Решение кинетических параметров одиночной головки согласуется с кинетикой шагания, выявляемой в механических [5-9] и флюоресцентных исследованиях [1-14,28], подтверждая, что высвобождение FLA также является скорость-лимитирующим во время processive движения димерного мотора. Удерживающая сила для myoV составляет приблизительно 3 pN [7]. При превышении этой силы myoV часто отсоединяется от актина и затем повторно присоединяется начиная новое движение. Длины перемещений для myoV обнаруживают незначительную зависимость от груза, по крайней мере для препятствующих и способствующих грузов в пределах ±2 pN [9]. Физиологически это позволяет myoV эффективно транспортировать груз и противостоять против различных тянущих сил, встречающихся на актиновом цитоскелете. Моделирование processive движения указывает на то, что т.к. оно является результатом эластичного coiled-coil соединения между объемистым грузом и myoV, то мотору нет необходимости генерировать усилия большие или достаточно продолжительные, чтобы заставить груз следовать непосредственно за движением мотора. Поддатливая связь может временно абсорбировать внезапные механические переходы моторной молекулы и навязывать высоко регулярную походку мотора [29]. Сходная модель связи размера груза и гибкости соединения со скоростью шагов мотора [30]. Для сил, близких к удерживающей силе (т.е., 2-3 pN), время остановки при насыщении АТФ оказывается более продолжительным с увеличением силы и шаги назад наблюдаются с повышенной частотой [5-9]. Это указывает на то, что зависимые от груза шаги в кинетическом цикле, возможно ассоциируют с высвобождением АТФ - или с изомеризацией, предшествующей высвобождению АИФ - в ведущей и/или ведомой головке [5,7,12], или с зависимым от груза диффузионным компонентом, ассоциированным с поиском ведущей головки следующей позиции для связывания вдоль актиновой филаменты [5-9,19,20,31]. При удерживающих силах, превышающих 5 pN, мотор делает processive шаги назад в 36 nm [9]. Однако, неясно каким образом возвратные шаги и их кинетика связаны с биохимическим циклом головок.
Учитывая, что нативный myoV имеет две головки, каждая со служебным вкладом (duty ratio) 0.7, то следует ожидать только около 8 processive ступеней диффузионных встреч с актином, полагая отсутствие кооперативности между двумя головками [5]. In vitro, исследования одиночных молекул показали, что myoV является значительно более processive, чем те, которые совершают приблизительно 10-60 шагов [8-10,12-14,28,32,33]. Ключом к этой повышенной processivity, по-видимому, является зависимый от линии кинетический gating механизм из двух головок. При малом грузе и насыщенности АТФ, время продолжительности для взаимодействий одиночной myoV головки в 2-3 раза длиннее, чем продолжительность времени между шагами молекул с двумя головками во время processive движения [5 и 21], это указывает на то, что действие ведущей головки на перетаскивание головки увеличивает скорость высвобождения АДФ из последней. Такой зависимый от груза gating механизм д. служить для поддержания биохимических циклов обеих головок несинхронными и увеличивать длину processive перемещения путем редукции вероятности отсоединение обеих головок от актина в один и тот же момент. Биохимические доказательства для головка-головка пропускания (gating) получены в экспериментах, которые решали бифазную кинетику высвобождения АДФ для димерной конструкции myoV в присутствии актина, когда обе головки были напряжены из-за одновременного связывания с актиновой филаментой [34]. Данные согласуются с моделью, в которой высвобождение АДФ ускоряется в 2-3 раза в отстающей головке и замедляется примерно в 50 раз на ведущей головке по сравнению с высвобождением АДФ видами с одиночной головкой.
Прямые измерения зависимости от груза акто-миозиновых взаимодействий недавно были осуществлены с использованием техники механики одиночных молекул, В одном исследовании эффект груза на продолжительность жизни прикрепления одиночной myoV головки (S1) измерялся в пределах грузов свыше ±2 pN [19]. Анализ хода времени одиночных acto-S1 взаимодействий показал, что каждый гидролизованный АТФ, это рабочий толчок к двум суб-шажкам (~16 nm + ~5 nm), возможно купированными с Pi и высвобождением FLA или изомеризацией, предшествующим или последующим продуктом высвобождения [5]. Это подтверждено недавними cryo-EM данными сравнения acto-myoV комплексов при разных состояниях нуклеотидов [35]. Первый полу-шаг происходит в течение 3 ms связывания миозина и сопровождается АТФ-незаивисмой, но зависимой от груза задержкой, возможно согласующейся с некоторыми состояниями АДФ и заканчивающейся с помощью второго приблизительно в 5-nm sub-шага. Это сопровождается АТФ-зависимой фазой, которая лишь слегка зависит от груза и возможно представляет свободное от нуклеотида состояние оцепенения (rigor state). Эта фаза заканчивается с помощью связывания и отсоединения АТФ. Др. исследование, в котором сравнивали эффект двух разных грузов на общее время прикрепления, подтвердило более короткую продолжительность времени для толкающих и более длинную для тянущих сил в 2 pN в этих экспериментах. При этом эффект концентраций АТФ и FLA на продолжительность времени также согласовался с зависимым от груза состоянием FLA, которое, по-видимому, менее чувствительно к толкающим, чем тянущим силам [31]. Внутримолекулярное натяжение, вызывающее силы в противоположных направлениях на головки, как ожидается, возникает как результат несоразмерности между 20-25-nm рабочим толчком одиночной головки и расстоянием в 36-nm между головками, когда обе связаны. ЭМ картины myoV, связанного с актином посредством двух головок подтверждает идею внутримолекулярного натяжения [17,18].
MyoV moves via a hand-over-hand mechanism where the neck region acts as a rigid leverarm
Два варианта TIRF микроскопии предоставили доказательства, что myoV движется с помощью механизма a hand-over-hand, причем две головки чередуют ведущее и ведомое положение. Недавно флюоресцентная техника, наз. FIONA (fluorescent imaging with one nanometer accuracy) была использована [12] для мониторинга processive движений одиночной, флюоресцентно меченной молекулы myoV на иммобилизованных филаментах актина в отсутствие нагрузки [12-16]. Если собирается достаточное количество фотонов, то функция распространения точки и следовательно средняя позиция иммобилизованных fluorophores, может быть определена с разрешением 1-2-nm [12]. Молекулы MyoV с одиночным cy3-меченным calmodulin [12-14] или GFP, слитым с N концом одной головки [14] дают размеры шагов и кинетику, согласующиеся с hand-over-hand механизмом, где задняя головка движется вперед на расстояние одного актинового повтора (72 nm), при этом она становится новой ведущей головкой. Это расстояние согласуется с размером шага в 36 nm, найденным в механических экспериментах по измерению движения центральной массы молекулы. Еще более прямые доказательства механизма hand-over-hand получены в исследованиях с помощью FIONA, в которых две головки метили по-разному с помощью fluorophores разных цветов, что позволяло визуализовать чередующиеся движения (72 nm) двух головок и показало согласие с 36-nm разделением между двумя прикрепленными головками [15,16]. В др. экспериментах была использована флюоресцентная поляризация, чтобы определить предполагаемые углы с помощью флюоресцентного зонда. связанного с calmodulin в шеечной области myoV. Чередующиеся углы наблюдались, т.к. myoV двигался processively, что согласуется с кинетически и структурно с моделью, согласно которой две головки движутся по очереди с помощью механизма hand-over-hand mechanism [28].
Мнение, что область связывания легкой цепи или шейки миозина может функционировать как плечо рычага путем создания больше-угольного rigid-body движения вокруг точки вращения в моторном домене первоначально было высказано в отношении кристаллической структуры myosin II, которая обнаруживала различные позиции шеечной области в разных состояниях связи нуклеотида (see [36] for review). Негативно окрашенные ЭМ картины myoV в отсутствие актина показали нуклеотид-зависимые leverarm повороты (swings) [18], и myoV leverarm повороты непосредственно наблюдались с помощью fast AFM imaging of myoV в присутствие нуклеотида [37]. MyoV кристаллография и комбинация cryo-EM миозина, связанного с актиновыми филаментами, с представлением кристаллической структуры в трехмерной реконструкции подтвердила, что малые движения элементов моторного домена, которые происходят в ответ на связывание и гидролиз нуклеотида, передаются посредством пути трансдукции, чтобы позволить шеечной области myoV поворачиваться приблизительно на 75-105°, что д. соответствовать смещению кончика плеча рычага на 20-36 nm [17,22,35]. Очень строгое подтверждение в пользу модели плеча рычага получено в механических экспериментах, когда область шейки myoV удлинялась или укорачивалась за счет добавления или субтракции IQ мотивов [10,13,20,38]. В этих исследованиях было показано. что скорость смещения актиновых филамент поверх иммобилизованых головок миозина, скорость смещения одиночной молекулы myoV вдоль иммобилизованных филамент актина, размер рабочего хода, продуцируемого одиночной головкой и величина шага при processive перемещении димерного myoV всё это варьирует приблизительно линейно в зависимости от длины плеча рычага myoV.
Вопрос действительно ли необходимы myoV точно 6 IQ мотивов, чтобы быть высоко processive также задавался. Ясно, что молекулы myoV с 2, 4, 6 или 8 IQ мотивами также все д. двигать processively [10,13,20,31]. Учитывая, что молекулы с меньшим или большим количеством IQ мотивов делают шажки, которые короче или длиннее 36 nm, скорее всего указывает на то, что эти молекулы обвиваются спирально вокруг актиновых филамент во время движения. Фрагмент myoV с двумя головками и только одним IQ мотивом не может двигаться processively [10], но в др. исследовании установлено, что химера. состоящая из myoV головки с одним мотивом IQ , слитым с палочковидным доменом гладкомышечного миозина может совершать 2-3 последовательных 36-nm шажка [11].
Все детальные биохимические и кинетические эксперименты, описанные выше осуществлены с использованием мышиного или куриного myoVa, но processivity не является универсальным свойством класса-V миозинов. Временной кинетический анализ
Drosophila myoV указывает на то, что высвобождение АДФ не является скорость лимитирующим и молекула не способна двигать актиновые филаменты processive способом. Был сделан вывод на базе actin landing подхода, что два типа-V миозинов
S. cerevisiae, myo2p и myo4p, также не являются processive [40]. Необходимо отметить, однако, что эти разные подходы являются непрямым измерением processivity, а более прямые подходы ещё не применялись.
Models for processive movements
Представлено несколько моделей для processive движения myoV. Почти все они полагают, что структура из двух головок необходима (противоположное мнение здесь [41]). Критическими вопросами являются состояние нуклеотида и сродство к актину двух головок миозина во время периодов остановки (Figure 2). Исследования с помощью оптических ловушек, измерения жесткости акто-миозина во время прикрепления выявил и пониженные уровни жесткости непосредственно перед каждой ступенью перехода, это подтверждает, что при насыщающих концентрациях АТФ и небольшом грузе молекулы останавливаются в большинстве, когда обе головки строго связаны с актином [состояния (b) или (c) на Рис. 2] [5]. Это согласуется с биохимическими, механическими и структурными исследованиями, подтверждающими, что в этих условиях myoV останавливается с обеими головками строго связанными в некое АДФ состояние(я) и что кинетика отсоединения головок детерминируется слегка ускоренным и строго редуцированным высвобождением АДФ на ведомой и ведущей головках, соотв., из-за внутримолекулярного натяжения (strain) [5,6,19,31, 34]. В этой модели myoV движется processively столь долго, пока ведущая головка не соединится строго с актином, прежде чем ведомая головка высвободит АДФ и затем свяжет АТФ, что приведет к отсоединению этой головки и тем самым всей молекулы. Путь на Рис. 2 д.б. (a)→(b)→(c)→(d) для одного шага. Нерешенными вопросами остаются, может ли ведущая головка продуцировать свой собственный рабочий толчок, в то время когда запаздывающая головка всё ещё соединена и существует ли взаимосвязь между конформационными изменениями и высвобождением АДФ, Pi или процессами изомеризации.
Напротив, модель, базирующаяся на соответствии зависимости от нуклеотида длины перемещения и скорости myoV, указывает на два отличия от выше приведенной модели. Во-первых, состояние остановки доминирует в молекулах с АДФ, строго связанным с задней головкой, и с ADP.Pi слабой связью в ведущей головке [состояние (a) in Figure 2]; во-вторых, завершение происходит из того же самого состояния [32]. Начиная с состояния (a), два пути перемещения возможны. В первом ведущая головка присоединяется, высвобождая свой фосфат и в результате две с АДФ-связанные головки оказываются прикрепленными к актину [состояние (b)], подобно выше приведенной модели. Во втором случае подтягиваемая головка высвобождает АДФ в то время как ведущая головка всё ещё слабо связана [состояние (e)]. Лимитирующей ступенью в этих двух путях д.б. прикрепление ведущей головки, сопровождаемое высвобождением Pi из этой головки [(a)→(b)] или высвобождение АДФ из прикрепленной головки, подтягиваемой головки [(a)→(e)]. Завершение processive перемещения скорее всего происходит благодаря диссоциации из состояния (a) на Figure 2. Кинетические исследования двух-головочного myoVa кур, однако, указывают на то, что высвобождение фосфата быстрое, что, по-видимому, не согласуется с выше приведенной моделью, но эффект различий между видами и подходами необходимо учитывать
Conclusions
MyoV is an ideal molecule to dissect the molecular basis for processivity. It expresses well in in vitro systems, so mutants can be prepared and studied. It is large enough to be easily seen in electron microscopic images and has a high affinity for actin. Its kinetic and many of its mechanical properties have been elucidated in a series of elegant experiments. This has provided important information to test stochastic models interpreting measured force–velocity relationships and relating those to the kinetics and substeps of load-dependent forward and backward reactions [42]. In order to test models addressing head coordination and stepsize distributions in myoV [43 and 44], additional stiffness measurements of the dimeric motor and of a single myosin head in different biochemical states are required and will provide complementary information to structural studies on the myoV light chain binding domain, which is assumed by many to act as a leverarm [45]. The next advances will require the combination of mechanical studies with single molecule fluorescence measurements reporting nucleotide binding. An understanding of the molecular mechanism for myoV action will contribute to an understanding of force generation in other myosins and in other molecular motors.
Сайт создан в системе
uCoz
and Claudia Veigel