Многие неродегенративные заболевания связаны с отложением нерастворимых молекул амилоида. При б-ни Alzheimer's , напр., амилоид β-peptide (Aβ) является компонентом характерных сенильных бляшек. Протеолитические ферменты secretases участвуют в продукции Aβ, и одна из них идентифицирована как presenilin.
Boxes
Box 1 | Mutations in the β-amyloid precursor protein gene
Mendelian inheritance of Alzheimer's disease has been observed in a small fraction of patients, and autosomal-dominant mutations are located within the β--amyloid precursor protein (β-APP) gene. All β-APP mutations are clustered within and around the Aβ- domain at three main locations — each mutation is close to one of the three secretase cleavage sites
When these mutations were investigated in tissue culture, as well as in the human brain, most were found to increase production of the highly amyloidogenic 42-amino-acid form of Aβ- (Aβ-42). This peptide not only aggregates much faster than its shorter counterpart, but is also specifically deposited in senile plaques. Moreover, Aβ-42 also accumulates in senile plaques formed in sporadic cases of Alzheimer's disease. So Aβ-42 is probably the main pathological component in all cases of Alzheimer's disease.
Box 2 | Alternative functions of presenilins
Although an aspartyl protease activity of presenilins seems likely, there is evidence for other functions and alternative explanations of the current data.
The spatial paradox. The cellular distribution of presenilins does not reflect that of their substrates, such as β-APP and Notch. These substrates undergo presenilin-dependent cleavage at, or close to, the cell surface, whereas presenilins are restricted to the endoplasmic reticulum and early Golgi. This paradox may have been solved by the identification of small amounts of presenilins on the cell surface, and perhaps in endosomes; a localization consistent with the site of γ-secretase cleavage.
Differential support of β-APP and Notch endoproteolysis. Selective artificial mutations of PS1 block Notch endoproteolysis and Notch signalling, but still allow Aβ- production. This may be due to differential effects of the substrate-binding site; to the participation of endogenous wild-type PS1 in formation of a presenilin complex; or to the involvement of two proteases with γ-secretase activity in production of the Notch intracellular domain and Aβ.
Subcellular transport. The reduced γ-secretase cleavage in neurons from PS1-knockout animals may be due to subtle effects on the subcellular transport of presenilin substrates, and may indicate a function of presenilins in selective protein transport.
The unfolded protein response. Presenilins have been implicated in the pathway (although other evidence indicates that they are not), which may be associated with neuronal loss in Alzheimer's disease. The UPR is downregulated both by a PS1 knockout and FAD-associated PS1 mutations. Downregulation of the UPR is suggested to be due to failure in a γ-secretase-like cleavage of the ER stress sensor Ire1, a type I transmembrane protein required for expression of several UPR chaperone genes.
Regulators of apoptosisα Many studies indicate that presenilins may affect cellular survival. Mutations associated with familial Alzheimer's disease may facilitate induction of apoptosis, causing cell death, although it is not understood how such a function could be related to a proteolytic activity of presenilins. However, it is interesting to speculate that presenilins could activate the apoptotic cascade by liberating a cytoplasmic fragment from the Fas death receptor.
Memory defects. Presenilins rescue a memory deficit in sel-12 mutant worms. However, the function of presenilins in memory and axonal guidance has been attributed to a facilitation of Notch signalling, which is consistent with their proteolytic function.
Calcium entry. Presenilins affect . A PS1 knockout, as well as mutations in the active-site aspartate, potentiates CCE, whereas FAD-associated presenilin mutations attenuate CCE. It is not clear whether presenilins modulate calcium entry through their proteolytic function, because γ-secretase inhibitors seem to have no effect on CCE.
B. Wu, H. Yamaguchi, F. A. Lai, J. Shen, Presenilins regulate calcium homeostasis and presynaptic function via ryanodine receptors in hippocampal neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 15091–15096 (2013).
L. D’Adamio, P. E. Castillo, Presenilin-ryanodine receptor connection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 14825–14826 (2013).
Более 90% пациентов с familial Alzheimer's disease (fAD)имеют мутации в генах presenilin (PS) . Дефект преобразования белка амилоидного предшественника за счет активности PS-обеспечиваемой {gamma}-secretase активности, скорее всего, является основным патогенетическим фактором fAD, но Wu et al. описали др. механизм с участием ryanodine receptors (RyRs), которые являются семейством лигандами управляемых в эндоплазматическом ретикулуме (ER) (see D'Adamio and Castillo). Стимуляция RyRs высвобождает кальций из ER в цитозоль, это может увеличивать количество кальция, проникающего посредством напряжением управляемых каналов в плазматическую мембрану, чтобы способствовать экзоцитозу пресинаптических пузырьков. Wu et al. использует культивируемые первичные нейроны и свежие срезы головного мозга мышей с кондиционным удалением PS1 и PS2 в CA3 регионе гиппокампа (PS-cDKO), чтобы показать, что синаптическая потенциация нарушается, но что потеря PS в культивируемых нейронах не влияет на базовый уровень концентрации кальция в ER или концентрацию SERCA [the sarco-ER calcium adenosine triphosphatase (ATPase)], ER calcium ATPase или лигандом контролируемого, ER-localized calcium channel IP3R1 (inositol 1,4,5-trisphosphate receptor). Вместо этого анализ региона CA3 на срезах головного мозга PS-cDKO мышей показал снижение связывания [3H]ryanodine. В нейронах гиппокампа, культивируемых от PS-cDKO мышей, концентрация RyRs; способность агонистов RyR, caffeine и 4-chloro-m-cresol необходимы, чтобы индуцировать высвобождение ER кальция; а caffeine-обусловленная потенциация field excitatory postsynaptic potentials (fEPSP) была снижена. Dantrolene, ингибитор RyR, снижает caffeine-обеспечиваемую потенциацию fEPSPs в контрольных нейронах, но не в нейронах PS-cDKO. Лентивирусная инфекция нейронов гиппокампа двумя независимыми с короткими шпильками РНК воздействует на все три RyRs, снижая количества RyR в той же самой степени, что и в нейронах PS-cDKO и ингибируя увеличение внутриклеточного кальция, индуцируемое с помощью caffeine или воздействия высоких концентраций калия. Более того, электорофизиологические измерения индивидуальных нейронов, в которых RyR были подвергнуты нокдауну, или нейронов от PS-cDKO мышей, показали, что частотные содействия (frequency facilitation) в синапсах были нарушены. Принимая во внимание, что пациенты с fAD демонстрируют снижение когнитивных функций, связанные с дефектами потенциации синапсов, то эти находки м. предоставить новую информацию о том. как мутации в PS вносят вклад в эту болезнь.
Основным фактором риска для болезней таких как является старение. Б-нь Алцгеймера это не единственное нейродегенеративное нарушение. Отложение амилоида происходит при , и . Эти амилоидные молекулы подвергаются структурным изменениям, которые инициируют и облегчают их быструю агрегацию и преципитацию в β-слоистые фибрилы, которые, как полагают, нейротоксичны и ответственны за характерную для болезни патологию.
Secretases process βAPP
Основной нерастворимой молекулой при б-ни Алцгеймера является амилоид β-peptide (Aβ), который откладывается в головном мозге людей в виде сенильных бляшек (Рис. 1 )). Большинство Aβ пептидов заканчиваются после 40 аминокислот, но меньшая их часть удлинняется за счет двух добавочных остатков на С-конце. Длинная форма , Aβ42, считается основным токсическим компонентом при Alzheimer's disease.
Aβ образуется из большого белка β-amyloid precursor protein ( ), в результате . Белок βAPP является повсеместно экспрессирующимся белком с трансмембранным доменом типа I, который кодируется геном, расположенным в хромосоме 21. Familial Alzheimer's disease (FAD) встречается лишь у незначительной части пациентов и аутосомно-доминантные мутации располагаются у них в гене βAPP (Box 1 ). Пациенты с трисомией 21 (Down's syndrome) обнаруживают рано Alzheimer's-disease-подобную патологию с сенильными бляшками, неотличимыми при Alzheimer's disease. Добавочная копия гена βAPP вызывает более раннее накопление Aβ.
Протеазы, участвующие в продукции Aβ называются secretases. Идентифицированы 3 отдельные secretase activities (Рис. 2 ). Первая является α-secretase, которая генерирует N-конец Aβ домена . Идентифицированы два высоко гомологичных β-secretase энзима — (β-site APP cleaving enzyme) и. Обе являются мембран-связанными aspartyl proteases, которые расщепляют βAPP сиквенс-специфическим способом. BACE выполняет основную α-secretase активность в головном мозге, тогда как BACE2 ,по-видимому, локлизуются преимущественно в периферических тканях. BACE продуцируется как предшественник (возможно представляющий собой неактивный ). Он содержит пропептид на своем amino конце, который удаляется рано во время созревания - возможно с помощью furin-подобной протеазы. BACE имеет кислый pH оптимум, что согласуется с предположением об участии acidic endosomes.
Рис.2.
Второй secretase является γ-secretase, которая обеспечивает расщепление С-конца βAPP и наконец высвобождает Aβ (Рис . 2 )). γ-secretase является необычной aspartyl protease. Она, по-видимому, расщепляет βAPP почти в центре трансмембранного домена. Она также обладает бедной сиквенс-специфичностью , по крайней мере, в отношении распознавания βAPP. Aβ образуется при физиологических условиях и и комбинирует активности β- и γ-secretases и вызывает их секрецию в биологические жидкости ( Рис . 2 ).
Наконец, мы имеем α-secretase, которая расщепляет Aβ домен в центре и ингибирует генерацию Aβ. Две родственные протеазы, по-видимому, обладают α-secretase активностью, обе являются из семейства ADAM (a disintegrin and metalloprotease). Распознавание субстрата с помощью этих протеаз зависит от расстояния α-спиральных структур внутри субстратов-мишеней от плазматической мембраны.
Presenilins: key to understanding Alzheimer's
Большинство случаев FAD с ранним началом ассоциируются с двумя гомологичными генами, presenilin и . Некоторые мутации PS1 обусловливают наиболее агресивную форму Alzheimer's disease, с началом после 30 лет.
A channel-like structure? Presenilins являются политопическими мембранными белками, которые постоянно подвергаются эндопротеолизу. в их большой цитоплазматической петле (Рис . 3 ). Это расщепление обусловливает генерацию стабильных amino- и carboxy-terminal фрагментов (NTF и CTF, соотв.), которые соединяются друг с другом и образуют ферментативно активный гетеродимерный комплекс. Однако не обнаружено смешанных комплексов из фрагментов PS1 и PS2 . Разработана модель с 8 трансмембранными доменами, в которой N-конец, большая цитоплазматическая петля и С-конец все расположены в цитоплазме. Хотя топология пресенелинов ясна между трансмембранным доменом 1 и 6 их структура ниже большой цитоплазматической петли все еще целиком не ясна. Имеются разные модели, что м. указывать на изменчивое позиционирование цитоплазматического хвоста в цитоплазме или просвете. Пока eight-transmembrane domain модель кажется наиболее приемлемой.
Pore-forming модель способна предказать, почему мутации в разных трансмембранных доменах PS1 все повреждают предполагаемый активный центр (который является и каталитическим центром) во внутренней части поры. Мутации в коротких петлях между трансмембранными доменами м. интерферировать со структурой трансмембранных доменов и тем самым косвенно нарушать активный сайт Такой active-site domain идентифицирован в середине трансмембранных доменов 6 и 7.
Предполагается, что все мутации пресинелина нарушают активный сайт независимо от местоположения, следовательно, должны обусловливають одну и ту же патологическую дисфункцию. На самом деле все мутации, ответственные за FAD, которые проанализированы, увеличивают продукцию высоко amyloidogenic Aβ42. В мышиных моделях мутации как FAD-сцепленного presenilin так и βAPP увеличивают тенденцию Aβ преципитироваться в амилоидные бляшки. Мутации обоих генов βAPP(Box 1) и presenilin идентично запускают патологические механизмы, подтвержая центральную роль Aβ в Alzheimer's disease. Хотя прямое влияние мутаций βAPP на продукцию Aβ очевиден (Box 1) — труднее понять роль presenilins в генерации аберрантного Aβ.
Proteolysis-dependent signal transduction. Нокаут генов пресенелина демонстрирует их биологическую функцию. Мыши с делецией PS1 имеют некоторое фенотипическое сходство с мышами без . У этих мышей проблемы с формированием и ребер, а также с церебральными геморрагиями. Боле того двойной нокаут PS1 и PS2 почти неотличим от дефектов, вызываемых делецией гена Notch1.
Генетические доказательства от Caenorhabditis elegans, также подтверждают участие пресенелинов в решении судеб клеток. Фенотип мутантов (нарушения Notch signalling), м.б. нормализован с помощью трансгенной экспрессии генов PS1 и PS2 человека. Сходные результаты получены на Drosophila melanogaster.
Было установлено, что первичные нейроны, происходящие из головного мозга нокаутных PS1 животных не могут эффективно продуцировать Aβ или малые пептиды называемые p3. Более того, эти клетки накапливают высокие уровни βAPP carboxy-terminal фрагментов, образуемых α- или β-secretase. Эти фрагменты являются непосредственными предшественниками продукции Aβ и p3 (Рис. 2). Таким образом, в отсутствие PS1 дефект активности α-secretase очевидно ведет к снижению продукции Aβ и p3 и накоплению субстрата для γ-secretase. Логично заключить, что пресенилины непосредственно необходимы для функции γ-secretase.
Известно, что Notch подвергается эндопротеолизу после соединения со своими лигандами. Notch intracellular domain (NICD) высвобождается в результате протеолитического расщепления, которое происходит на или вблизи цитоплазматической стороны плазматической оболочки (Fig. 4.)Затем NICD транслоцируется в ядро, где соединяется с транскрипционными факторами семейства CSL (CPB/SuH/LAG-1) и регулирует транскрипцию генов-мишеней.
У мутантных мышей V1744G с блоком эндопротеолиза возникает фенотип, напоминающий тот, что вызывается Notch1 гена. Протеолитический процессинг Notch очень сходен с таковым βAPP, кроме того расщепление Notch зависит от пресенелинов. Делеция как PS1 так и PS2 полностью устраняет продукцию Aβ и генерацию NICD. Это объясняет почему нокаут PS1 затрагивает как передачу сигналов Notch так и продукцию Aβ.
В случае βAPP расщепление осуществляется α- или β-secretase. В случае Notch расщепление обеспечивается furin-like протеазой на site 1 (S1), что сопровождается вторичным разрезом (S2), осуществляемым tumour necrosis factor-α (TNF-α)-converting enzyme , членом семейства ADAM. Сходным образом с расщеплением S2 Notch, расщепление с помощью α-secretase βAPP также модифицируется членами семейства ADAM. Эктодеоменовое расщепление Notch и βAPP м. вызывать структурные изменения в оставшихся С-терминальных фрагментах, облегчая третьий (S3) разрез с помощью внутримембранного процессинга, обеспечиваемого активностью γ-secretase-пoдобной протеазы. Не только Notch и βAPP являются субстратами для presenilin-зависимого эндопротеолиза. The amyloid-precursor-like proteins ( ), которые гомологичны βAPP, также могут расщепляться PS1-зависимым способом — возможно внутри их трансмембранных доменов.
Presenilins: unusual aspartyl proteasesα
Итак, presenilins непосредственно влияют на эндопротеолиз избранных мембранных белков. Логично предположить, что пресенелины являются γ-secretase. Идентифицированы два интересных aspartyl residues в трансмембранных доменах 6 и 7 (Fig. 5 .) Мутации критическиех остатков aspartate в конвенциональных aspartyl proteases как известно ингибируют их протеолитическую функцию и если любой из двух критических аспартатов в PS1 мутирован, то наблюдается поразительный результат: presenilin endoproteolysis ингибирован, а carboxy-terminal фрагменты βAPP генерируются с помощью накопления α- или β-secretase (Fig. 2), которые иммунопреципитируются вместе с PS1 и PS2. Более того продукция Aβ заметно ингибирована, т.е. ингибирование активности γ-secretase , по-видимому, связано с отсутствием presenilin-зависимого эндопротеолиза βAPP. Следовательно, полной длины белок является зимогеном, который м.б. активирован с помощью аутопротеолиза (Fig. 5 ). Все aspartate мутантные производные PS1 и PS2 ингибируют эндопротеолиз Notch и не возвращают к норме фенотип мутантов sel-12 у C. elegans.
Имеются данные, согласующиеся с тем, что пресенелины образуют комплексы из их N- и С-концевыъ фрагментов, необходимых для образования активного центра bilobed aspartyl protease. Wolfe and Selkoe 65 пришли к заключению, что пресенелины и γ-secretase это oдно и то же. В этой модели субстраты м.б. расщеплены в канал-подобные поры presenilins (Fig. 5 ). Если каталитические сайты энзимов обращены лицом в канал, то это м. объяснить идентичные эффекты многих мутаций γ-secretase расщепляющих βAPP.
Хотя возможна альтернативная интерпретация (Box 2 ), эта интригующая гипотеза подтверждается элегантными экспериментами. Ингибиторы γ-secretase ковалентно прицеплялись к N- и С-терминальным фрагментам пресенелинов, но не белкам полной длины. В пресенелиновом комплексе высокого молекулярного веса активность γ-secretase принадлежит большому мульти-субъединичному протеазному комплексу, сходному с протеосомой. Хотелось бы заявить, что такой 'secretosome'/'secretasome' комплекс мог бы содержать компоненты, которые предопределяют специфичность γ-secretase расщепления как в βAPP или Notch, напр. Фактически идентифицирован типа I трансмембранный белок, названный , как компонент пресенелинового комплекса, который, по-видимому, модулирует активность γ-secretase. Nicastrin связывается с βAPP CTFs и presenilins, и может регулировать доступ или позиционирование γ-secretase к субстрату. FAD-ассоциированные мутации пресенлина нарушают взаимодействие nicastrin с βAPP CTFs. Возможно, что FAD мутации нарушают не только на активный сайт пресенлина, но и nicastrin/βAPP CTF взаимодействие и последующее γ-secretase cut. Супрессия экспрессии nicastrin блокирует также Notch signalling у C. elegans.
A new active-site motif within presenilins? Если пресенелины на самом деле идентичны с γ-secretase activity, то почему они не имеют общих гомологичных последовательностей с типичными aspartyl протеазами? Вообще то они беспрецендентные протеазы - благодаря своему внутримембранному расщеплению — следовательно, уникальны. Однако есть доказательства, что пресенелины м. использовать протеазный активный сайт, сходный с протеазами некоторых бактерий.
Мутация, ассоциированная с FAD, локализована непосредвенно рядом с критическим aspartate 385 , G384A, вызывает шестикратное усиление продукции Aβ42. (The PS1 Δexon9 мутация, имевшая самый сильный эффект увеличивала продукцию Aβ42 лишь втрое. Итак, аминокислота 384 чрезвычайно важна для функции PS1.
Эффект аминокислотной замены в положении 384, следовательно, фундаментально отличается от замены в соседнем критическом aspartate. Тогда как все мутации в положении 385 iингибируют функцию пресенелинов по генерации Aβ and Notch endoproteolysis/signalling, то мутации остатка 384 м. или заметно усилить патологические эффекты пресенелинов или понизить их биологическую активность Glycine 384 законсервирован у всех других членов семейства пресенелинов, включая и удаленных, таких как у C. elegans (Fig. 6 ). Выявлен высоко законсервированный мотив вокруг aspartate 385 .