Myosin IXb
Akira Inoue, Junya Saito, Reiko Ikebe and Mitsuo Ikebe Myosin IXb is a single-headed minus-end-directed processive motor nature cell biology Published online: 18 March 2002, DOI:10.1038/ncb774 april 2002 volume 4 issue 4 pp 302 - 306
В противополоджность conventional миозинам, которые связывают актин только на короткое время во время возобновления образования (cycling) поперечных связей, класс V myosin движется вдоль актиновых филамент на большие расстояния не отсоединяясь. Это важно для перемещения груза в клетках. Миозин V имеет двух-головчатую структуру с большим шейным доменом, предполагается, что он 'шагает' вдоль 36-nm спиральных повторов актиновых филамент так, что одна головка всегад прикреплена к актину и позволяет другой перешагнуть на соседний спиральный повтор. Установлено, что myosin IXb, миозин с одной головкой, также способен перемещаться вдоль актиновых филамент. Установлено, что миозин IXb является к минус-концу направляющим мотором. В добавление к классу VI myosin, это первый член сверхсемейства, который перемещается в обратном направлении. Перемещение myosin IXb не м.б. объяснено с помощью 'hand-over-hand' механизма. (Рис.1.) \| Structure of myosin IXb. (Рис.2.) \| Processive movement of myosin IXb. (Рис.3.) \| Actin filament movement with a very low surface density of myosin IXb. (Рис.4.) \| Direction of myosin IXb movement.	Класс IX миозинов экспрессируется во многих тканях и типах клеток. Myosin IX имеет N-терминальное расширение, которое сходно с Ras связывающим доменом Raf киназы и Ral guanine nucleotide exchange factor (GEF). В моторном домене myosin IX содержит большую вставку в 'loop 2' положении, которая м. участвовать во взаимодействии с актином (Рис. 1a). За моторным доменом имеется несколько 'IQ' calmodulin/light chain-связывающих мотивов. В отличие от двух-головчатых миозинов нет суперскрученного домена в миозине IX для обеспечения димеризации тяжелой цепи миозина и , следовательно, миозин IX является одно-головчатым мотором. Хвостовой домен содержит цинк связывающую область и небольшой G-protein GTPase activating protein (GAP) homology домен (Рис. 1a), как полагают, myosin IX функционирует в увязывании событий передачи сигналов с динамикой актинового цитоскелета. Известно, что конвенциональные миозины соединяются с актином только на короткое время во время циклинга поперечных связей. Тогда как члены моторов, базирующихся на микротрубочках, движутся вдоль треков на большие расстояния, не отсоединяясь и являются, следовательно, processive. Открывается возможность, что система микротрбочковых моторов приспособлена для перемещения грузов. Было установлено, что базирующийся на актине myosin V также являюется 'processive myosin'. Установлено, что myosin V, двух-головчатый миозин с длинным lever-arm, шагает шажками в 36-nm спиральным повтороам актиновых филамент, перемещяясь , т.о., processively по актиновой филаменте на большое расстояние. Согласно этой модели, двух-головчатая структура является критической для поступальеного (processive) движения. Может ли myosin IXb, одно-головчатый миозин, двигаться поступательно вдоль актиновых филамент. along actin filaments. Создана конструкция из myosin IXb мутанта (M9BIQ4) и hexahistidine метки, содержащая моторный домен и весь шейный домен с 4 IQ мотивами (Рис. 1a). M9BIQ4 был ко-экспрессирован с calmodulin в Sf9 клетках, т.к. calmodulin был идентифицирован как легкая цепь миозина IXb. Очищенный M9BIQ4 продукт представлен дисками высокой и низкой молекулярной массы. Диск высокой молекулярной массы, с относительной молекулярной массой (M_r) в 150,000 (150K), распознается с помощью иммуноблотинга с anti-His антителами, указывая тем самым, что он является тяжеой цепью M9BIQ4 (Рис. 1b). Доск с низкой мол. массой идентифицируется с помощью иммуноблотинга с anti-calmodulin антителами, указывая, что calmodulin это легкая цепь (Рис. 1b). На Рис. 1c показан нативный гель-электрофорез очищенного M9BIQ4 мутанта м миозина IXb полной длины. Подвижность M9BIQ4 была одинакова с таковой myosin II S1 (одно-головчатая форма), но значително выше, чем у миозина II HMM (двух-головчатая форма). Подвижность миозина IXbполной длины также соответствует структурам с одной головкой. Это указывает на то, что миозин IXb имеет одну головку. Анализ коседиментации актина показывает, что M9BIQ4 связывается с актином в присутствии magnesium-ATP (Рис. 1d). Почти весь M9BIQ4 белок ко-преципитируется с актином в присутствии magnesium-ATP, даже при очень низких концентрациях актина. Однако, M9BIQ4 не преципитируется в отсутствие актина (Рис. 1d). Следовательно, M9BIQ4 мутант обладает сильным сродством к актину во время ATPase цикла. Это очень похоже на миозин V, processive мотор, и указывает на то, что myosin IXb также является поступательным мотором. Далее изучали зависимость скорости движения актиновых филамент на ряде M9BIQ4 молекул. Было показано, что поступательный мотор поддерживает постоянной скорость скольжения актина независимо от плотнсти моторов на поверхности, тогда как скорость nonprocessive моторов снижается с уменьшением плотности моторных молекул на поверхности. Изучали движение актина на широком круге плотностей M9BIQ4 на поверхности (Рис. 2a)в отсутствие свободного кальция. При высокой плотности на поверхности (2 $times$ 10³ молекул μm^-2), M9BIQ4 поддерживает непрерывное движение актиновых филамент со скоростью 0.08 0.03 μm sec^-1. Скорость не менялась в зависимости от плотности M9BIQ4 на поверхности. Когда же посерхностная плотность M9BIQ4 снижалась, то актиновые филаменты перемещались без какого-либо снижения скорости. M9BIQ4 поддерживает движение при поверхностной плотности в 4 молекулы μm^-2, что сходно с миозином V (Рис. 2a). При низких поверхностных плотностях M9BIQ4, актин перемещается на ограниченное расстояние, возможно, из-за присутствия одиночных M9BIQ4 молекул в области, в которой перемещается актиновая филамента (Рис. 2b). Duty ratio для M9BIQ4 было определено равным 1, что подтверждает поступательность движений M9BIQ4. Затем измеряли скорость посадки атиновых филамент в зависимости от плотности M9BIQ4. Если только одной молекулы миозина достаточно для поддержания постоянного движения, то скорость посадки обнаруживает pseudo first order зависимость от плотности миозина. Для nonprocessive моторов, получается зависимость более высокого порядка. Наклон прямой линии, отражаюшщий порядок процесса посадки, для M9BIQ4 он был равным 1 (Рис. 2c). Это четко указываетна то, что myosin IXb является поступательным (processive) мотором. При очень низкой поверхностной плотности M9BIQ4, актиновые филаменты были прикреплены к поверхности с помощью одной контактной точки (Рис. 3). Во время движения, актиновая филамента остается соединенной в in-focus одиночной точки контакта, тогда как концы актиновых филамент вне плоскости фокуса, указывая тем самым, что актиновая филамента взаимодействует только с одной молекулой, которая присутствует в фокусе контактной точки. Как показано на Рис. 3, актиновая филамента прикреплена к поверхности в одной точке, обладающей узлом вращения и двигающей всю ее длину через единственную точку контакта, и отсоединяющейся, когда конец филаменты проходит через точку контакта. Направленность движения моторного белка очень важна. В сверхсемействе миозинов, помимо всего прочего класс VI миозинов отличается тем, что движется в направлении минус-концов актиновых филамент. Предполагается, что это связано с уникальной большой инсерцией между моторным доменом и шейным доменом, которая д. менять направление движения lever-arm миозина, транслоцируя актин в обратную сторону. Установлено, что стержневой моторный домен отвечает за направленность движения миозина. Изучали направленность движения M9BIQ4 с использованием двойной флюоресцентной метки актиновых филамент (Рис. 4.) M9BIQ4 движет дважды меченный F-actin, от минус конца возвратным движением, т.е миозин IXb движется в направлении минус конца актиновых филамент. Это подтвержает идею, что не уникальная инсерция в миозине VI отвечает за возвратное движение. Все полученные резулдьтаты указывают на то, чтоt myosin IXb движется поступательно (processively). Показано, что миозин V с двумя головками и большой шейной областью движется поступательно вдоль актиновых филамент большими шажками. ЭМ показано, что миозин V м. шагать длинными стежками в 36-nm спиральных посторов актиновых филамент. Две оловки миозина V на актиновой филаменте воспринимают полярную конформацию, при которой одна головка искривлена, а др. прямая. Предполагается, что поступательные большие шажки миозина V осуществляются за счет наклона длинного шейного домена одной головки, которая ведет головку партнера к соседнкму спиральному повтору актиновой филаменты. Однако, для миозина IXb этот механизм непригоден, т.к. он имеет только одну головку. Для базирующегося на микротрубочках мотора, KIF1A, мотор семейства кинезинов с одной головкой, поступательное движение вдоль микротрубочки осуществляется на базе электростатических взаимодействий между богатой Lys петли KIF1A и богатым Glu С-терминальным концом тубулина (E-hook), предупреждая диффузию KIF1A с микротрубочек. Возможно, что сходный механизм оперирует и при поступательном движении миозина IXb по актиновым филаментам.

Класс IX миозинов экспрессируется во многих тканях и типах клеток. Myosin IX имеет N-терминальное расширение, которое сходно с Ras связывающим доменом Raf киназы и Ral guanine nucleotide exchange factor (GEF). В моторном домене myosin IX содержит большую вставку в 'loop 2' положении, которая м. участвовать во взаимодействии с актином (Рис. 1a). За моторным доменом имеется несколько 'IQ' calmodulin/light chain-связывающих мотивов. В отличие от двух-головчатых миозинов нет суперскрученного домена в миозине IX для обеспечения димеризации тяжелой цепи миозина и , следовательно, миозин IX является одно-головчатым мотором. Хвостовой домен содержит цинк связывающую область и небольшой G-protein GTPase activating protein (GAP) homology домен (Рис. 1a), как полагают, myosin IX функционирует в увязывании событий передачи сигналов с динамикой актинового цитоскелета.

Известно, что конвенциональные миозины соединяются с актином только на короткое время во время циклинга поперечных связей. Тогда как члены моторов, базирующихся на микротрубочках, движутся вдоль треков на большие расстояния, не отсоединяясь и являются, следовательно, processive. Открывается возможность, что система микротрбочковых моторов приспособлена для перемещения грузов. Было установлено, что базирующийся на актине myosin V также являюется 'processive myosin'. Установлено, что myosin V, двух-головчатый миозин с длинным lever-arm, шагает шажками в 36-nm спиральным повтороам актиновых филамент, перемещяясь , т.о., processively по актиновой филаменте на большое расстояние. Согласно этой модели, двух-головчатая структура является критической для поступальеного (processive) движения.

Может ли myosin IXb, одно-головчатый миозин, двигаться поступательно вдоль актиновых филамент. along actin filaments. Создана конструкция из myosin IXb мутанта (M9BIQ4) и hexahistidine метки, содержащая моторный домен и весь шейный домен с 4 IQ мотивами (Рис. 1a). M9BIQ4 был ко-экспрессирован с calmodulin в Sf9 клетках, т.к. calmodulin был идентифицирован как легкая цепь миозина IXb. Очищенный M9BIQ4 продукт представлен дисками высокой и низкой молекулярной массы. Диск высокой молекулярной массы, с относительной молекулярной массой (M_r) в 150,000 (150K), распознается с помощью иммуноблотинга с anti-His антителами, указывая тем самым, что он является тяжеой цепью M9BIQ4 (Рис. 1b). Доск с низкой мол. массой идентифицируется с помощью иммуноблотинга с anti-calmodulin антителами, указывая, что calmodulin это легкая цепь (Рис. 1b). На Рис. 1c показан нативный гель-электрофорез очищенного M9BIQ4 мутанта м миозина IXb полной длины. Подвижность M9BIQ4 была одинакова с таковой myosin II S1 (одно-головчатая форма), но значително выше, чем у миозина II HMM (двух-головчатая форма). Подвижность миозина IXbполной длины также соответствует структурам с одной головкой. Это указывает на то, что миозин IXb имеет одну головку.

Анализ коседиментации актина показывает, что M9BIQ4 связывается с актином в присутствии magnesium-ATP (Рис. 1d). Почти весь M9BIQ4 белок ко-преципитируется с актином в присутствии magnesium-ATP, даже при очень низких концентрациях актина. Однако, M9BIQ4 не преципитируется в отсутствие актина (Рис. 1d). Следовательно, M9BIQ4 мутант обладает сильным сродством к актину во время ATPase цикла. Это очень похоже на миозин V, processive мотор, и указывает на то, что myosin IXb также является поступательным мотором. Далее изучали зависимость скорости движения актиновых филамент на ряде M9BIQ4 молекул. Было показано, что поступательный мотор поддерживает постоянной скорость скольжения актина независимо от плотнсти моторов на поверхности, тогда как скорость nonprocessive моторов снижается с уменьшением плотности моторных молекул на поверхности.

Изучали движение актина на широком круге плотностей M9BIQ4 на поверхности (Рис. 2a)в отсутствие свободного кальция. При высокой плотности на поверхности (2 $times$ 10³ молекул μm^-2), M9BIQ4 поддерживает непрерывное движение актиновых филамент со скоростью 0.08

0.03 μm sec^-1. Скорость не менялась в зависимости от плотности M9BIQ4 на поверхности. Когда же посерхностная плотность M9BIQ4 снижалась, то актиновые филаменты перемещались без какого-либо снижения скорости. M9BIQ4 поддерживает движение при поверхностной плотности в 4 молекулы μm^-2, что сходно с миозином V (Рис. 2a). При низких поверхностных плотностях M9BIQ4, актин перемещается на ограниченное расстояние, возможно, из-за присутствия одиночных M9BIQ4 молекул в области, в которой перемещается актиновая филамента (Рис. 2b). Duty ratio для M9BIQ4 было определено равным 1, что подтверждает поступательность движений M9BIQ4.

Затем измеряли скорость посадки атиновых филамент в зависимости от плотности M9BIQ4. Если только одной молекулы миозина достаточно для поддержания постоянного движения, то скорость посадки обнаруживает pseudo first order зависимость от плотности миозина. Для nonprocessive моторов, получается зависимость более высокого порядка. Наклон прямой линии, отражаюшщий порядок процесса посадки, для M9BIQ4 он был равным 1 (Рис. 2c). Это четко указываетна то, что myosin IXb является поступательным (processive) мотором. При очень низкой поверхностной плотности M9BIQ4, актиновые филаменты были прикреплены к поверхности с помощью одной контактной точки (Рис. 3). Во время движения, актиновая филамента остается соединенной в in-focus одиночной точки контакта, тогда как концы актиновых филамент вне плоскости фокуса, указывая тем самым, что актиновая филамента взаимодействует только с одной молекулой, которая присутствует в фокусе контактной точки. Как показано на Рис. 3, актиновая филамента прикреплена к поверхности в одной точке, обладающей узлом вращения и двигающей всю ее длину через единственную точку контакта, и отсоединяющейся, когда конец филаменты проходит через точку контакта.

Направленность движения моторного белка очень важна. В сверхсемействе миозинов, помимо всего прочего класс VI миозинов отличается тем, что движется в направлении минус-концов актиновых филамент. Предполагается, что это связано с уникальной большой инсерцией между моторным доменом и шейным доменом, которая д. менять направление движения lever-arm миозина, транслоцируя актин в обратную сторону. Установлено, что стержневой моторный домен отвечает за направленность движения миозина. Изучали направленность движения M9BIQ4 с использованием двойной флюоресцентной метки актиновых филамент (Рис. 4.) M9BIQ4 движет дважды меченный F-actin, от минус конца возвратным движением, т.е миозин IXb движется в направлении минус конца актиновых филамент. Это подтвержает идею, что не уникальная инсерция в миозине VI отвечает за возвратное движение.

Все полученные резулдьтаты указывают на то, чтоt myosin IXb движется поступательно (processively). Показано, что миозин V с двумя головками и большой шейной областью движется поступательно вдоль актиновых филамент большими шажками. ЭМ показано, что миозин V м. шагать длинными стежками в 36-nm спиральных посторов актиновых филамент. Две оловки миозина V на актиновой филаменте воспринимают полярную конформацию, при которой одна головка искривлена, а др. прямая. Предполагается, что поступательные большие шажки миозина V осуществляются за счет наклона длинного шейного домена одной головки, которая ведет головку партнера к соседнкму спиральному повтору актиновой филаменты. Однако, для миозина IXb этот механизм непригоден, т.к. он имеет только одну головку. Для базирующегося на микротрубочках мотора, KIF1A, мотор семейства кинезинов с одной головкой, поступательное движение вдоль микротрубочки осуществляется на базе электростатических взаимодействий между богатой Lys петли KIF1A и богатым Glu С-терминальным концом тубулина (E-hook), предупреждая диффузию KIF1A с микротрубочек. Возможно, что сходный механизм оперирует и при поступательном движении миозина IXb по актиновым филаментам.