PD | Sey |

Pax6 являетсясильно законсервированным транскрипционным фактором, который содержит два ДНК-связывающих домена, paired domain (PD) и homeodomain. Pax6 был идентифицирован как важный регулятор развития central nervous system (ЦНС), глаз, носа, поджелудочной железы и гипофиза, в основном благодаря исследованиям некоторых линий мышей и крыс , которые несли спонтанные или искусственные мутации гена Pax6. Хотя Pax6 гетерозиготные мутантные мыши/крысы с полудоминантной мутацией известны как Small eye (Sey) мутанты, их гомозиготные мутантные эмбрионы погибают вскоре посрел рождения и обнаруживают тяжелые фенотипы, такие как отсутствие глаз и носа, а также аномалии головного мозга. Одна из линий крыс Small eye rSey2, имеет спонтанную инсерцию одного основания в кодирующую область Pax6, которая создает аномальный стоп-кодон ниже abnormal stop codon downstream of the PD [1]. Однако при Western blot анализе с использованием антител против PD из Pax6, укороченный Pax6 белок не обнаруживался у гомозиготных (rSey2/rSey2) эмбрионов, хотя мы обнаруживали укороченный белок Pax6 у E10.5 Sey/Sey мышей [2]. Следовательно, rSey2/rSey2 эмбрионы пригодны для анализа роли транскрипционого фактора Pax6.

В развивающемся головном мозге млекопитающих Pax6 экспрессируется в виде специфических пространственно-временных паттернов. Pax6 экспрессируется в пролиферирующих нейроэпителиальных клетках непосредственно преде началом нейрогенеза на embryonic day 10 (E10) у крыс (что соотв. E8 у мыши) и локализуется в переднем, заднем мозге и спинном мозге. Pax6 регулирует разнообразные онтогенетические события, включая формироание паттерна переднего, заднего и спинного мозга, а также последующуют нейрональную спецификацию, образование нервных дуг (circuits) и миграцию нейронов [3]. Более того, Pax6 участвует в нейрогенезе, т.e. в пролиферации нейральных стволовых и progenitor клеток и в продукции нейронов [4-6], а также в дифференцировке астроцитов [7]. Множественные функции Pax6 скорее всего осуществляются за счет активации различных генов мишеней.

Мы ранее использовали анализ ДНК микромассивов, чтобы продемонстрировать, что специфичный для головного мозга ген fatty acid binding protein (Fabp7) заметно подавляется как в переднем, так и заднем мозге E12.5 rSey2/rSey2 крыс ( E10.5 мыши) и необходим для поддержания пролиферирующих нейральных стволовых клеток в развивающейся коре крыс [8]. Три др. исследования микромассивов ДНК сравнивали развивающийся телэнцефалон у Pax6 мутантных мышей с таковым у дикого типа (WT) и идентифицировлаи др. нижестоящие для Pax6 гены, такие как mEvf1 [9], Ctnnd2 (β -catenin) [10], Starb2, Nfia, AP-2?, NeuroD6, Ngn2, Tbr2, Bhlhb5 и retinoic acid (RA) сигнальную молекулу Rlbp1 [11]. Недавно гены мишени для Pax6 были илдентифицированы в развивающемся неокортексе мыши, используя ChIP-chip анализ в комбинации с анализом транскриптома, это позволило выявить Pax6-регулируемую транскрипционную сеть в коре E12.5 мыши [12]. По сравнению с этими данными по телэнцефалону, существует меньше информации о нижестоящих генах для Pax6 в заднем мозге, хотя Pax6 является критическим для развития двигательных нейронов заднего мозга, мозжечка и precerebellar ядер [1,13-18].

В данном исследовании мы анализировали транскриптомные профили у E11.5 rSey2/rSey2 и WT крыс, чтобы четко идентифицировать нижестоящие для Pax6 гены на ранней стадии развития заднего мозга. Удалось отобрать гены с достоверно отличающейся экспрессией, используя quadruplicate microarray данные, преобразованные с помощью двух сравнительных анализов; мы подтвердили волну изменений, используя количественный RT-PCR. Gene ontology анализ выявил, что ряд дифференциально экспрессирующихся генов кодирует сигнальные молекулы. а также транскрипционные факторы, связанные с развитием. Детальный анализ паттернов экспрессии этих нижестоящих генов, включая Dbx1, Unc5h1 и Cyp26b1, а также некоторых специфичных для заднего мозга маркеров неожиданно выявил формирование передне-заднего паттерна дефектов в заднем мозге rSey2/rSey2, который может быть связан с нарушением экспрессии Cyp26b1, RA-метаболизирующего энзима.

Discussion

Advantages of our comparative microarray analyses

Мы осуществили тщательный анализ транскрипционных профилей для поиска нижестоящих генов, регулируемых с помощью Pax6 в E11.5 заднем мозге WT и rSey2/rSey2 эмбрионов, используя коммерческие high-density oligonucleotide наборы. После сбора 4-х пулов из 40 выборок заднего мозга, выделенных у E11.5 эмбрионов крыс каждого генотипа, мы приготовили 4 набора пулов кДНК для сравнительного анализа микромассивов. Преимуществами нашего "pooled method" являются : (1) миниминизация индивидуальных различий на эмбриональной стадии, размера и уровня генной экспрессии и (2) выделение достаточных количеств РНК для анализма микромассивов без неестественной амплификации даже у небольших эмбрионов. Мы полагаем. что этот "pooled method," хотя и трудоёмкий, но существенно улучшает получение надежных данных. Более того, сравнительный анализ quadruplicate выборок с использованием двух компьютерных методов позволил нам идентифицировать дифференциально экспрессирующиеся гены, которые имеют относительно небольшие fold изменения, такие как Camk2n1, Hes5 и Ctnnd2 (Figure 3B, C), или низкие уровни экспрессии, такие как Gdf11 и Cxcl5 (Figure 3D). Доверительность, как показывает Figure 1, указывает на то, что отобранные гены с относительно низким изменением складок ( lower fold change) также рассматриваются как реально идентифицируемые в нашем анализе микромассивов.

Мы успешно минимизироали ложно позитивных/негативных кандидатов на рол дифференциально экспрессирующихся генов, особенно в отношении подавляемых генов. Все подавляемые гены обнаруживали сходную тенденцию в двух сравнительных анализах микромассивов и в Q-PCR (Figure 3). Только 2 из 40 протестированных генов обнаруживали уровни экспрессии в Q-PCR, которые оказались не соответствующими с сигналами их интенсивности в анализах микромассивов. Мы не провлодили Q-PCR для трех генов, интесивность сигналов которрых была менее 1.0. Эти 5 генов активироались с анализе микромассивов. Одной из причин такоего различия является то, что мы приготовили праймеры для Q-PCR , исходя из последосательностей мРНК полной длины или исходя из Ensembl/N-SCAN/Genscan предсказаний и не использовали те же самые EST последовательности для набора зонгдов. Транскрипция EST доменов и полной длины РНК, а также amputation/digestion мРНК после транскрипции могут регулироваться по-разному. Др. причиной такого отличия может быть стадия развития наших выборок. Мы использовали задний мозг E11.5 крыс (E9.5 у мыши) , чтобы увидеть нижестоящие гены, которые непосредственно регулируются с помощью Pax6. Эта стадия появляется толькоспустя 24 h после начала экспрессии Pax6. Следовательно, подавленная экспрессия у rSey2/rSey2 воспроизводима, тогда как позитивная регуляция экспрессии, которая может быть косвенной, нет. Исходя из предыдущих результатов анализа микромассивов Sey/Sey мышей, Duparc et al. [10] проанализировали передний мозг E9.5 Pax6LacZ/LacZ мышей и показали значительно меньшее количество активируемых генов по сравнению с подавляемыми генами в scatter plot. Др. анализ профилей, при которых использовали эмбрионов более поздней стадии, мы выявили большее количество активируемых генов в телэнцефалоне Sey/Sey мышей [11,12]. Эти находки могут быть приписаны непрямой регуляции увеличивающегося количества генов молекул сигнальных путей и/или транслокационных факторов, которые оказываются нижестоящими по сравнению с Pax6 на более поздних стадиях развития, после инициации экспрессии Pax6. В нашем анализе с использованием E11.5 rSey2/rSey2 заднего мозга мы получили слегка большее количество активируемых генов (737) по сравнению с подавляемыми генами (684), хотя количество активируемых генов с сигналом высокой интенсивности (68, 9.2%) было меньше, чем подавляемых генов (194, 28%) (Figure 1). Эти результаты также указывают на утонченность молекулярных сетей, которые лежат ниже Pax6, поскольку начало экспрессии Pax6 в заднем мозге происходит слегка раньше, чем в переднем мозге.

В ходе исследования мы идентифицировали множественные наборы зондов на RAE230 массиве, которые распознаются разными последовательностями одних и тех же генов и обладают широкими различиями в интенсивности сигналов; сюда входит набор зондов для Fabp7, Unc5h1, Cyp26b1, Camk2n1, Hes5 и Ctnnd2 (Figure 1). Изменчивость в интенсивности сигналов среди множественных наборов зондов может быть обусловлена (1) сплайс-варантами, (2) разными названиями генов, (3) ESTs, которые не были интегрированы в соотв. мРНК внутри базы данных Uni крыс, которые были использованы для обозначения наборов зондов. Мы использовали poly(A)⁺ РНК, не всю РНК, в качестве матриц, это могло вносить расхождения в интенсивность сигнала из разных зондов, предназначенных распознвать 3' или 5' сайты относительно длинных генов.

Downstream factors of Pax6 clarified by GO analyses

Мы осуществляли GO анализ, чтобы вычленять общие свойства молекул стоящих ниже Pax6. GO анализ, показанный на Figure 2, установил. что различные сигнльные молекулы располагаются ниже Pax6. Большое количество информации анализа GO позволило нам поиск интересующих нас свойств нижестоящих Pax6 факторов. Напр., нашли изменения транскрипции для Sst, Ceacam1, Cspg3, Ascl1, Unc5h1, Nrg1 и Thy1, которые были отнесены к группе "миграции клеток" в теминах GO BP (see Additional file 3). Поскольку известно, что Pax6 регулирует поляризацию гранулярных клеток и миграцию в развивающемся мозжечке [15], то некоторые из этих факторов могут участвовать в молекулярных механизмах этих событий.

Gohlke et al. сообщают о GO анализе транскрипционных профилей, с испоьзованием мышей, дефицитных по или избыточно экспрессирующих Ngn2 и Mash1, ключевые транскрипционные факторы, которые способствуют нейрогенезу [24]. Были отобраны гены, которые активируются в телэнцефалоне, трансфицированном Ngn2 или Mash1 (т.e., выборки 18 h после электропортации на ст. E10.5), и подавляются в телэнцефалоне Ngn2 и/или Mash1 нокаутных мышей на E13.5. Среди 131 и 35 генов, которые имели GO annotations и рассматривались как регулируемые с помощью Ngn2 и Mash1, соотв., 32% и 37% генов, соотв., были отнесены по GO терминологии к "сигнальная трансдукци/рецепторы", и 14% и 20% генов, соотв., были помечены как "регуляция транскоипции". Эти регуляции согласуются с нашим списком генов кандидатов, которые могут регулироваться с помощью Pax6 в заднем мозге E11.5 крыс; такое совпадение вполне разумно, учитывая, что Ngn2 описывается как непосредственно индуцируемый с помощью Pax6 репрессирующий Mash1 [25,26].

Downstream genes previously reported in Pax6 mutants

Ранее мы сообщали, что развитие краниальных двигатеьных нейронов в rSey2/rSey2 заднем мозге аномально; два типа соматических двигательных нервов -- abducent (VI) и hypoglossal (XII) моторные нейроны -- отсутствуют, когда функция Pax6 потеряна [1] благодаря аномальному образованию доменов предшественников для этих вентральных дивгательных нейронов вдоль дорсо-вентральной оси [16]. Мы также установили, что cadherin7/cadherin20-экспрессирующие nXII моторные ядра отсутствуют у E18.5 rSey2/rSey2 крыс [27]. Уровни экспрессии генов, которые кодируют домен-специфические гомеодоменовые белки и секретируемую молекулу Wnt7b, изменены в вентрикулярной зоне E12.5 мутантного заднего мозга [1,16], хотя характеристики др. молекул, участвующих в нижестоящей Pax6 сети, которые затрагивают развитие заднего мозга, остаются неизвестными.

В этом исследовании микромассивов негативная регуляция Fabp7 и Dbx1, которая была описана ранее [8,16], была подтверждена. Экспрессия Fabp7 в заднем мозге обнаруживает существенное снижение на ст. E11.5, нам на E12.5, подтверждая, что регуляция Fabp7 на более ранней ст. больше зависит от функции Pax6. Предыдущая работа, сообщала о потере экспрессии Ngn2 в домене предшественников соматических двигательных нейронов в E12.5 rSey2/rSey2 заднем мозге [28]. В нашем анализе, используюшем E11.5 задний мозг, мы не нашли достоверных отличий в экспрессии Ngn2 (p > 0.05; 1.4-раза с помощью GeneSpring, 1.2-раза с помощью MAS и 1.6-раза с помощью Q-PCR). Мы также сравнивали экспрессию Ngn2 в E11.5 заднем мозге с помощью WISH, но не выявили заметных различий между WT и rSey2/rSey2 (Takahashi and Osumi, unpublished data). Эти находки указывают на то, что существует по времени разная регуляция Ngn2 с помощью Pax6.

Члены семейства Hes (rev. [29]) и Bhlhb5 являются др. важными bHLH транскрипционными факторами, важными для нейрогенеза. В нашем анализе микромассивов набор зорндов для Hes5 обнаруживает 1.8- и 1.9-кратное подавление (p < 0.05, Figure 3B, C), хотя уровни экспрессии Hes1 и Hes3 не отличаются между WT и rSey2/rSey2. Экспрессия Bhlhb5 также достоверно снижается в rSey2/rSey2 заднем мозге (2.1-раз, p < 0.05, Figure 3A'), подобно предыдущим результатам анализа транскриптома Sey/Sey телэнцефалона мыши [11]. Bhlhb5, как установлено экспрессируется в кортикальном зачатке мыши и контролирует субтип специфических проекционных нейронов [30]. Более того, Ngn2, ниже стояший Pax6, как было показано стоит выше Bhlhb5 [31,32]. Между тем у человека, BHLHB5 экспрессируется в мозжечке и может репрессировать экспрессию Pax6 [33]. Поэтому предполагается, что Pax6 регулирует пролиферацию и дифференцировку нейральных стволовых и клеток предшественников посредством организации bHLH транскрипционных факторов гнездовым способом.

Хотя мы несмогли выявить подавление Wnt7b в E11.5 заднем мозге, как это обнаруживается в на ст. E12.5 [1], др. член семейства Wn, Wnt7a, обнаруживает достоверное подавление (Figure 3C), как это было описано для переднего мозга мыши [11]. Следовательно, регуляция нижестоящих генов с помощью Pax6, по-видимому, совершенно зависит от контекста; Pax6 может по-разному регулировать экспрессиию молекул мишеней в зависимости от стадии и ткани.

Novel downstream genes of Pax6 and their relationship to the anteroposterior patterning of the hindbrain

В данном исследовании мы идентифицировали новых кандидатов на роль Pax6 нижестоящих молекул. Во-первых, экспрессия Unc5h1 исчезает из rSey2/rSey2 заднего мозга в домене вентральной экспрессии Pax6 в r2- r7 (Figure 4A, E and 5F). Более того, экспрессия Unc5h1 обнаруживается в дорсальной части r7 и в спинном мозге (Figure 4E and 5D, E), где Pax6 не обнаруживается на ст. E11.5 (Figure 4A and 5F); однако, Pax6 экспрессируется на более ранней стадии у WT и rSey2/+ (data not shown). В заднем мозге rSey2/rSey2, почти не выявляется экспрессии Unc5h1 с помощью WISH (Figures 4E and 5F). Поэтому мы подозреваем, что экспрессия Unc5h1 регулируется с помощью Pax6 до ст. E11.5. В мозжечке Pax6 гомозиготных мутантных мышей экспрессия Unc5h3 полностью отсутствует в наружном слое гранулярных клеток [14]. Эти находки могут указывать на общую регуляцию экспрессии удвоенных генов семейства Unc5 с помощью Pax6.

Lh/ кандидатом на роль стоящего ниже Pax6 является Cyp26b1, RA катаболический фермент. Отсутствие Cyp26b1 ведет к дисперсии сигнала RA в развивающейся конечности [34]. RA , как полагают, действует как диффузионный морфоген, который формирует паттерн заднего мозга вдоль передне-задней оси, а деградация RA с помощью Cyp26s является главным детерминантом пространственно-временной передачи специфических сигналов RA (rev. [35]). RA также изменяет паттерн миграции клеток краниального нервного гребня у эмбрионов крыс [36]. Мы нашли, что экспрессия Cyp26b1 специфически устраняется в r5 и r6 в заднем мозге rSey2/rSey2 крыс (Figure 5I, L). Эти два ромбомера экспрессируют ген kreisler, который кодирует транскрипционный фактор MafB, белок с критической ролью в формировании каудального паттерна заднего мозга [37,38]. Maf выступает партнером с Pax6 в отношении синергичной активации транскрипции некоторых crystallin и glucagon генов [39,40]. Следовательно, экспрессия Cyp26b1 в r5 и r6, по-видимому, регулируется с помощью Pax6 вместе с MafB.

Хотя нокаутные мыши, лишенные функции Cyp26b1, не обнаруживают существенных дефектов в заднем мозге [34,41], два сообщения описывают вклад Cyp26b1 в развитие заднего мозга у рыбок данио; Hernandez et al. установили, что инъекция cyp26b1 антисмысловых morpholino oligonucleotide (MO) мутантам cyp26a1 вызывает экспансию r4 и сдвиг кпереди границы r6/7 [42]. Reijntjes et al. показали, с помощью предупреждения сплайсинга cyp26b1 транскриптов у WT эмбрионов, используя др. cyp26b1 MO, уменьшение размеров ромбомеров и дефекты черепно-лицевых структур на более поздних стадиях [43]. При детальном анализе ромбомеров, с использованием Krox20 зонда, мы наблюдали, что регион r5 расширяется вдоль передне-задней оси до некоторой степени (Figure 6F, L). Этот результат представляет собой новую находку, что формироание передне-заднего паттерна заднего мозга нарушается у Pax6 мутантов. В соответствии с этим результатом мы нашли незанчительную активацию Krox20 (1.63- и 1.31-раз изменения с двумя наборами зондов, но p > 0.05).

Недавно ген Hoxd4 был описан в каестве непосредственной мишени Pax6. Экспрессия Hoxd4 в r7 и спинном мозге снижается до некоторой степениу Pax6 мутантных эмбрионров мыши, а двойной нокдаун pax6a и pax6b с помощью MOs вызывает нарушение границ ромбомеров и anteriorized экспрессию hoxd4a границы у эмбрионорв рыбок данио [44]. В нашем анализе микромассивов, Hoxd4 обнаруживает назначительное подавление со статистической достоверностью (1.37-раз; p < 0.05), хотя уровень его экспрессии довольно высок, даже в rSey2/rSey2 заднем мозге (нормальзованная интенсивность 3.332 против 4.581 у WT). Поэтому мы считаем, что потеря функции Pax6 вдияет на формирование передне-заднего паттерна r5 за счет подавления Cyp26b1 скорее, чем за счет регуляции экспрессии гена Hoxd4.

Передне-задние дефекты. наблюдаемые у мутантов Pax6 в заднем мозге очень мягкие по сравнению с таковыми фенотипами, индуцируемыми избытком RA (rev. [45,46]). Было бы интересно установить, как незначительно повышенные уровни передачи сигналов RA влияют на формирование ромбомеров и последующую нейральную функцию.

Conclusions

We identified Unc5h1 and Cyp26b1 as novel downstream genes of Pax6 in the early development of the hindbrain. In addition, the broadening of the r5 region in Pax6 mutant embryos raises the possibility that Pax6 regulates the anterior-posterior patterning of the hindbrain via activation of the RA-metabolizing enzyme Cyp26b1.