Proteomic screen finds pSer/pThr-binding domain localizing Plk1 to mitotic substrates.
Elia, A. E. H., Cantley, L. C. & Yaffe, M. B. Science299, 1228-1231 (2003) | |
FURTHER READING Yaffe, M. B. & Elia, A. E. Phosphoserine/threonine-binding domains. Curr. Opin. Cell Biol.13, 131-138 (2001) | |
WEB SITE
Phosphopeptide-связывающие домены и фосфорилированные остатки serine, threonine или tyrosine все вместе подобны молекулярному lego, обеспечивающему белок-белковые комплексы. Ряд доменов, которые специфически распознают фосфорилированные мотивы, растет. Elia, Cantley и Yaffe, использовав протеомный подход для идентификации 'polo-box domain', нового phosphoserine (pSer)/phosphothreonine (pThr)-связывающего домена, нашли, что он присутствует в митотической киназе Polo-like kinase 1 ().
Т.к. протеин киназы и phosphopeptide-связывающие домены распознают перекрывающиеся аминокислотные мотивы, поэтому авт. разработали подход, базирующийся на частично degenerate phosphopeptide бибилотеке, в отношении мотива фосфориляции киназ и затем immobilizing эту библиотеку и использовали ее как затравку (bait) в скрининге взаимодействующих белков. В данном случае они использовали pThr-proline библиотеку тенденционую в отношении мотива, который генерируется с помощью cyclin-dependent kinases (CDKs) и mitogen-activated protein kinases, которая также распознается с помощью антител MPM-2, a mitotic phosphoprotein-specific monoclonal антител. Использование коллекции пептидов скорее, чем одиночного пептида увеличивает шансы взаимодействия. Как контроль использовали библиотеку phospho-независимого связывания идентичных нефосфорилированных пептидов.
Один из изолированных клонов, кодирует С-терминальную часть Plk1. Она отсутствует в некоторых из ее киназных доменов, указывая тем самым, что связывание фосфопептида происходит независимо от каталитической активности. Члены семейства Polo киназ имеют два 'polo boxes' в своем С-терминальном домене, а серия делеционных конструкций показывает, что и polo боксы и linker между киназным доменом и polo box 1 образуют 'polo-box domain' (PBD).
Путем скрининга нескольких pSer- и pThr-содержащих пептидных библиотек и используя isothermal titration calorimetry, авторы определили оптимальный связывающий мотив для PBD — строгое предпочтение serine в (pThr или pSer) -1 позиции и proline в (pThr или pSer) +1, это привело их к предположению о том, что консенсусом связывающего мотива является Ser-(pThr/pSer)-(Pro/X).
Законсервированный (pSer/pThr)-Pro эпитоп, который распознается с помощью MPM-2 антител, появляется у ~50 митотических фосфопротеинов. phosphoproteins. Многие из них специфически связаны с помощью Plk1 PBD, а взаимодействие блокируется с помощью инкубации с оптимальным phosphopeptide ligand. Один митотический фосфопротеин, phosphatase , имеет консенсус Plk1 PBD-связывающего мотива на своем N-конце. Трансфекция Cdc25C точковыми мутантами, которые как ожидалось имеют разрушенный PBD-связывающий мотив, теряют свою способность взаимодействия с Plk1 PBD и влияют на иго последующее митотическое фосфорилирование.
Yaffe и др. нашли, что PBD из Plk1 ответственен за локализацию Plk1 в центросомах во время профазы. Т.к. PBD соединяется также с киназным доменом Plk1, то д. существовать параллелеи между PBD и phosphotyrosine-связывающими Src-homology-2 () доменами, тем, что оба домена направляют свои киназы в направлении фосфорилированного субстрата на активацию, но ингибируют активность phosphotransferase в базовом состоянии. Сходным с SH2 доменами образом PBDs также м. являться особенно привлекательными мишенями для низко-молекулярных миметиков как потенциальные лекарственные средства.