| |
|
|---|---|
Obscurin, a giant sarcomeric Rho guanine nucleotide exchange factor protein involved in sarcomere assemblyP. Young, E. Ehler, M. Gautel J. Cell Biol. V. 154 N 1. P. 123-136. 2001 |
Сокращения: DHdbl homology; Fnfibronectin; GEFguanine nucleotide exchange factor; PHpleckstrin homology PI3phosphatidyl inositol 3; PiPphosphatidylinositol-phoaphates; SH3Src homology 3 Саркомеры, наименьшие сократительные единицы поперечно исчерченных мышц, собираются из тысяч белковых субъединиц в большие и наиболее регулярные макромолекулярные комплексы. Саркомеры собираются во время эмбриональной дифференцировки сердца и скелетных мышц, а также во время физиологической замены мышц. Новые саркомеры образуются с высокой скоростью в гипертрофированных мышцах. Процесс сборки миофибрил нуждается как в пространственной так и временной координации взаимодействий белков. Два гигантских модулярных белка действуют в качестве молекулярного остова или кальки в мышцах позвоночных. Титин (известный также как коннектин) и небулин обеспечивают специфические места для присоединения др. белков, специфицируя тем самым положение саркомеров. Делеция титина ведет к нарушению сборки миофибрил. Эти гигантские белки кроме того содержат потенциальные сигнальные домены: COOH-terminal Src homology 3 (SH3) домен в небулине и саит множественного фосфорилирования, а также С-терминальный каталитический протеин киназный домен в титине, участвующие в сборке миофибрил.
У Caenorhabditis elegans titin, twitchin и unc-89 ассоциируют, по крайней мере частично, с миозиновыми филаментами. Titin и twitchin содержат myosin light chain kinase-like protein kinase домен, который участвует в контроле образования миофиборил на титине, тогда как unc-89 содержит G protein-activating GDP/GTP exange factor домен (GEF домен).
Помимо Ig-подобного домена титин содержит уникальные последовательности, которые участвуют в передаче сигналов или во взаимодействиях с др. саркомерными белками. Специфические титиновые домены взаимодействуют миомезином, миозином, миозин-связывающим белком С, α-актинином и telethonin на расстоянии от М-линии до Z-диска. Эти взаимодействия специфицируют саркомерную локлизацию и др. белковых компонентов и предопределяют длину миозиновых филамент или толщину Z-диска. В I-диске титин состоит из Ig доменов расположенных тандемно, и уникальных последовательностей, т. наз PEVK области. Эти два вторичных структурных элемента действуют как серийные springs и ответственны за пассивную элестичность мышц; тандемны Ig участки отвечают в основном за растяжение малыми силами и препятствуют растяжению высокими силами.
Несколько плейотропных сигнальных путей контролируют образование новых саркомеров, включая Src и р38-митоген-активируемые киназные, фисфатидил инозитол 3 (PI3)-киназные пути и Rho-семейство малых G-белков. Все эти пути оказалось связывают внеклеточные сигналы с транскрипционной кухней (machinery) и возможно регулируются компонентами саркомер.
Идентифицирован и охарактеризован новый гигантский белок obscurin, модулярный белок примерно в 800 кДа, содержащий GEF домен, который, по-видимому. осуществляет непосредственную связь между саркомерами и G-белком регулируемым путем, который контролирует формирование новых миофибрил.
| The Ig domains: homology to titin and implications for sarcomeric functionОбскурин локализуется на хромосоме 1q42, он экспрессируется специфически в скелетных и кардиальных мышцах. Полные полследовательност кДНК обскурина указывают на его модулярную архитектуру. Он состоит более чем из 67 внутриклеточных иммуноглобулиновых (Ig)- или фибронктин-3-подобных доменов и имеет множество сплайс-вариантов. Большая область обскурина, обнаруживающая модулярную архитектуру тандемных Ig доменов, напоминает эластическую область титина. С-терминальная область обскурина взаимодействует с двумя специфическими Ig-подобными доменами в N-терминальной области Z-диска титина. Оба белка собираются вместе во время миофибриллогенеза. Предполагается, что тандемные Ig домены титина и обскурина выполняют аналогичные функции в саркомерах (растяжение). В ходе миофибрилоогенеза все эпитопы обскурина становятся обнаружимыми в М диске. Участвует ли обскурин в поперечном связывании толстых филамент в М-диске или прикреплении периферии М-диска к др. цитоскелетным струкутурам, пока неясно. Второй функцией Ig доменов титина является взаимодействие с др. саркомерными белками. Некоторые из этих взаимодействий обеспечиваются парой соседних Ig доменов, включая взаимодействия с Z-дисковым белком telethonin, А-дисковый белком, миозин-связывающим белком-С, и М-дисковым белком миомиозином. Обскурин соединяется с двумя Ig доменами титина, Z9 и Z10, оба из них необходимы для этого взаимодействия. Сходным образом оба обскуриновых Ig домена, Ob48 и Ob49, необходимы для этого гомотипического взаимодействия. Ig домены N- и С-конца отличаются по составу последовательностей, возможно, они также м. участвовать во взаимодействиях лигандов скорее, чем просто в механических функциях. Однако дополнительные лиганды неидентифицированы. Два Fn3 домена обнаруживают гомологию со сходными доменами титина и др. саркомерных белков. Интересно, что все саркомерные белки содержат Fn3 домены, ассоциирующие с миозином. В титине Fh3 домены обнаруживаются исключительно в области толстых филамент. Обскурин, как временно с Z-диском ассоциируемый белок, м.б. первым исключением из правила, однако функция двух одиночных Fn3 доменов м. б. важной для ассоциации со зрелыми М-дисками.The GEF domain DH домены (наз. также Rho-GEF доменами) катализирует обмен ГДФ на ГТФ в малых G-белках семейства Rho, активируя тем самым G-protein-regulated сигнальный каскад. Это м. вести ко множественным клеточным реакциям от реорганизации цитоскелета с ремоделированием актинового цитосклетк до регуляции транскрипци и контроля клеточного цикла. DH домены всегда соединяются с С-терминальным РН доменом. РН домены обнаруживаются также как независимые в белках, ассоциированных с мембранами, где они взаимодействуют с phosphatidyl-inositol-phospates (PiP). DH, сцепленный с РН, формирует отдельную группу, не все члены которой связываются с PIP. Структурный анализ unc-89 PH домена указывает на то, что он "нелигандного" типа из-за его негативного электростатического потенциала. Следовательно, возможно, что РН домены в гигантских мышечных белках unc-89 и обскурине не связаны с передачей сигналов фосфолипидам. На это указывает и саркомерная, а не мембранная локализация РН доменов в мышцах. Однако нельзя исключить PiP связывание для РН домена обскурина, т.к. изоэлектрические точки unc-89 (6.53) и обскурина (10.33)различны.
Инвариантное присутствие РН домена по соседству с DH доменами указывает на то, что они играют витальную роль в функционировании DH доменов. Так в белке Vav GEF активность DH домена дважды аутоингибируется с помощью N-терминальной спирали, блокирующей доступ Rho к DH домену с помощью ингибирующего тирозина и с помощью РН домена, защищающего эту закрытую конформацию. После фосфорилирования РН-связанного PiP2 с помощью PI3-киназы, аутоингибирующий тирозин становится доступным для фосфорилирования с помощью Src-подобной киназы и аутоингибирование полностью устраняется. Последовательности обскурина указывают на то, что тот же механизм регулирует и его GEF активность. Интересно, что DH домен обскурина содержит специфический полипролиновый участок, который м служить как внутримолекулярный лиганд для SH3 домена, который м. тем самым играть регуляторную роль.
The IQ motif
Присутствие калмодулин-связывающего IQ мотива и Rho guanine nucleotide exange factor домена в С-терминальной области указывает на то, что обскурин участвует в Ca2+/calmodulin, а также в G протеин-coupled сигнальной трансдукции в саркомерах.
IQ мотивы м.б. кальций-зависимыми и кальций-независимыми калмодулин связывающими мотивами. IQ мотив обскурина является функциональным, он взаимодействует с калмодулином кальций-независимым образом. IQ модтив отделен от DH домена 4 Ig доменами, это указывает на то, что СаМ связывание с обскурином модулирует активность другого, а не guanine nucleotide exchange.
Obscurin expression and sarcomeric integration
С помощью вторичной структуры из тандемных Ig доменов локализация в I-диске, подобно титину, наиболее правдоподобна. Ob48-49 взаимодействуют с Z9-Z10 титина . В соответствии с этим эпитоп α-Ob48-49 локализуется в Я-диске у эмбрионов кур на стадии 10 сомитов. Однако позднее в зрелых миофибрилах α-Ob48-49 ко-локализуется в М-диске вместе с др. эпитопами обскурина, которые первоначально диффузны или отсуствуют. Это указывает на то. что взаимодействие обскурина с титином м.б. временным и регулироваться онтогенетически. Невозможность обнаружить некоторые эпитопы лбскурина, такие как ObOH, Ob19-20 на ранних стадиях или изменение их локализации на поздних стадиях м.б. обусловлено маскирпованием эпитопов. Или возможно, что области обскурина, которые ответственны за таргетинг его в М-диск или сплайсированы, что ведет к последовательному появлению разных изоформ обскурина, или выключены, напр. с помощью фосфорилирования на ранних стадиях развития. Последовательное появление и интеграция разных эпитопов характерна и для титина. В титине область М-диска оказывается организованной после включения Z-диск закрепляющей N-терминальной области и временной ко-локлизации с N-терминальной областью . Некоторые М-дисковые эпитопы титина маскированы на этой стадии. LIM белок DRAL обнаруживается как в М-диске, так и в Z-диске в сердечной мышце, указывая тем самым, что некоторые сигнальные молекулы м. общаться с обоими компартментами. Найден киназный регулятор титина в Z диске несмотря на его взаимодействие с М-диском титина, а субстрат для титиновой киназы, telethonin, также обнаруживается в Z диске. Сходным образом изоформы обскурина м. оккупировать разные саркомерные сайты связывания онтогенетически регулируемым образом и, следовательно, сигнальные функции обскурина во время ранних стадий развития мышц м.б. отличными от таковых во взрослых мышцах.
Итак, ассоциация обскурина с Z диском в основном наблюдается в клетках, где актиновый цитосклет еще не организован в регулярные параллельные миофиборилы, и расположен вдоль клнеточных мембрн и в виде нерегулярного пересекающегося паттерна.Локализация М-дисков наблюдается в клетках, в которых миофибрилы начинают складываться в параллельные пучки в центре клетки. В зрелых кардиомиоцитах миофибрилы расположены параллельно и обскурин обнаруживается в М-дисках. Это совпадение перераспределния обскуриновых эпитопов с ремоделированием активнового цитосклета подтвержает, что обскурин м. участвовать в этом структурном переходе.
Следует отметить, что DH домены др цитоскелетных белков, подобно trio, активируют GTPases семейства Rho, которые участвуют в организации актиновго цитоскелета, подобно образованию стрессовых волокон с помощью Rho и ruffling мембран с помощью Rac. Предполагается, что SH3-DH-PH триада в обскурине м. участвовать в передаче сигналов с помощью Rho-like GTPases, что необходимо для перестройки цитоскелета во время миофибрилогенеза. Rho-like GTPases кроме того играют важную роль в контроле транскрипции мышечных генов во время развития и гипертрофии. Эта функция, по-видимому. превалирует с кардиальных мышцах.
Идентификация Rho-GEF в саркомерах позвоночных - первое доказаетльство прямого общения между саркомерами и G-протеиновым путем, ведущим к формированию новых саркомеров.
|