Достаточность лишь TER и TERT для базальной теломеразной активности in vitro ставит вопрос, может ли эктопическая экспрессия теломеразной активности обеспечиваться эктопической экспрессией экзогенно добавленных генов для этих субъединиц. Хотя TER экспрессируется в большинстве типов тканей ее уровень экспрессии не коррелирует с уровнем экстрагируемой ферментативной активности [19] [20] [21]. С другой стороны, уровень экспрессии hTERT в некотрых тканях человека часто коррелирует с уровнем измеренной in-vitro теломеразной активностью и пролиферативным потенциалом ткани [22] [23] [24], указывая тем самым, что hTERT ограничивает in vivo формирование активного теломеразного комплекса. Показано, что конституитивной эктопической экспрессии hTERT достаточно для индукцмм теломеразной активности в клетках, в которых она не обнаруживалась [25••] [26] [27••] [28••] [29••] [30••].

Эктопическая экспрессия hTERT в первичных культурах как в pre-senescent эпителиальных клетках (RPE-340) так и в pre-senescent фибробластах(BJ foreskin) была достаточна для индукции теломеразной актинвости и позволяла расти клеткам и за пределом нормальной репликативной способности, характерным для этих клеток (Fig. 2) [25••] [28••]. Более того, эти иммортализованные линии клеток не обнаруживали признаков хромосомных аномалий, типичных для post-senescent survivors [31••] [32••]. Вскоре было установлено, однако, что hTERT не достаточно для увеличения продолжительности жизни всех нормальных типов клеток. В одном исследовании [26] TERT экспрессия оказалась неспособной удлиннять жизнь легочных фибробластов человека (IMR90) — отметим, однако, что использованная hTERT конструкция содержала С-терминальный HA эпитопный тэг (epitope tag), см. ниже — однако продолжительность жизни клеток увеличивалась при экспрессии c-Myc который индуцировал эндогенную (преимущественно дикого типа) теломеразную активность. Было предположено, что необходимо второе трансформирующее событие (c-Myc expression) для теломеразы, чтобы увеличить продолжительность жизни этих клеток [26]. Эктопической экспрессии hTERT оказалось недостаточно и для увеличение периода жизни нетрансформированных молочных эпителиальных клеток человека (HMECs), содержащих, по-видимому, нормальный pRb/p16 путь ( pre-M1 [M0], HMECs), она оказалась неспособной иммортализовать и нормальные кератиноциты [29••]. Однако, ко-экспрессии вирусного HPV E7 белка, который инактивирует pRb, вместе с hTERT было достаточно для иммортализации как HMEC клеток, так и кератиноцитов. Факт, что большинство комерчески доступных HMECs являются post M0 может объяснить, почему в предыдущих исследованиях [26], один hTERT иммортализовал эти эпителиальные клетки [29••].

Рис. 2 Клетки, иммортализованные экзогенной TERT экспрессией, обладают клеточной специфичностью. Суммированы результаты ряда лабораторий, в которых hTERT эктопически экспрессировался в разных линиях клеток. Знак плюс указывает, что клетки были иммортализованы, а знак минус - не иммортализованы с помощью TERT. hTERT-HA содержит HA эпитоповый тэг на С-конце. Теститированные линии: BJ и HFF (human foreskin fibroblasts), IMR90 (lung fibroblasts), RPE-340 (retinal pigmented epithelial cells), HMEC (human mammary epithelial cells), HFK (human foreskin keratinocytes), and HEK (human embryonic kidney cells).

Figure 2 Cells immortalized by exogenous TERT expression exhibit cell-type specificity. This figure is a summary of the results from a number of laboratories in which hTERT was ectopically expressed in various cell lines. A plus sign indicates that cells were immortalized and a minus sign indicates cells not immortalized by TERT. hTERT-HA contains an HA epitope tag at the carboxyl terminus. Cell lines and types tested are BJ and HFF (human foreskin fibroblasts), IMR90 (lung fibroblasts), RPE-340 (retinal pigmented epithelial cells), HMEC (human mammary epithelial cells), HFK (human foreskin keratinocytes), and HEK (human embryonic kidney cells).

Telomerase activity in vitro versus telomere maintenance in vivo

У дрожжей TER и TERT недостаточны для поддержания теломер или способности клеток к репликации in vivo. EST1, EST3, и EST4/CDC13 генные продукты дрожжей, хотя и не нужны для ферментативной активности теломеразы in vitro, являются существенными для поддержания теломер in vivo [14] [15] [33] [34]. В клетках человека конструкция hTERT , содержащая СМ-терминальный HA epitope tag поддерживает in vitro ферментативную активность и иммортализует HMEC клетки (which may have been post M0), однако неспособна поддерживать теломеры или преодолевать кризис в человечьих легочных (IMR90) и foreskin фибробластах, и в эмбриональных клетках человека (Fig. 2) [26] [27••] [30••]. Итак, в клетках дрожжей и человека каталитически активная теломераза недостаточна для поддержания теломер in vivo. Остается возможность, что HA tag в hTERT субъединице вовлечен во взаимодействие между TERT и предполагаемым человечьим гомологом EST1, EST3, или EST4/CDC13.

Поддержание теломер in vivo нуждается в продуктивном взаимодействии теломеразы с теломерным ДНК–белковым комплексом.

Telomere length and cell division capacity – how short is too short?

Когда нормальные клетки растущие в культуре перестают делиться они в общем все еще содержат достаточное количество теломерной ДНК, следовательно, укорочение теломеры per se недостаточно для вызывания старения клетки. Клетки человека в культуре с репликативным периодом жизни увеличенном с помощью онкогеной трансформации продолжают укорочение теломер до тех пор пока не достигнут кризиса (Fig. 1) [46] [47] [48]. Нокаут гена TER мыши ведет к слиянию хромосом конец-в-конец, указывающему на compromised теломерную функцию, эти соединения часто содержат значительные количества теломерных повторов [49]. Тест способности теломеразы удлиннять продолжительность жизни post M1, SV40 T-Ag-трансформированных клеток, пролил новый свет на кажущийся парадокс. Эктопическая экспрессия hTERT в T-Ag-трансформированных HEK клетках удлинняет жизнь за пределы кризиса с соответствующим заметным удлиннением теломер [27••] [30••]. Экспресия hTERT (но не каталитически неактивного или carboxy-terminally HA-tagged hTERT) в T-Ag трансформированных фибробласах легких и кожи человека также удлинняет период жизни, несмотря на значительное укорочение теломер, которое продолжается десятки клеточных делений за пределами ожидаемого кризиса [30••]. Сравнительно высокий уровень теломеразной активности индуцирован в обоих исследованиях. Таким образом, удлиннение теломер per se необязательно для теломеразой-опосредованного удлиннения продолжительности жизни. Параллельно у S. cerevisiae, присутствие теломеразы с мутантной, хотя и функциональной, TLC1 РНК субъединицей стабилизирует теломеры на значительно более коротком уровне, чем у старых клеток, экспрессирующих стабильный, но энзиматически неактивный, теломеразный комплекс [50]. Таким образом, присутствие энзиматически активной теломеразы стабилизирует теломеры, которые могут стать критически короткими в ее отсутствие (Fig. 3).

Рис. 3 Модель стабилизации теломер теломеразой. Теломеры, которые которые оказываются ниже критической длины являются функционально comprimised, субъектом слияний конец-в-конец и нуклеолитической деградации (две теломеры внизу с левой стороны). Такие теломеры могут быть стабилизированы с помощью экспрессии экзогенной теломеразы (правая сторона). Такая стабилизация часта, но не обязательно сопровождается удлиннением теломер. В некоторых случаях, присутствия теломеразы достаточно для стабилизации теломер независимо от удлиннения теломер

Figure 3 Model for telomere stabilization by telomerase. Telomeres that fall below a critical length are functionally comprimised, subject to end-to-end fusions and nucleolytic degradation (bottom two telomeres on the left side). Such telomeres can be stabilized by exogenous telomerase expression (right side). Such stabilization is often, but not necessarily, accompanied by telomere lengthening. In some cases, the presence of telomerase is sufficient to stabilize telomeres independent of telomere lengthening.

Quality of life without telomerase

Продолжительность жизни некоторых типов клеток может быть удлиннена с помощью экспресии hTERT, нокаутные мыши с отсутствием существенной РНК субъединицы теломеразы жизнеспособны и фертильны в течение более 6 поколонеий [51]. Последовательные возвратные скрещивания этих теломераза-дефицитных мышей выявляют постоянное снижение фертильности [52]. В то же самое время в соматических клетках увеличивается митотическая нестабильность, что видно по увеличению анеуплоидии и слияниям конец-в-конец хромосом [49] [52]. Эмбриональные стволовые клетки мыши с отсутствием mTER и поддерживаемые в культуре обнаруживают повышенные уровни слияний теломер и снижение репликативного периода жизни в культуре [53]. Наконец, поздние генерации mTER нокаутных мышей часто погибают in utero, у них часто отсутствует закрытие нервной трубки [54•]. Эти нарушения коррелируют с более короткой длиной теломер, чем у нормально развивающихся сиблингов ([54•]; M Blasco, personal communication).

Рис. 4 Клетки с финальным репликативным потенциалом могут быть иммортализованы несколькими методами. В некоторых типах клеток инактивация pRb/p16 и p53, скомбинированная с поддержанием теломер, может вести к иммортализации клеток с анеуплоидией и потерей контроля роста, типичными для онкогено трансформированных клеток (in orange), тогда как экзогенная экспрессия только теломеразы может увеличивать репликативный потенциал без онкогенной трансформации (in green). Возможно, однако, что еще неидентифицированные факторы могут вовлекать в онкогенную трансформацию теломеразой-иммортализованые клетки.

Figure 4 Cells with a finite replicative potential can be immortalized by several methods. In some cell types, inactivation of pRb/p16 and p53, combined with telomere maintenance, can lead to cellular immortalization accompanied by aneuploidy and the loss of growth inhibition typical of oncogenically transformed cells (in orange), whereas exogenous expression of telomerase alone can extend replicative potential apparently without causing oncogenic transformation (in green). It is possible, however, that as yet unidentified factors may later facilitate the oncogenic transformation of telomerase-immortalized cells.

Cancer and telomerase

TER нокаутные мыши, по крайней мере вначале, не более резистентны к определенным типам опухолей, чем мыши дикого типа [51]. Альтернативный (телдомераза-независимый) путь поддержания теломер, названный ALT, обнаружен в клетках человека. ALT ,по-видимому, активен примерно в ~10% опухолей человека с отсутствием обнаружимой теломеразной активности [55]. Этот второй путь поддержания теломер, по-видимому, сходен с RAD52-зависимым путем, обнаруженным ранее у почкующихся дрожжей — путем, который поддерживает теломеры с помощью неравной гомологичной рекомбинации [38] [56].

Однако большинство опухолей человека содержит повышенный уровень теломеразы. Это используется в клиниках для ранней диагностики опухолей. Анализ мочи для диагностики опухолей мочевого пузыря [57•]. Однако активность теломеразы может и не служить индикатором ранних стадий рака шейки [58] [59].

What price immortality?

Недавние исследования показали, что теломераза способна иммортализовать некоторые типы клеток Fig. 4, такая иммортализация не сопровождается онкогенной трансформацией [31••] [32••]. Более того , геномная нестабильность является общей для канцерогенных клеток, так усиленная экспрессия теломеразы SV40-трансформированными фибробластами человека снижает появление дицентрических хромосом и гиперплоидии [30••], и таким образом защищает против, по крайней мере, одной причины геномной нестабильности. Теломеразой-обусловленная иммортализация клеток может таким образом служить терапевтическим средством в культуре растущих тканей человека.

Однако обратная сторона медали то, что эктопическая экспрессия теломеразы позволяет пре-неопластическим, частично трансформированным фибробластам, HMEC, и клеткам эмбриональных почек человека пролиферировать [27••] [30••]. В этом контексте экспрессия теломеразы обладает канцер-способствующими свойствами. Подсчитано, что после трансплантации костного мозга укорочение теломер может вызывать у донорских клеток старение на 15 лет [60]. С одной стороны такое "старение" устраняется эктопической экспрессией теломеразы (Dr Jekyll) в трансплантируемой ткани? С другой стороны, не будет ли экспрессия теломеразы (Mr Hyde) затем увеличивать вероятноть того, что трансплантированная ткань сама станет чувствительной к онкогенной трансформации ?

Conclusions

Недавние исследования выявили Jekyll и Hyde природу теломеразы. Данные сумированные здесь показывают, что эктопическая экспрессия теломеразы может иммортализовать клетки без индукции геномной нестабильности, характерной для опухолевых состояний, и что эффекты эктопической экспрессии теломеразы являются клеточно-специфическими. Однако мы должны помнить о словах Robert Louis Stevenson's Dr Jekyll, ''I hesitated long before I put this theory to the test of practice. I knew well that I risked death; for any drug that so potently controlled and shook the very fortress of identity, might, by the least scruple of an overdose ... utterly blot out that immaterial tabernacle which I looked to it to change. But the temptation of a discovery so singular and profound at last overcame the suggestions of alarm'' [61].

ТЕЛОМЕРАЗА