В ответ на действие хемоаттрактантов клетки используют протеиназы, чтобы разорвать мешающие крепления и анатомические барьеры и освободить путь. Чтобы двигаться клетка д. модифицировать свою форму — они сильно реорганизуют свой внутриклеточный скелет, постоянно устанавливают и теряют контакты с др. клетками и окружающим матриксом. Многие белки используются для миграции клеток, включая хемоаттрактанты и их рецепторы, молекулы клеточной адгезии, протеиназы, регуляторы цитосклета и некоторые сигнальные энзимы. Когда рецептор urokinase (uPAR) впервые был клонирован в 1985, то полагали, что путем связывания urokinase-type plasminogen activator (uPA), который более известен как urokinase, он просто превращает ZYMOGEN plasminogen в серин протеиназу plasmin на ведущем крае клетки, облегчая тем самым миграцию клетки за счет своейц способности переваривать внеклеточные молекулы. Однако, став частью функциональных единиц с др. молекулами (это и vitronectin, члены сверхсемейства молекул адгезивных рецепторов, caveolin и G-protein-coupled receptor (GPCR)), uPAR оркестрирует инициацию некоторых внутриклеточных путей сигнальной трансдукции, которые используют цитозольные и трансмембранные киназы, компоненты цитоскелета и др. (Вох 1).

Structure and regulation of uPA–uPAR

Urokinase продуцируется в качестве неактивного одноцепочечного белка (известного как pro-uPA или sc-uPA), который активируется в двухцепочечную uPA за счет одного протеолитического события. Общая топология складкообразования uPA и pro-uPA молекул м.б. подразделена на три функционально независимые области: N-терминальный growth factor домен, kringle домен и С-терминальный каталитический домен (известный как низкомолекулярная uPA). Первые два домена представляют amino-terminal fragment (ATF) (Рис. 1). Модуль, связывающий рецептор, располагается в epidermal growth factor (EGF)-подобном домене в остатках 21–32 (Рис. 1). uPAR является трехдоменовым (D1, D2 и D3) glycosyl phosphatidylinositol (GPI)-anchored белком с высоким сродством к uPA, pro-uPA и ATF. Интактный uPAR связывает uPA с высоким сродством (1 nM), тогда как изолированный D1 фрагмент связывает uPA примерно с 1,500-раз меньшим сродством. Сайт, связывающий лиганд, в uPAR состоит из остатков, которые находятся в разных структурных доменах. В интактном uPAR тесная пространственная близость между доменами uPAR D1 и D3 м.б. необходима для сборки этого составного сайта связывания. uPAR м. также связывать сывороточный и extracellular-matrix (ECM) белок vitronectin, который является лигандом α_vβ₃ integrin — взаимодействие, которое нуждается в uPA. Помимо формы, закрепленной на мембране, uPAR м. высвобождаться из плазматической мембраны путем отщепления GPI ANCHOR и м. обнаруживаться (или продуцироваться с помощью рекомбинантной ДНК технологии) как растворимая молекула (suPAR) (Рис. 1). In vitro и in vivo и uPAR и suPAR м. расщепляться по области, которая связывает домены D1 и D2 (аминокислоты 82–95), чтобы дать D1 фрагмент и D2D3 фрагмент. D2D3 фрагмент обладает направленной хемотактической активностью, как и uPA.

uPA и его гомолог tissue-type plasminogen activator (tPA) превращает plasminogen в plasmin, сериновую протеазу, которая разлагает фибрин и др. компоненты ECM. tPA участвует в растворении богатого фибрином кровяного сгустка и используется для терапевтического THROMBOLYSIS. Вместо этого, uPA, хотя он и избыточен для нормального развития играет важную роль в ремоделировании тканей при разных нарушениях. В клеточной культуре, связывание pro-uPA с uPAR облегчает его активацию до uPA и , следовательно, генерацию плазмина, который при этом фокусируется на внеклеточном протеолизе на поверхности клеток (Рис. 2). Важным регулятором uPA–uPAR системы является plasminogen activator-inhibitor 1 (PAI1), главный ингибитор SERPIN FAMILY. Кроме того, активность плазмина регулируется с помощью ингибитора, который известен как α-antiplasmin. Однако, этот ингибитор действует только тогда, когда plasmin в растворе. Важным свойством PAI1 является его способность индуцировать интернализацию и деградацию связанного с uPAR uPA. Весь процесс нуждается в low-density lipoprotein (LDL)-receptor-related protein (LRP), который м. взаимодействовать и с PAI1 и с uPAR. Интернализованный uPAR м. затем возвращаться обратно на клеточную поверхность.

uPAR: a surface signalling receptor

Установлено, что uPAR не только функционирует как протеиназный рецептор, но влияет также на миграцию, алдгезию, дифференцировку и пролиферацию путем передачи внутриклеточных сигналов. Его молекулярные свойства и структура (Рис. 1) в основном ответственны за исполнение этой разносторонней роли. Активный молекулярный комплекс, по-видимому, является тримерным uPA–uPAR₂ комплексом. Некоторые из сигнальных функций uPA не нуждаются в ее протеолитической активности, т.к. химическое блокирование uPA или каталитически неактивные производные uPA (такие как pro-uPA и ATF) полностью неэффективны. Напротив, экспрессия uPAR и его способность связывать uPA необходимы для передачи сигналов. Но как uPAR соединяется с внутриклеточной сигнальной кухней (machinery), если у него отсутствует цитозольный домен (Рис. 1)? По крайней мере, известны три типа трансмембранных белков, которые выступают как медиаторы uPAR и участвуют в передаче сигналов в ответ на действие uPA: интегрины, GPCRs и caveolin, хотя этот список м.б. неполным (Рис. 3, 4). И как результат uPAR активирует внутриклеточные сигнальные молекулы такие как tyrosine- и serine-protein киназы (типа EGF рецептора, lymphocyte protein tyrosine kinase (Lck), haematopoietic cell kinase (Hck), Src, focal adhesion kinase (FAK) и extracellular-signal-regulated kinase (ERK)/mitogen-activated protein kinase (MAPK)).

The integrin connection.

Интегрины являются рецепторами клеточной поверхности, которые прикрепляют клетку к ECM и передают сигналы между внеклеточной средой и внутренностью клетки — это и дало им название 'integrin'. Интегрины влияют на форму клетки и передачу внутриклеточных сигналов за счет взаимодействия с молекулами, которые регулируют организацию цитоскелета и передачу сигналов. Интегрины участвуют и в клеточной миграции, которая индуцируется с помощью uPA–uPAR (Рис. 3). Лигандом активированный uPAR влияет на зависимую от интегринов клеточную адгезию, миграцию и пролиферацию, т.к. эти функции блокируются не только с помощью антител против интегринов, но и с помощью anti-uPAR антител. uPA-зависимая миграция многочисленных типов клеток in vitro блокируется с помощью anti-uPAR, а также с помощью anti-integrin антител. In vivo, transperitoneal миграция нейтрофилов к месту воспаления снижается в отсутствие uPAR, но остаточная миграция не затрагивается далее с помощью антител против соотв. интегринов, это указывает на то, что uPAR–integrin взаимодействия необходимы для индукции соответствюущих сигнальных путей.

Прямые взаимодействия uPAR с интегринами доказаны. Синтетические пептиды и исследования домен-swapping показали, что эти области и в самом деле участвуют в связывании uPAR. Хотя uPAR м. взаимодействовать со многими интегринами, он все же имеет, по-видимому, наивысшее сродство bona fide с фибронектиновыми рецепторами α₃β₁ и α₅β₁. Др. интегрины, которые взаимодействуют с uPAR, включают macrophage 1 antigen (Mac1, известный также как CD11b/CD18 или CR3), leukocyte α_Mβ₂-интегриновый рецептор, который связывает фибриноген и α_vβ₅, и α_vβ₃ интегрины, которые связывают витронектин. В большинстве случаев, эти взаимодействия используют uPAR и интегрин из одной и той же мембраны. Однако, в одном сообщении говорится, что это взаимодействие м. также индлуцировать и меэкелеточные ассоциации. Пептиды, которые блдокируют uPAR–integrin взаимодействия м.б. инструментом для демонстрации функционального значения этих взаимодействий. Напр., uPAR-зависимя адгезия и распространение клеток, экспрессирующих α₃β₁, на фибронектине также как и uPAR–α₃β₁ ко-иммунопреципитация, предупреждаются uPAR-связыванием с 25-mer α₃-пептидом. Ассоциация uPAR с α-субъединицей интегрина затрагивает функцию гетеродимерного αβ-integrin. Итак, α-субъединица м. рассматриваться как cis лиганд для uPAR в функциях, которые используют и относящуюся к делу β-субъединицу. Тот же самый пептид ингибирует также uPA–uPAR-зависимую активацию внутриклеточной tyrosine kinase FAK, а также ко-иммунопреципитацию uPAR с G_iα (GTP-связывающий белок), Src и интегринами. Взаимодействие integrin–uPAR регулирует не только клеточную адгезию, но и также EGF-receptor-зависимую пролиферацию линий опухолевых клеток in vivo, за счет активации FAK и ERK/MAPK и подавления p38 MAPK. Точные места связывания между α-интегринами и uPAR пока неизвестны. Взаимодействие м. нуждаться в интактном uPAR, т.к. расщепление uPAR между D1 и D2 доменами предупреждает ко-иммунопреципитацию uPAR и интегринов.

G-protein-coupled receptors come to the stage.

Важным свойством клеточной миграции является ее направленность. Клетки мигрируют в определенном направлении, т.к. они имеют поверхностные рецепторы, которые 'ощущают' присутствие градиента хемоаттрактантов, таких как хемокины chemokines. Градиенты uPA, pro-uPA и ATF также являются хемотактическими для разных клеток, которые экспрессируют uPAR. С помощью демаскирования хемотактического эпитопа, который расположен между доменами D1 и D2, uPA активирует uPAR. Этот эпитоп демаскируется также in vitro за счет расщепления suPAR. Это генерирует активный D2D3 фрагмент, который часто используется для воспроизведения uPA-индуцированного хемотаксиса. Синтетический пептид Ser-Arg-Ser-Arg-Tyr является минимальной хемотактической последовательностью uPAR (аминокислотные остатки 88–92), которая необходима для индукции тех же самых изменений цитоскелета и передачи внутриклеточных сигналов что и uPA. Вовлечение трансмембранного адаптора в хемотактический ответ uPAR показано с обнаружением, что D2D3 домен suPAR индуцирует хемотаксис в uPAR-дефицитных клетках, обходя при этом необходимость uPA связывать uPAR. Обнаружение, что хемотаксис в ответ на uPA или фрагмент D2D3 блокируется с помощью PERTUSSIS TOXIN указывает на то, что трансмембранным адаптором является GPCR (Рис. 4). По крайней мере один GPCR — FPRL1 (гомолог fMLP рецептора, FPR (formyl peptide receptor, известнвй также как lipoxin A4 receptor, LXA4R)) — как было показано, трансдуцирует хемотактическую активность uPA–uPAR. Клетки, не обнаруживающие FPRL1 или uPAR не отвечают на uPA или D2D3; однако, трансфекция FPRL1 в uPAR-дефицитные клетки восстанавливает их чувствительрность к D2D3, но не к uPA, для которой необходимы и uPAR и FPRL1. Более того, хемотактическая реакция клеток, которые экспрессируют и FPRL1 и uPAR на uPA или D2D3 блокируется с помощью специфических антител к FPRL1. Более того, FPRL1 лиганды и uPA (или D2D3) перекрестно десенсибилизируют др. др., это является др. характерным свойством GPCRs. Наконец, D2D3 связывается непосредственно с FPRL1 и это связывание ингибируется лигандами FPRL1. В целом эти результаты показывают, что связывание uPA с uPAR in vivo м. демаскировать последовательности uPAR, которые затем взаимодействуют с FPRL1 и индуцируют передачу сигналов и хемотаксис. Интересно, что в отличие от др. хемокиновых рецепторов, FPRL1 обладает довльно широким паттерном экспрессии.

Interaction of uPAR with caveolin and lipid rafts.

Платформы (rafts) и кавеолы являются небольшими внутриклеточными телами, которые обогащены холестеролом, гликосфинголипидами, ганглиозидами и GPI-закрепленными молекулами, такими как uPAR. Кроме того, др. белки, такие как интегрины, тирозин киназы и GPCRs присутствуют в этих липидных платформах. Один из таких белков, caveolin, м. ко-иммунопреципитироваться с uPAR с помощью anti-integrin антител и, по-видимому, необходим для взаимодействия uPAR–integrin. Этот комплекс разрушается с помощью uPAR-связывающего интегринового пептида, а также с помощью кавеолинового пептида или с помощью подавления кавеолина. По крайней мере, два типа платформ м. сегрегировать др. от др. после того, как клетки активируются определенными стимулами. В покоящихся T лимфоцитах uPAR колокализуется с гомогенно распределенными ганглиозидами GM1 и GM3, но стимуляция хемокинами, такими как stromal-derived factor 1α (SDF1-α) заставляет uPAR сегрегировать вместе с GM3 в LAMELLIPODIA на ведущем крае клетки — подальше от GM1-обогащенных платформ. Обязательная клеточная реакция на связывание uPA с uPAR зависит от природы взаимодействующих медиаторов. Так, субклеточная локализация uPAR (на ведущем крае в противоположность более случайному распределению в плазматической мембране) или в его мембранной среде (GM1- против GM3-обогащенных платформ или в платформах в противоположность non-rafts) д. существенно предопределять молекулярного партнера, с которым этот малый мембранный белок будет взаимодействовать, а , следовательно, и вызываемый этим тип передачи сигналов (выбор между миграцией и пролиферацией). Напр., присутствие uPAR в липидных платформах строго благоприятсвует его димеризации и связыванию с витронектином, позволяя тем самым клетке слипаться с субстратом для витронектина.

Other transmembrane mediators.

Др. трансмембранные медиаторы, как полагают, также взаимодействуют с uPAR,хотя их роль менее определена. В частности, gp130 активируется на uPAR кластере и в свою очередь активирует путь Janus kinase (JAK)–signal transducer and activator of transcription (STAT). LRP является еще одним трансмембранным адаптором, который регулирует клеточную мигрнацию и uPA-зависимую передачу сигналов через PAI1-зависимую интернализацию uPAR. Др. uPAR-связывающий белок это рецептор mannose-6-phosphate/insulin-like growth factor II, который соединяется с D2D3 фрагментом uPAR и направляет его в лизосомы для деградации и urokinase-receptor-associated protein (uPARAP), рецептор для collagen, который также м. участвовать в интернализации uPAR.

Effect of uPAR on transmembrane mediators

Эксплуатирует uPAR только своих трансмембранных партнеров для индукции передачи сигналов или наоборот соеднинение uPAR со своими трансмембранными медиаторами также затрагивает и их функцию? В клетках human epidermoid carcinoma (HEp3) и breast carcinoma (MDA231) уровни uPAR влияют на клеточную адгезию и миграцию качественно и подавляют способность интегринов связывать фибронектин. Активация (по крайней мере) FPRL1 путем связывания uPA с uPAR десенсибилизирует этот рецептор к др. лигандам. Рецепторы для др. хемокинов подобно MCP1 (monocyte chemotactic protein 1) и RANTES (regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted) также десенсибилизируются при соединении uPA с uPAR. На этой основе, uPAR фрагменты, которые присутствуют в тканях или жидкостях тела м. обнаруживать FPRL1 и индуцировать как негативные, так и позитивные эффеты на миграцию др. клеток путем прямой индукции или с помощью десенсибилизации, соотв.

Signalling pathways induced by uPAR

Соединение uPA с uPAR, локализованными на клеточной поверхности, ведет к активации передачи сигналов клетками.

Cytosolic kinase pathways.

Общей находкой в передаче сигналов uPA, что ведут к хемотаксису, является активация внутриклетоных тирозин киназ (Src, Hck, FAK, Gardner–Rasheed feline sarcoma viral oncogene homologue (Fgr)) и серин/треониновых киназ, таких как ERK/MAPK. Ненкоторые из этих киназ м. ко-иммунопреципитироваться с uPAR. uPA вызывает также мембранную транслокацию Raf, Src и FAK и из RHO FAMILY GTPASE Rac и и ядерную локализацию ERK/MAPK 1/2. Функциональное значение этих взаимодействий вытекает из использования специфических ингибиторов или клеток, которые дефицитны по данной киназе. Напр., uPA не м. стимулировать перестройки цитоскелета и миграцию в Src-дефицитных фибробластах или в присутствии ингибиоров MAPK и ERK киназ (MEK). Пептиды, которые блокируют uPAR–integrin взаимодействие, и MEK ингибиторы также ингибируют α₅β₁-зависимую активацию ERK/MAPK 1/2 в клетках HEp3. Экспериментальные доказательства показывают, что активация Ras, Raf, myosin light-chain kinase (MLCK), protein kinase C (PKC) и phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) необходима для индукции пролиферации, изменений цитоскелета и миграции. GPCR является существенным, т.к. uPA-индуцируемая перестройка цитоскелета и Hck и ERK/MAPK 1/2 активация блокируются pertussis токсином. Итак, вновь открытый медиатор FPRL1 возможно действует выше в сигнальных путях.

The FAK pathway and cytoskeletal reorganization.

Клетки, которые прилипают к белкам ECM, формируют фокальные контакты с ECM. Они представлены интегринами, их лигандами и внутриклеточными интегрин-связанными белками, такими как vinculin и FAK. uPA связанный с uPAR также присутствует в фокальных контактах, т.к. они оказываются поверх клеточной поверхности в их отсутствие. Локализация uPAR в фокальных контактах, по-видиому. обусловлена uPA-зависимым uPAR–integrin взаимодействием. Обработка клеток uPA вызывает uPAR- и integrin-зависимые изменения формы клеток и реорганизацию цитосклета с ruffling мембран, образованием актиновых колец, lamellipodia и UROPODIA, и локализацией интегринов, uPAR и Src на ламеллиподиях. Более того, uPA связывающая активность Rho семейства GTPases, в частности Rac, необходима для увеличения подвижности клеток и цитоскелетных изменений.

Intracellular calcium mobilization.

Хемокины часто индуцируют мобилизацию внутриклеточного кальция (Ca²⁺_i). При добавлении к monocyte-подобным клеткам физиологичеких концентраций uPA не происходит увеличения Ca²⁺_i,тогда как более высокие концентрации uPA или антителами индуцированное поперечное связывание uPAR индуцирует uPA-зависимый гидролиз phosphoinositide и мобилизацию Ca²⁺_i. Интересно, что высвобождение Ca²⁺_i м. не зависеть только от интегринов, но м.б. связано с прямым взаимодействием uPAR с L-selectin (CD62L), адгезивным белком, который участвует в инициальных стадиях LEUKOCYTE ROLLING на эндотелиальных клетках. Практически все хемокиновые рецепторы индуцируют мобилизацию Ca²⁺_i из внутриклеточных хранилищ и FPRL1 не является исключением. uPA и uPAR являются, однако, разными, т.к., образование кластеров uPAR м. происходить до того как uPA сможет индуцировать мбилизацию Ca²⁺_i.

Other molecules that interact with uPAR.

Некоторые и др. сигнальные молекулы ко-иммунопреципитируются с uPAR, включая киназы Src семейства, JAK–STAT, vinculin, α-actinin, actin и PKC. В сосудистых гладкомышечных клетках человека uPA стимулирует активность Src-homologous kinase, tyrosine kinase 2 (Tyk2), которая в свою очередь активирует PI3K и миграцию клеток. В этой системе присутствие DOMINANT-NEGATIVE Tyk2, или ингибиторов PI3K, ингибирует стимуляцию с помощью uPA.

uPAR and cell adhesion

Помимо регуляции клеточной миграции uPAR регулирует также клеточную слипчивость. Присутствие uPAR позволяет клеткам слипаться и распластываться по матричному белку vitronectin. Чтобы распластываться клетки должны соединиться с матричным белком и активировть интегрин-зависимые сигнальные пути, которые ведут к реорганизации цитоскелета и изменению формы клетки. uPAR затрагивает обе ступени: во-первых, uPAR-экспрессирующие клетки м. связывать витронектин даже если они дефектны по передачие интегриновых сигналов, но они не м. распластываться (spread); во вторых, присутствие uPAR способствет распластыванию и адгезии на витронектине. Ассоциация uPAR с витронектином и клеточная слипчивость м. в свою очередь регулироваться с помощью внеклеточно локализованной casein kinase 2 (CK2), которая специфически фосфорилирует витронектин (Рис. 3). Непосредственной функцией uPAR, следовательно, является обеспечение инициального связывания клеток с матричным субстратом, в частности с витронектином. Для следующей ступени — передачи сигналов — uPAR-регулируемые интегрины необходимы.

uPAR and differentiation

uPAR также важен для дифференцировки клеток, такой как дифференцировка моноцитов в макрофаги. После воздействия PHORBOL ESTERS на HL60 или U937 миэлоидные предшественники, которые растут в суспензии, дифференцируются в слипчивые макрофаги и усиливают экспрессию uPAR. Соединение uPAR с витронектином являются существенным для адгезии и последующей дифференцировки, т.к. оба процесса предупреждаются PAI1 и стимулируются с помощью uPA. Будучи дифференцированными макрофаги также экспрессируют повышенный уровни Mac1/α_Mβ₂ интегрина. Более того, нехватка uPAR нарушает некоторые Mac1-зависимые функции макрофагов, включая клеточную адгезию с фибриногеном и интернализацию и последующую деградацию фибриногена. Эффекты uPAR на дифференцировку не ограничиваются миэлоидными клетками, т.к. от nerve growth factor (NGF)-зависимая дифференцировка differentiation of PC12 PHEOCHROMOCYTOMA CELLS также является uPAR- и integrin-зависимой.

uPAR and cell proliferation

Обнаружение, что uPAR часто обнаруживает избыточную экспрессию в опухолях людей и что его уровень экспрессии является строгим показателем злокачественности, ставит вопрос, может ли uPAR участвовать в клеточном росте. Некоторые исследования, в самом деле, dвыявили uPAR-зависимую роль uPA в пролиферации клеток in vitro. Прямая проверка роли uPAR в туморогенности осуществлялась с помощью Hep3 клеток, которые избыточно экспрессируют uPAR и формируют опухоли в CHORIOALLANTOIC MEMBRANE эмбрионов кур. нижение экспрессии на клеточной поверхности uPAR форсирует злокачественность клеток в затяжное состояние заторможенности. uPAR-зависимый опухолевый рост использует передачу сигналов и интегрина и ERK/MAPK, т.к. высокие уровни uPAR активируют путь ERK/MAPK 1/2 и супрессируют рост-ингибирующую p38 MAPK. Эти эффекты зависят от прямого взаимодействия uPAR с α₅β₁-интегрином, который в присутствии высоких концентраций uPAR, вызывает конституитивную активацию FAK и EGF рецепторов. Т.к. uPA способен стимулировать рост сосудистых гладкомышечных клеток в отсутствие uPAR in vivo, то значение uPAR в клеточном росте в определенных процессах in vivo все еще является предметом активных исследований.

Surface uPAR levels and the cellular response

Уровни экспрессии uPAR на поверхности детерминируют внутриклеточные сигналы и безусловно клеточную реакцию. Напр., в недифференцированных U937 или THP1 клетках миэлоидных предшественников, которые экспрессируют низкие уровни uPAR, uPA стимулирует клеточную миграцию и активирует Hck. Напротив, если эти клетки дифференцированы в макрофаги, то они экспрессируют повышенные количества uPAR на клеточной поверхности, которые индуцируют адгезию и распластывание с помощью пути, который связан с ингибированием Hck и Fgr. Итак, количество uPAR предопределяет будет ли uPA задейстован или в адгезивном или миграторном ответе. Уровень экспрессии uPAR на клеточной поверхности м. также вносить свой вклед в туморогенность и инвазивность опухолей. Напр., высоко инвазивные клетки HEp3 экспрессируют высокие уровни uPAR и их потенциал роста связан с повышенной integrin-зависимой активацией ERK/MAPK 1/2и ингибированием p38 MAPK. Подавление uPAR в этих клетках снижает активность интегрина до концентрации, которая ниже предела, необходимого для роста и туморогенности, это указывает на то, что концентрация uPAR предопределяет баланс активностей между ERK/MAPK 1/2 (которая способствует клеточному росту) и p38 MAPK (которая супрессирует рост).

Lessons from gene-targeting studies in mice

Генетические исследования на мышах и людях позволили установить роль и значение uPAR, его лигандов и взаимодействующих молекул in vivo. Компонетны plasminogen системы были среди первых протеиназ, которые были нокаутированы у мышей. На базе их участия в протеолитическом расщеплении околоклеточного матрикса и их способности регулировать адгезию и миграцию в качестве сигнальных рецепторов, ожидалось, что uPAR будет играть принципиальную рольв многочисленных биологических процессах и нарушениях, связанных с миграцией клеток in vivo. Однако генетические исследования мышей показали, что роль uPAR менее критическая, чем предполагалось и выявление этой роли in vivo в протеолизе или напротив в передаче сигналов все еще необходимо доказывать. Известен ряд примеров, в которых роли uPA, uPAR и plasminogen были изучены (Рис. 5).

uPAR as a proteinase receptor.

Необходим ли uPAR для околоклеточного протеолиза плазмина и важен ли для клеточной миграции и тканевого ремоделирования in vivo? Концентрация uPA на клеточной поверхности — благодрая ее связи с uPAR на ведущем крае инвазирующих клеток — как предполагается, существенна для направленной миграции многих типов клеток.В соответствии с этой моделью нехватка uPAR, uPA или плазминогена д. вести к дефектам миграции клеток. Одной из первых потребностей в клеточной миграции является имплантация ранних эмбрионов в матку. Т.к. и uPA и uPAR экспрессируются в месте имплантации эмбриона, то жизнь бел этих молекул кажестя невозможной. Однако, эмбрионы, которые не экспрессируют uPA или uPAR, развиваются нормально и остаются здоровыми до взрослого периода. Мыши выживают даже тогда, когда у них отсутствует и uPA и tPA или plasminogen. Итак, хотя uPAR способен затрагивать миграцию клеток in vitro, находки in vivo заставляют пересматрвать догаматическую концепцию, что uPAR всегда важен.

Но ожидания, что эта протеиназная система, не м.б. полностью перекрыта (redundant) сбываются, когда мыши с отсутствием и uPA и tPA погирбают от генерализованного тромбоза и воспалений. Т.к. недостаток плазминогена фенокопируется комбинированной незваткой tPA и uPA, то отсутствие протеолиза плазмина м. отвечать за летальность. Фибрин, по-видимому, является главным субстратом плазмина, т.к. потрея фибриногена устраняет летальность дефицитных по plasminogen мышей. Однако. комбинированная нехватка uPAR и tPA вызывает минимальные отложения фибрина, это служит первым указанием на то, что uPAR играет минимальную роль в генерации протеолиза околоклеточного плазмина .

Последующее фентипирование показало, что uPA является 'stress-responsive' протеиназой, которая используется как для деструкции ткани, так и тканевом заживлении при многочисленных нарушениях. Неконтролируемый uPA-генерируемый протеолиз плазмина вызывает life-threatening деструкцию ткани (Рис. 5). Напр., в покоящеся сосудистой стенке или в сердце uPA экспрессируется минимально и находится в балансе с помощью PAI1. Однако, как только стнека сосуда становится атеросклеротической, то она трансплантируется или повреждается (как это происходит, когда STENT оказывается в закупоренных сосудах) или когда сердце лишается кислорода (как это происходит во время инфаркта миокарда), то uPA обильно продуцируется прежде всего в инфильтрирующих воспалительных клетках. Т.к. uPA экспрессирует в избытке PAI1, то сеть протеолизов вызывает деструкцию стенки сосудов и сердца и предрасположенность к ANEURYSMAL DILATION и фатальному разрыву сердца соотв. Потеря или ингибирование uPA защищает мышей против такого разрушения ткани, но потеря uPAR неспособна защитить мышей против такой деструкции ткани. Это неожиданно, т.к uPA является существенной для нейтрофилов, чтобы те были способными инвазировать в ишемический миокард. Итак, даже нейтрофилами экспрессируемый uPAR и Mac1/α_Mβ₂-интегрин и адгезия uPAR-дефицитных нейтрофилов, неспосбны активировать эндотелий, они проникают и разрушают миокард также эффективно, как нейтрофилы дикого типа. Т.к. дефицит плазминогена также предупреждает деструкцию ткани, то uPA, по-видимому, осуществляет свою активность в первую очередь благодаря индукции протолиза плазмина (после привлечения нейтрофилов). Роль uPA в передаче сигналов uPAR, однако, исключить нельзя. С помощью активирования некоторых неактивных pro-matrix-metalloproteinases (pro-MMPs), плазмин — вместе с активной MMPs — разрушает большинство компонентов ECM (Рис. 3). MMPs и плазминогеновая система также кооперируются и перекрываются при заживлении ран кожи.

Генетические исследования выявили также существенную роль uPA в заживлении ткани или регенерации. Напр., потеря uPA нарушает образование рубца и предрасполагает мышей к сердечной недостаточности после инфаркта миокарда, т.к. фибробласты раны неспособны инфильтрироваться в ишемический миокард и активировать фибриногенный transforming growth factor-β1 (TGF-β1). Отсутствие uPA или плазминогена также предупреждает сосудистые гладкомышечные и эндотелиальные клетки от образования новых кровяносных сосудов (ангиогенез) в ишемическом миокарде (Box 2). Потеря uPA предупреждает также развитие обструктивного RESTENOSIS механически поврежденных стенок сосудов, т.к. сосудистые гладкомышечные клетки неспособны мигрировать. В большинстве этих процессов потеря плазминогена дает фенотипы, которые очень сходны с таковыми при дефиците uPA, тогда как потеря uPAR не окахзывет или оказывает только минимальный эффект. Итак, роль uPA in vivo, по-видимоу, преимущественно связана с генерацией плазмином-обеспечиваемого протеолиза, а uPAR играет ничт ожную роль в усилении генерации плазмина. Почему uPAR избыточен в этих uPA-зависимых процессах и почему uPA не нужна для связывания uPAR для генерации достаточного околоклеточного плазминового протеолиза? Возможно потому, что компоненты ECM м. замещать uPAR, каа и сайт связывания для uPA, это позволяет генерировать достоточно плазмина вблизи проникающих (infiltrating) клеток. Кроме того, кинетическое усиление генерации плазмина с помощью uPA, когда она связана с uPAR, по-видимому, очень незначительно для большинства хронических процессов. Эти результаты не исключают появление передачи сигналов uPAR в этих процессах, но ее роль затушовывается преимущественным вкладом в uPA-зависимый протеолиз.

uPAR as signal receptor and integrin modulator.

Роль uPA и uPAR, независимая от плазминового протеолиза, продемонстрирована в в задщите легких хозяина против opportunistic патогенов. Нейтрофилы являются первыми клетками, которые достигают места повреждения и они существенны для защиты хозяина благодаря свой способности прилипать и проникать сквозь эндотелий, чтобы фагоцитировать чуждые патогены и продуцировать свободные радикалы кислорода и протеолитические энзимы. Эти функции зависят от участия определенных рецепторов клеточной поверхности, особенно Mac1/α_Mβ₂, которые взаимодействуют с uPAR на поверхности нейтрофилов. Ключевая роль Mac1 в поставе лейкоцитов показана с помощью нарушенной антимикробной защиты и повышенной re-perfusion-индуцированной повреждаемости для ишемической ткани у мышей, у которых отсутствует Mac1 или его лиганд ICAM1 и у людей с leukocyte adhesion CD18 (β2-integrin of Mac1) deficiency syndrome. В зависимости от патогена нейтрофилы эмигрируют из сосудистыой системы легких с помощью Mac1-зависимых (Pseudomonas aeruginosa инфекция) или -независимых механизмов mechanism (Streptococcus pneumoniae инфекция). Используя uPAR-дефицитных мышей, выявлена потребность в uPAR, которая не зависит от uPA, для поставки нейтрофилов. В отсутствие uPAR рекрутирование нейтрофилов нарушено во время инфекции P. aeruginosa. Anti-CD11b антитела блокируют поставку нейтрофилов у мышей дикого типа, но они не способны далее нарушать поставку uPAR-дефицитных нейтрофилов, это указывает на то, что uPAR и Mac1 м. дейстовать на общем пути.

uPAR является также модулятором поставки лимфоцитов в воспаленные антигенами легкие, поскольку отсутствие uPAR вызывает >50% снижение поставки лимфоцитов. Роль uPAR в поставке лимфоцитов не зависит от его естественного лиганда uPA — находка, которая остается необъясненной по сей день также как и ингибирование притока нейтрофилов в хемокинами-индуцированное воспаление легких с помощью non-proteolytic uPA. Возможно, что uPAR модулирует интегрины или селектины или активируется витронектином в месте инфекции и обеспечивает витронектину хемоаттрактантную активность. Напротив, uPAR м. регулировать хемотаксис в ответ на non-uPA стимулы, такой как fMLP-зависимая миграция моноцитов. β₂-integrin-зависимая адгезия лейкоцитов с эндотелием и инициальная поставка лейкоцитов в воспаленную брюшину также нарушается в отсутствие uPAR. Однако, uPAR регулирует также Mac1-независимые события, т.к. поставка лейкоцитов в легкие после инфекции S. pneumoniae также предупреждается в отсутствие uPAR, это ведет к уменьшению удаления пневмококков из легких и сильному сижению выживаемости хозяев.

Лейкоцитарный uPAR также является важным регулятором адгезии нейтрофилов и воспалительной реакции при ишемическом повреждении сердца. Отсутствие uPAR нарушает хемотаксис и адгезию — и следовательно, поставку — uPAR-дефицитных нейтрофилов в ишемический миокард и защидает мышей от reperfusion повреждений вследствие временной закупорки коронарных артерий. Неясно, могут ли uPAR и Mac1 кооперироваться в этом процессе, но безусловно, что недостаточность CD18 также ослабляет секвестрацию нетрофилов и ischaemia/reperfusion повреждения миокарада. Все это указывает на то, что протеолиз-незавимое взаимодействие uPAR с β₂-интегринами происходит в инициальной фазе взаимодействия лейкоцитов сл стенкой сосудов, тогда как последующе привлечение нейтрофилов в воспаленную или ишемическую ткань м. нуждаться в plasmin-proteolysis-зависимом разрушении анатомических барьеров (Рис. 5).

Reconciling the in vitro and in vivodata

Итак, во-первых, in vitro исследования проливают свет на молекулярные механизмы и показывают, что uPAR способен влиять на некоторые клеточные функции, такие как адгезия, миграция, пролиферация и дифференцировка, но необходимо подтверждение, что uPAR существенен для этих процессов и in vivo. Др. стратегии, с использованием knocking-in постоянно 'activated' uPAR (GPI-anchored D2D3 фрагмент), возможно помогут понять роль uPAR как сигнальнывх рецепторов. Во-вторых, in vivo генетические находки у мышей выявили не перекрываемую потребность в uPAR в определенных процессах, таких как интегрин-зависмое рекрутирование лейкоцитов. Но анализ uPAR-дефицитных условий показывает их неинформативность для идентификации условий, при который избыточная экспрессия uPAR затрагивает процессы. Напр., нормальные клетки м. не зависеть от uPAR в своем росте, т.к. они экспрессируют низкие уровни uPAR, тогда как рост опухолевых клеток более зависит от uPAR, т.к. злокачественные клетки экспрессируют повышенные количества рецептора. Кроме того, возможные компенсаторные следствия дефицита uPAR в зародышевой линии м. б. маскирпованы потребностью в uPAR у нормальных хозяев. Важно также изучение молекул с перекрывающей ролью (т.к. часты случаи когда сигнальные молекулы взаимодействуют со многими путями) с помощью нокаута генов. Обнаружение, что uPA соединяется не только с uPAR, но и с белками ECM м. объяснить, почему действие uPAR перекрывается, очевидно также, что м. существовать патологические условия, при которых это перекрывание м. оказаться недостаточным. Анализ мышей, у которых отсутствует не только uPAR но и также молекулы, такие как FPRL1, с которыми он взаимодействует, м оказаться успешным. В-третьих, in vivo фармакологические исследования у мышей делают возможной блокировку экспрессии uPAR не только у хозяина, но и в опухолевых клетках. Напротив, антисмысловые исследования позволяют селективно блокировать экспрессию uPAR в опухолевых клетках. Некоторые из этих исследований подтверждают роль uPAR в канцерогенезе. В-четвертых, исследования экспрессии uPAR у людей показали, что рецептор присутствует при определенных нарушениях (значит потребность в нем существенна, если он участвует в нарушениях), но они ничего не говорят о функциональном значении рецептора (Вох 1).

An integrated view on uPAR

uPAR идентифицирован как протеиназный рецептор для uPA, концентрирующий plasmin протеолиз на поверхности мигрирующих клеток, на их ведущем крае. В то время как генетические данные беспорно подчеркивают важность uPA-обеспечиваемого plasmin протеолиза в ремоделировании ткани, они также оспаривают классическую модель, что uPAR абсолютно необходим для этих процессов. Известно, что uPAR взаимодействует, по крайней мере с двумя трансмембранными белками — интегринами и FPRL1. В спокойных условиях или в условиях, которые способствуют адгезии и пролиферации клеток, uPAR, по-видимому, участвует в предаче сигналов прежде всего черех интегрины. Напротив, in vitro данные указывают на то, что когда uPA стимулирует миграцию клеток, то uPAR м. менять своих интегриновых партнеров на FPRL1 и возможно на др. рецепторы. Данные нокаута in vivo демонстрируют вовлечение интегринов в uPA–uPAR-индуцированную миграцию, поэтому возможна интерпретация, что взаимодействие с интегрином необходимо не только для предачи сигналов uPAR при адгезии и пролиферации, но также для обеспечения др. взаимодействий, напр., с FPRL1. Во всяком случае, м. рассматривать uPAR как разносторонний распределитель или даже дирижет сигналов на поверхности, которые способны рекрутировать интегрины или GPCRs избирательно в разных клеточных процессах. Генетические исследования подтверждают proteolysis-независимую роль uPAR в передаче сигналов во время инициальной фазы клеточной миграции. Взаимодействие с uPA, по-видимому, критическое в индукции этих разнообразных эффектов.

Several questions, though, remain outstanding. What is the precise in vivo role of uPAR in inflammatory and tumour migration, and can one answer this question by 'knocking in' modified uPAR (and other partners) genes? Are suPAR levels (in blood or urine) a useful marker for disease progression, and do they allow treatment for particular individuals to be tailored? Will shedding of chemotactically active uPAR fragments induce cell migration and/or desensitize cells from the action of other chemoattractants? How does the cell choose between signalling through these two (if not more) pathways? Do these two pathways interact with others and at what level? The details of the signalling pathways are still incomplete: proteomic analysis might provide a more global insight. The challenge for the future is now to unravel the subtle molecular intricacies of this versatile orchestrator and its impact on the most fundamental processes that determine health and disease.

UPAR: A VERSATILE SIGNALLING ORCHESTRATOR
Francesco Blasi (blasi.francesco@lsr.it), Peter Carmeliet
Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, No 12, P. 932-943 (2002)

Boxes

Links

UPAR: A VERSATILE SIGNALLING ORCHESTRATOR Francesco Blasi (blasi.francesco@lsr.it), Peter CarmelietNature Reviews Molecular Cell Biology 3, No 12, P. 932-943 (2002)

Boxes

Links

UPAR: A VERSATILE SIGNALLING ORCHESTRATOR
Francesco Blasi (blasi.francesco@lsr.it), Peter Carmeliet
Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, No 12, P. 932-943 (2002)