Они участвуют в отборе, сортировке и доставке к цели гликопротеинов. CRDs в других структурных группах обнаруживаются в лектинах, которые функционируют в основном вне клеток и или секретируются или локализуются на плазматических мембранах. Для каждого типа CRD сахар-связывающая активность предопределяется вторичным набором остатков, которые функционируют внутри контекста структурных складок, связанных с данным типом CRD.

Lectins in the endoplasmic reticulum: calnexin and calreticulin

Калнексин и калретикулин связывают терминальные остатки глюкозы у N-сцепленных олигосахаридов и сохраняют направильно сложенные гликопротеины в эндоплазматическом ретикулеме. Калнексин является трансмембранным белком, а калретикулин - растворимым белком, удерживаемым в просвете с помощью С-терминального удерживающего сигнала. Люминальная N-терминальная часть калнексина очень сходна с калретикулином. Последовательности калнексина у C.pombe и человека идентичны на 43%.

Ключевым компонентом качественной контрольной системы является глюкозил трансфераза, которая ре-глюкозилирует неправильно сложенные гликопротеины.
Рис.

Сравнение внутриклеточного расположения и сахар-связывающей активности различных классов лектинов

L-type lectins in plants and animals

RRGIC-53 располагается в промежуточном компартменте между эндоплазматическим ретикулемом и Гольджи, а VIP-36 обнаруживается в Гольджи и и в пост-Гольджи частях секреторного пути. Оба являются трансмембранными белками типа I. Люминаьные участки этих белков соответствуют одиночному сложенному в складку домену растворимых лектинов, в обилии обнаруживаемых в проростках растений. Очевидно, что у растений и животных L-лектины выполняют разные функции. Тем не менее CRDs L-лектинов сохраняют механизм связывания сахаров. Определенные ключевые остатки в областях 4-х петель законсервированы в CRDs животных и растений. Однако эти ключевые остатки отсуствуют в дрожжевых белках, указывая тем самым на отсутствие сахар-связывающей активности и выполнение другой функции. Все это указывает на то, что складываение L-type CRD является родоначальным исходным и что сахар-связывающая активность появилась еще у общего предшественника растений и животных.

Mannose 6-phosphate receptors

Третье семейство лектинов, участвуеющее во внутриклеточной сортировке, состоит из двух типов рецепторов, распознающих остатки манноза 6-фосфата на олигосахаридах гидролаз. Катион-зависимый рецептор млекопитающих содержит одиночный Р-типа CRD, а катин-независимый рецептр содержит 15 гомологичных доменов, 2 из которых имеют манноза 6-фосфат-свЯзывающую активность. Так как сайты связывания для сахаров лигандов и дивалентношо кофактора иона металла формируются в основном из амидных и карбонильных групп, то только 5 аминокислотных боковых цепей сахар-связывающего субсайта являются общими с доменами, которые взаимодействуют в маннозо 6-фосфатом. Однако у дрозофилы, червей и дрожжей Р-типа CRD-подобные последовательности практически не содержат остатков сахар-связывающих сайтов млекопитающих и,по-видмимому, не являются рецептрами манноза 6-фосфата.

L-type lectin-like proteins

Эти лектины в основном мультидоменовые белки, у которых С-типа CRDs обнаруживают Са2+-зависимую сахар-распознающую активность, а различные другие модули затем инициируют широкий круг биологических процессов, таких как адгезия, эндоцитоз и нейтрализация патогенов. С-типа CRDs образуют подгруппу в большом семействе белковых доменов, которые имеют общее белковое складывание C-type lectin-like domains (CTLDs). Около сотни белков у человека содержат CTDLs и около половни из них функционирует как С-типа CRDs. Большинство CTLDs связывают лиганды белки, а не сахара и только некоторые из этих взаимодйствий Са2+-зависимы. Отсутсвие сходства в общей архитектуре этих белков у позвоночных и беспозвоночных указывает на различие их функций. Происходило в основном независимое расхождение CTLDs в различных ветвях животного царства. По-видимому, сахар-связыващая активность возникает независимо в каждой ветви животного мира, хотя количество необходимых для этого остатков довольно мало.

Galectins

Хотя галектины млекопитающих не имеют необходимых сигнальных последовательностей они достигают клеточной поверхности с помощью нового механизма и связываются с глюконоъюгатами плазматических мембран и внеклетчоного матрикса. Галектины состоят из глобулярного галектиновго типа CRDs с относительно небольшим добавочным доменом. CRD галектинового типа представлен β сэндвичем, сходным по общей топологии с CRDs L-типа. Однако отсутствует сходство последовательностей и имеется другой способ связывания сахаров. Это указывает на конвергентную эволюцию. Большинство галектинов имеет множественные сахар-связывающие сайты, что связано с присутствием двух CRDs гатектинового типа в одном полипептиде или обусловлено димеризацией. Общей функцией галектинов является поперечное связывание структур, содержащих N-ацетиллактозамин, на клеточной поверхности и во внеклеточном матриксе. Галектины повсеместны у многоклеточных организмов, но не обнаружены у дрожжей. 8 остатков, которые формируют галактоза-связывающий сайт у большинства галектинов млекопитающих, законсервированы и у некоторых беспозвоночных. Галектины позвоночных содержащие только 6 из 8 канонических галакто-связывающих остатков, взаимодействуют скорее с маннозой, чем галактозой. Галектины беспозвоночных существенно отличаются от таковых у позвоночных. Некоторые галектины беспозвоночных имеют N- и С-терминальные расширения. отличные от таковых у галлектинос млекопитающих. Все это указывает на независимое расхождение галектинов у позвоночных и беспозвоночных. Галектины беспозвоночных могут выполнять совсем другую функцию.

I-type lectins

Семейство siglec адгезивных рецепторов клеточной поверхности являются белками, связывающими сиаловую кислоту, которые содержат CRDs I-типа и происходят из иммуноглобулинового складывания. Эволюция их сахар-связывающей активности прослеживается на примере эволюции модулей сверсемейства иммуноглобулинов. Она параллельна эволюции лигандов, содержащих сиаловую кислоту.

Ricin-like domains

Ricin-like (R-type) CRDs являются лишь модулями белков для связывания сахаров. Галактоз-связывающая В цепь растительного токсина рицина формируется двумя гомологичными доменами, каждый состоит из 3-х долей, расположенных как βtrefoil вокруг threefold оси. Большинство бактериальных гидролаз напоминают предшественника рицина, в котором N-терминальные гидролитические домены присоединены к С-иерминальному R-типа CRDs. У млекопитающих UDP-N-ацетилгалактозамин: полипептид N-ацетилгалактозаминтрансферазы, которая инициирует синтез О-сцепленных олигосахаридов в цис Гольджи, имеет сходную организацию. Белки семейства рецепторов маннозы макрофагов содержат R-типа CRDs, которые скомбинированы с различными белковыми модулями. В маннозных рецепторах этот домен взаимодействует с сульфатированным остатком N-ацетилгалактозамина на гликопротеиновых гормонах, удаляя их из кровообращения. 3 доли R-типа CRD указывают на ранние дупликации. Иногда они взаимодействуют с гликанами через законсервированные остатки, расположенные по наружному краю этих долей. Отличный набор остатков в 3-ей доле взаимодействует с 4-сульфо-N-ацетилгалактозамином.

Гликозилирование белков (общие точки соединения между сердцевиной белка и гликановой цепью, рис. 2) не такое редкое событие. Фактически 64.9% SWISS-PROT белковых последовательностей содержит N-glycosilylation sequon и более 1% транслируемого генома предназначено для генерации кодированных слов, что отражено в CarbBank базе данных гликановых структур в виде более 1000 уникальных N-сцепленных цепей. Неудивительно, что что по крайней мере 13 различных β1,3(4)-галактозилтрансфераз ответственны за добавление D-Gal к растущим цепям сахаров. Эти терминальные добавления экипируют клетки млекопитающих характерным набором эпитопов, подобно сигнатурам, делая их отличными одна от другой.

Гликановые цепи связываются не только c N-, а также с mucin-типа О-сайтами белков, кроме того они присутствуют на клеточной поверхности как гликолипиды и протеогликаны. Пентасахаридные последовательности ганглиозида GM₁, показанные на рис. 3 объясняют образование браншей (напр., α2,3-сиалирование внутренней половины D-галактозы). Известно, что это точка заключения холерного токсина что подтверждает роль гликанов в биораспознавании. Другим примером структуры сахарида как лиганда является антикаогулянтный пентасахарид гепарина (рис. 4). 3-О-сульфатирование центрального D-глюкозаминового (GlcN) остатка существенно для его функционирования. Введение одной сульфатной группы в любое из 10 свободных мест трисахарида увеличивает размер пула в 10 раз. Так как имеется 44 теориетически возможных пути введения 2-х сульфатных групп в трисахарид, то теоретическое число потенциальных изомеров существенно возрастает. Выявлено и клонировано много сульфотрансфераз ( имеются данные по 23 ферментам), которые м. отвечать за разные паттерны замен в цепях протеогликанов. Присутствие эфиров сульфатов в гликопротеинах и гликолипидах рассматривается как маркер, выявляющий когда замены превращают относительно общераспространенный предшественник гликана в уникальный лиганд для лектина, напр., GlcNAc-6-O-сульфат при воспалении. GlcNAc-6-O-сульфат участвует в вовлечении гликопротеиновых гормонов и глюкуроновая кислота-3-О-сульфата ( HNK-1 эпитоп) в клеточную адгезию. Все больше накапливается доказательств, что гликозилирование часть системы генерации сигналов. Какие же молекулы отвечают за обнаружение и процессинг этих сигналов.

Рис.

Schematic illustration of the relative (strategic) positioning of carbohydrate recognition domains (CRDs) in several types of lectin families (see Table 2 for classification): chimeric, proto-type and tandem-repeattype galectins, C-type lectins in serum and surfactant with collagenous stalks forming triple helices, as transmembrane protein with a-helical coiled-coil stalks, with a tandem-repeat display of CRDs (and two further modules, i.e. a fibronectin type II repeat and a N-terminal cysteine-rich domain with GalNAc-4-SO4 specificity) and with a single CRD in modular arrangement with an epidermalgrowth- factor-like domain and two (L-selectin), six (E-selectin) or nine (P-selectin) complement- binding consensus repeats as well as I-type lectins such as the members of the sialoadhesin subgroup, also referred to as siglecs, which use a distinct type of V-set immunoglobulin- like domain as CRD and 1-16 C2-set domains as spacers to modulate potential for either trans- or cis-interactions on the cell surface.

Лектины животных: классификация и функция

Гликановые детерминанты способны обеспечить места связывания лектинов. Лектины могут происходить из внешнего источника, растений и бепозвоночных, но более важно, что они продуцируются большинством, если не всеми, типами эукариотических клеток.

Лектины в настоящее время классифицируются (табл.1) с помощью характеристин, не связанных с их способностью связывать моносахариды. Выделено 5 семейств лектинов у животных на базе их структуры. Типичный паттерном складывания для класса животных лектинов, напр., jelly roll-подобное расположение β-сендвича у галлектинов показано на рис.5. Рисунок позволяет определить как сахариды соединяются с сайтом связывания лектина. Направленность водородных мостиков, а также энтропически благоприятное складываение (stacking) между неполярной B-face частью D-галактозы и инвариантным Trp (Tyr,Phe) остатками обеспечивают специфичность и сродство в выборе лиганда (рис.6). Рисунок подчеркивает amphiphilic природу сахарных лигандов. Помимо экранирования B-face и системы араматического кольца пространственная близость между облаком π-электронов и алифатическими С-Н группами с их наследуемой сетью позитивных зарядов является обязательным условием для enthalpy-gaining C-H/π взаимодействия.

На клеточной поверхности связанные поперчнми связями комплексы между, по крайней мере. бивалентными лектинами и лигандами образуются с помощью цис-взаимодействий. Лектин-зависимая агрегация может активировать различные сигнальные пути. Очевидно инициированный лектинами перенос информации может запускать различные клеточные реакции, перекидывая мостик над разрывом между инициальным распознаванием и изменением клеточных параметров. Сайт-специфические ингибиторы разных частей сигнального каскада являются пригодным механизмом для прослеживания пути от связывания лектина до функционального ответа. Лист задокументированных функций животных лектинов дан в табл.2. Table 2. Functions of animal lectins

Activity	Example of Lectin
ligand-selective molecular chaperonesligand-selective molecular chaperones in endoplasmic reticulum	calnexin, calreticulin
intracellular routing of glycoproteins	ERGIC-53, VIP-36,P-typelectins, and vesicles comitin
intracellular transport and extracellular assembly	non-integrin 67 kDa elastin/laminin-binding protein
cell type-specific endocytosis	hepatic asialoglycoprotein receptor, macrophage C-type lectins, hepatic endothelial cell receptor for GalNAc-4-SO4-bearing glycoproteins
recognition of foreign glycans (b1,3-glucans, LPS)	CR3(CD11b/CD18), Limulus coagulation factors C and G
recognition of foreign or collectins, aberrant glycosignatures on cells(incl. endocytosis or initiation of opsonization or complement activation)	C-type macrophage receptors,pentraxins (CRP, limulin), L-ficolin,tachylectins
targeting of enzymatic activity in multimodular proteins	acrosin, Limulus coagulation factor C
bridging of molecules	homodimeric and tandem-repeat galectins, cytokines (e.g. IL-2:IL-2R and CD3 of TCR), cerebellar soluble lectin
effector release (H2O2, cytokines etc.)	galectins, selectins, CD23
cell growth control and apoptosis	galectins, C-type lectins, amphoterin-like protein, cerebellar soluble lectin
cell routing	selectins, I-type lectins, galectins
cell-cell interactions	selectins and other C-type lectins, galectins, I-type lectins
cell-matrix interactions	galectins, heparin- and hyaluronic acid-binding lectins
matrix network assembly	proteoglycan core proteins (C-type CRD), galectins, non-integrin 67 kDa elastin/laminin-binding protein

Reverse lectin cyto and histochemistry

Природными лигандами для лектинов являются гибридные молекулы, состоящие из углеводного лиганда и носителя, представленного биоактивной единицей (глюкоконюгатом). Любой фермент может служть объектом гликозилирования и давать гликозилированное производное (neoglycoenzyme). Их используют для количественной оценки углеводы-связывающих сайтов на клеточной поверхности. Эти исследования выявили также сайты связываания, которые обеспечивают клеточную адгезию с матриксом, представленным соответствюущими углеводами. С помощью флюоресцентной микроскопии было установлено специфическое связывание углеводов со сперматозоидами, тем самым подтверждено, что распознавание гликанов играет важную роль в оплодотворении млекопитающих. Глико-биологическое взаимодействие между рецепторами спермиев и гликанами зоны pellucida предоставляет структурные доказательства этой гипотезы. Используя меченные неогликопротеины, выявлена молекулярная пророда рецепторных сайтов в клеточной линии нейробластомы человека, где члены семейства галектинов являются партнерами по связыванию. Адгезия клеток с ганглиозидом в этой системе, которая также обеспечивает взаимодействие β-N-ацетиллактозамин-содержащего гликолипида и галектина-1 в фасцикуляциях обонятельного аксона, иллюстрирует роль галектина-1 в формировании контактов между клетками. Кроме того галектин, 71-кДа белок, является GM₁ рецептором в клетках нейробластомы мыши. Гликаны ганглиозидов, отличных от GM₁ , также имеют свойства лиганда, напр., G,sub>T1b, который связывается с мембранами олигодендроглии в головном мозге крыс. Доступен для исследования также комплекс углеводов антенн, N-гликанов. Визуализация сайтов рецепторов для сульфатированного fucan fucoidan, который связывает селектины и гепарин-связывающие лектины воспалительных клеток показана на рис. 12. Наблюдения структурных различий гликанов с неслучайным распределением замен (рис. 4 , структурная основа антикоагулирующей активности гепарина) и экспреиментальные доказательства сиквенс-специфического связывания углеводных лигандов ведет к подтверждению существования сахарного кода (sugar code).

From Glycohistochemistry to the Biochemisry of Lectins

В 4-хглавой мышце человека гомодимер галектин-1 отвечает за связывание β-галактозидов (рис. 13). Для выяснения сложности этих рецепторов необходима очистка и субфракцинация лектинов.

Endogenous Lectins in Histochemistry

Галектин-1 и доступные для связывания сайты м.б. идентифицированы на рутиннных фиксированных срезах (рис.15). Таким образом было показано его участие в росте и/или наведении первичных сенсорных обонятельных аксонов иежду носовой полостью и обонятельной луковицей. Лиганды для этого лектина в разных типах клеток включают гликаны ламинина, тканевого фибронектина? α1β1 и α7 β1 интегринов, тромбоспондина, лизосом-ассоциированых мембранного гликопротеина-1 и -2, CD2, CD3, CD4, CD7, CD43, CD45, муцинов ЖКТ и анионных или нейтральных гликолипидов.

На рис.16 показны субъединичный состав N-терминальных последовательностей, связывающего сродства к гепарану и локализация гепарин-связывающего лектина в плаценте человека.

Белок, связывающий сиаловую кислоту, отличный от С-типа лектинов, таких как селектины и подсемества сиалоадхезинов лектинов I-типа, кальцициклин (calcyciclin), член семейства S100-белков (S100A6). Fetuin-зависимое связывание его на срезах (рис. 17). Интересно, что связывание с высоким сродством тканевых компонентов управляется не углеводным эпитопом, а пептидными мотивами аннексинов II, VI, XI и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы. Эти взаимодействия вовлекают кальцициклин в Са2+-сигнальные пути в ходе секреции инсулина других продуктов клетками разного типа. Контакт и слияние мембранн секреторных пузырьков с плазматическими мембанами во время экзоцитоза происходят с участием аннексинов. Кальцициклин является также потенциальным маркером пре-неопластических повреждений или опухолевого роста. Кроме того это углеводы- и пептиды-связывающий белок передает инструктивную информацию по обработке лигандов высокого сродства.

Biomimetic Chemistry: a New Tool for Tailoring Glycohistochemical Markers

Хорошо изученным примером молекулярной мимикрии является α-амилазы ингибитор. Он устанавливает субстрат-миметические взаимодействия с сахар связывающими субсайтами энзимов. Кроме тго пепиды как гликомиметики индуцируют продукцию антител против углеводных структур, демонстрируя свою способность эмулировать топологию сахаров до известной степени. Однако пептид-углеводная мимикрия необязательно затрагивает идентичные связывающие сайты, как показывают кристаллографические исследования конканавалина А ( первого лектина обнаружившего связь с углвеводным лигандом) и сахар-мимикрирующего пептида. Как показано на рис.18 для позиционирования трех точек ключевых контактов с лектином на сахарном лиганде различные пространственные презентации м.б. достигнуты с помощью и неуглеводных субстанций (гликомиметиков), что позволит им оккупировать те же самые сайты. М.б. синтезирован широкий круг молекул с оптимальным связывающим сродством и варьирующей избирательностью к мишеням.

Reasons for Introducing Endogenous Lectins to Glycohistochemistry

Классификация лектинов, основанная на специфичности к моносахаридам, должна показать неидентичность гликан-связывающих свойств. Анализ 12 лектинов показал, что лектины, идентичные в терминах специфичности к моносахаридам, обладают способностью распознавать тонкие отличия в более сложных структурах. Говоря о N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc)-распознающих лектинах, было показано. что реактивность к вариантам аномерных и сцепляющих точек, к внутренним GALNAc остаткам и Frossman или histo-blood group A эпитопам отличается существенно между лектинами из различных растений и видов улиток. Появление "complex binding mode" указывает на то, что лектины с идентичной специфичностью к моносахаридам могут обладать различной более "тонкой" специфичностью в отношении олигосахаридных эпитопов. Имея ввиду многочисленность N- и О-гликановых структур (кодовых слов) неудивительно найти заметную склонность в отношении некоторых эпитопов, таких как сульфатированные гликаны, на уровне рецепторов. Даже среди очень близких лектинов, таких как манноза-специфичных фитогемагглютининов Diocleinae subtribe связывающие свойства неидентичны. Отклонения в аминоксислотных последовактльнстях, удаленных от сайта связывания м. модулировать параметры термодинамического связывания.

В случае галактоза-связывающих лектинов растений и позвоночных анализ топологии сайта связывания с помощью панели deoxy сахаров были выявлены различные способы связывания водорода одного и того же лиганда. Эти различия распространяются и на олигосахариды. Кроме того выявляются неуниформные изменения диссоциационных константО-метил или узш-производных даже среди гомологичных лектинов. Все это подтвеждает гипотезу, что перекрывания или различия в связывании лиганда являются результатом определенной пространственной ориентации центральных (pivotal) аминокислотных боковых-цепей в сайте связывания.

Благодаря различиям в специфичности галектины м.б. использованы для диагностики опухолей и в клеточной биологии. Недавние исследования показали, что информационный код олигосахаридов распространяется на третье измерение, форму. Для полной структурной характеристики олигосахарида нужно знать не только последовательности, но и конформацию. Олигосахариды могут существовать в разных формах от полностью ригидных до очень изменчивых.

Conformer Dynamics and Selection: the Third Dimension of Lectin-Sugar Recognition

Разные полисахариды способны существовать в одном или нескольких различных конформациях в растворе. Установлено, что конформы могут часто взаимно конвертировать на временной шкале спектроскопического мониторинга. Значит индивидуальные молекулы осциллируют в в растворе между разными конформациями. Углеводы проходят в растворе ряд низко-энергетических конформаций, каждая из которых м.б. отобрана с помощью рецепторов. Изменение в конформационном равновесии, напр., на клеточной поверхности, м. следовательно динамически сдвигать чувствительность в отношении лектинов. Итак, свойства лиганда могут меняться без изменения его последовательностей. Следовательно, два лектина со сходной специфичностью могут отбирать различные конформы.

Гликановая половина глюкоконъюганта может, следовательно, принять биоактивную или биоинертную форму в зависимости от лектина, ее воспринимающего. В лектинологии принцип выбора одной из конформы лиганда в процессе связывания в растворе получил множество подтверждений.

R.B. Dodd, K.Drickamer

Lectin-like proteins in model organisms: implications for evolution of carbohydrate-binding activity