Эндокардиальные подушки являются примордиями клапанов и перегородки и становятся зрелыми структурами благодаря ремоделированию (embryonic day [E] 10.5-E18.5) и элонгации и созреванию клапанов (E14.5-1 неделя после рождения; Person et al.,[2005]). Ремоделирование кардиальных клапанов может быть концептуально организованным по многим аспектам, включая экспансию (E10.5-E12.5), дифференцировку (E12.5-E16.5) и конденсацию (E15.5-E18.5) мезенхимы, все они происходят перекрывающимся образом (Butcher and Markwald,[2007]). FGF2 участвует во врожденных пороках сердца, связанных с аномальным генезом клапанов при синдроме Noonan (Chen et al.,[2000]; Uhlen et al.,[2006]). Были использованы различные аспекты преобразования тканей клапанов как фактор роста (Narine et al.,[2006]) и чтобы стимулировать рост и ингибировать апоптоз эндокардиальных подушек в культуре
(Choy et al.,[1996]; Zhao and Rivkees,[2000]). Мы использовали стандартную иммуногистохимическую процедуру (LSAB
kit, Dako, CA) , чтобы локализовать FGF2 в клапанах эмбрионального сердца с поликлональными FGF2 антителами кроликов (Liao et al.,[2007b]), которые неспецифически выявляют как LMW, так и HMW FGF2 (Fig. 3E-N). Показано, что большинство мезенхимы клапанов в артериовенозных (митральном и трехстворчатом) и клапанов тракта оттока (aortic и pulmonary), которые не окрашивались антителами актинового маркера кардиальных мышц (Fig. 3A-C), обнаруживали интенсивное и преимущественно ядерное окрашивание FGF2 антителами (Fig. 3E-N). Кроме того, отсутствовало обнаружимое окрашивание FGF2 в эндотелии клапанов (arrow in Fig. 3L,N). Эти данные согласуются с известной
функцией FGF2 в развитии клапанов сердца (Zhao and Rivkees,[2000]; Uhlen et al.,[2006]) и показывают, что intracrine передача сигналов FGF2 играет важную роль в развивающихся клапанах сердца.
Эпикард вносит существенную и критическую пропорцию не миокардиальных клеток во время развития сердца (Kruithof et al.,[2006]; Lie-Venema et al.,[2007]; Lavine and Ornitz,[2008]). Эпикард происходит из проэпикардиального органа и покрывает сердце на ст. E10.5. Пролиферация и развитие миокарда и развитие коронарных сосудов происходят конкурентно во время середины беременности (E11.5-E16.5). Эпикардиальная epithelial-mesenchymal transformation (EMT) дает epicardium-derived cells (EPDC), которые формируют субэпикардиальную мезенхиму и затем мигрируют в миокард и дифференцируются в smooth muscle cells (SMC) и кардиальные фибробласты (Olivey et al.,[2004]). EPDC также вносят вклад в атриовентрикулярные клапаны, кардиальные фибробласты и коронарные сосуды и необходимы для собственно развития миокарда желудочков (Lie-Venema et al.,[2007]). Передача сигналов FGF рассматривается как критическая для развития эпикарда и коронарных сосудов (Lavine and Ornitz,[2008]), и FGF2 позитивно регулирует эпикардиальный EMT в коллагеновом геле из сердца птиц (Morabito et al.,[2001]). Соответственно, применение FGF2 кусочков приводит к усилению коронарной васкулатуры (Merki et al.,[2005]) и пролиферации миокардиальных клеток (Lavine et al.,[2005]). Также сообщалось, что FGF-индуцированный дисбаланс в пролиферации миокардиальных клеток на ранних стадиях развития сердца приводит к сердечно-сосудистым аномалиям во время позднего эмбриогенеза (Franciosi et al.,[2000]). Более того, FGF2 ингибирует апоптоз в культивируем миокарде желудочков (Zhao and Rivkees,[2000]). Эпикард также необходим для поддержания правильной величины пролиферации миоцитов в компактном миокарде посредством уровней экспрессии FGF2 в миокарде эмбрионального сердца кур (Pennisi et al.,[2003]).
Хотя экспрессия FGF2 обнаруживается в проэпикарде кур (Kruithof et al.,[2006]), эпикарде и компактном миокарде (Consigli and Joseph-Silverstein,[1991]; Spirito et al.,[1991]; Pennisi et al.,[2003]; Merki et al.,[2005]), субклеточное распределение разных изоформ FGF2 в эпикарде, миокарде и коронарных сосудах сердца плода или не описано или плохо описано, частично из-за недоступности FGF2 изоформ-специфических антител. Всё ещё для субклеточной локализации используются FGF2 антитела, которые идентифицируют FGF2 если присутствуют и подтверждают отсутствие FGF2 у Fgf2
-/- мышей (Fig. 2B), чтобы определить ядерное и/или цитоплазматическое распределение FGF2 в эпикарде, миокарде и коронарных сосудах дикого типа сердца плода на E18.5 беременности. Эти данные демонстрируют, что FGF2 преимущественно находится в ядрах эпикарда (Fig. 3O,P, arrow). В компактном миокарде FGF2 преимущественно присутствует в цитоплазме (Fig. 3P, asterisk). Более того, средняя оболочка коронарных сосудов и EPDC, которые присутствуют в вентрикулярном миокарде, оба обнаруживают ядерное окрашивание на FGF2 (Fig. 3P, arrowheads). Эти данные подтверждают intracrine функцию FGF2 в развитии эпикарда, EPDC и коронарных сосудов, и указывают на потребность в паракринной или аутокринной передаче сигналов FGF2 для пролиферации и дифференцировки миокарда. Эти данные согласуются с предыдущей информацией о функции FGF2 в развитии эпикарда, миокарда и коронарных сосудов. Однако было бы важно подтвердить качественные особенности этих дифференциально локализующихся изоформ в исследованиях с использованием FGF2 изоформ-специфичных нокаутных модельных мышей.
FGF2 ISOFORMS IN AORTIC ARCH ARTERY DEVELOPMENT
Обработка экзогенным рекомбинантным FGF2 усиливает ангиогенез и артериогенез у животных моделей закупорки периферических артерий (Baffour et al.,[1992]; Bush et al.,[1998]). Повышенная экспрессия FGF2 ассоциирует с растущими и вновь сформированными микрососудистыми сегментами в или вокруг ишемической ткани (Walgenbach et al.,[1995]; Bush et al.,[1998]). Следовательно, FGF2участвует в росте и ремоделировании сосудов. Исследования мышей Fgf2-/- подчеркивают важную роль FGF2 в контроле сосудистого тонуса (tone) у взрослых мышей (Zhou et al.,[1998]). Кроме того, описаны intracrine и autocrine функции избыточно экспрессируемых FGF2 белковых изоформ в сосудистых SMCу мышей (Davis et al.,[1997]). Ядерная экспрессия FGF2 в кровеносных сосудах ранее была описана в сердечно-сосудистой ткани взрослых коров (Kardami and Fandrich,[1989]). Однако иммуногистохимическая локализация в развивающемся сердце крыс выявила цитоплазматическое окрашивание FGF2 в SMC сосудистой стенки аорты (Spirito et al.,[1991]). Итак, хотя эти исследования подтверждают, что FGF2 важен для развития аортальных дуг артериальной системы, четкого понимания субклеточного распределения LMW и HMW FGF2 ещё не получено. Недавние исследования в нашей лаб. установили, что ядерный FGF2 превалирует в SMC сосудистых стенок аортальных дуг у E18.5 эмбрионов (Fig. 3Q-S). Более того, такое ядерное окрашивание становится менее интенсивным в сосудистом эндотелии (Fig. 3R, arrow). Итак, эти данные находятся в согласии с известной функцией FGF2 в сосудистых SMC у взрослых различных экспериментальных моделей и наблюдаемая преимущественно ядерная локализация FGF2 указывает на важность функций HMW FGF2 в развитии и ремоделировании крупных сосудов.
IMPORTANCE OF FGF2 LMW AND HMW ISOFORMS IN ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY AND CARDIOPROTECTION
Миокардиальные ischemia-reperfusion (I-R) повреждения представляют собой основную клиническую проблему, ассоциированную с кардиальной дисфункцией, аритмиями и необратимыми повреждениями кардиомиоцитов (Dhalla et al.,[2000]). Имеются достоверные экспериментальные доказательства. что ростовые факторы, в частности fibroblast growth factors (FGF), оказывают долговременный кардиозащитный эффект благодаря своим ангиогенным свойствам (Frelin et al.,[2000]). Доказательства также указывают на то, что ростовые факторы, включая FGF2, могут остро защищать сердце от I-R повреждений независимо от их сосудистого действия (Padua et al.,[1995]; Cuevas et al.,[1997b]; Wang et al., 2000; House et al.,[2003]; Molin and Post,[2007]; Nishijima et al.,[2007]). FGF2 защищает сердце от I-R повреждений, как было продемонстрировано на примере улучшения пост-ишемической кардиальной функции и уменьшения инфаркта миокарда (MI; Unger et al.,[1994]; Padua et al.,[1995],[1998]; Hasdai et al.,[1997]; Horrigan et al.,[1999]; Cuevas et al.,[2000]; Dhalla et al.,[2000]; Sheikh et al.,[2001]; House et al.,[2003]). Сегодня роли LMW и HMW FGF2 изоформ в I-R повреждениях и кардиозащите ещё предстоит вычленить. Понимание биологических функций индивидуальных изоформ FGF2 в кардиозащите имеет большое клиническое значение и может привести к разработке новой фармакологической и генной терапии при ишемической болезни сердца.
Имеются доказательства, что изоформа LMW FGF2 участвует в кардиальных (Unger et al.,[1994]; Padua et al.,[1995],[1998]; Hasdai et al.,[1997]; Horrigan et al.,[1999]; Cuevas et al.,[2000]; Sheikh et al.,[2001]; Liao et al.,[2007b]), почечных(Villanueva et al.,[2006]), кишечных (Fu et al.,[2003]) и церебральных (Jiang et al.,[1996]; Cheung et al.,[2000]; Zhang et al.,[2005]) I-R повреждениях. Эти действия FGF2 LMW изоформы могут использовать, но не обязательны, для ангиогенной активности. У кроликов, моделирующих перманентную закупорку коронарной артерии, внутрикоронарные инъекции рекомбинантной LMW FGF2 уменьшают размеры инфаркта, это ассоциирует с увеличением плотности миокардиальных капилляров спустя неделю после инфаркта (Horrigan et al.,[1999]). Экзогенная обработка LMW изоформой увеличивает плотность капилляров и кровоток в ишемичном миокарде посредством роста новых коллатеральных сосудов (Unger et al.,[1994]) и индуцирует нефрогенные белки после острой ишемической недостаточности (Villanueva et al.,[2006]). В головном мозге, экзогенное воздействие FGF2 LMW изоформой смягчает повреждения головного мозга вследствие глобальной ишемии и reperfusion путем негативной регуляции экспрессии воспалительных факторов и ингибирования их активностей (Zhang et al.,[2005]). В изолированных моделях сердца взрослых крыс и мышей рекомбинантная крысиная FGF2 LMW изоформа, вводимая с помощью ретроградной перфузии, защищает сердце от последующей I-R-индуцируемой контрактильной дисфункции и повреждений миокардиальных клеток и сохраняет кардиальных энергетический метаболизм (Padua et al.,[1995]). Кроме того FGF2 LMW изоформа защищает культивируемые неонатальные кардиомиоциты от H2O2- индуцированных повреждений и гибели клеток (Cuevas et al.,[1997a]; Padua et al.,[1998]; Sheikh et al.,[2001]). Мышиные модели с избыточной экспрессией крысиной FGF2 LMW изоформы (Sheikh et al.,[2001]) или лишенные (Liao et al.,[2007b]) мышиной LMW изоформы демонстрируют её важность для кардиозащиты против I-R повреждений. В нашей лаб. продемонстрировано, что FGF2 LMW изоформа предпочтительна для защиты сердца от дисфункции миокарда, тогда как FGF2 HMW изоформы играют повреждающую роль в отношении защиты сердца от дисфункции миокарда после глобального, low-flow I-R повреждения (Liao et al.,[2007a],[b]; unpublished data, Fig. 4). Однако и LMW и HMW FGF2 изоформы необходимы для защиты сердца от повреждения/гибели миокардиальных клеток (Liao et al.,[2007a],[b]; and unpublished data). Эти эффекты FGF2 изоформ при I-R повреждения не зависят от ангиогенной активности этого ростового фактора (Liao et al.,[2007a],[b]; and unpublished data).
Реперфузия ишемического миокарда, необходимая для восстановления функции, также добавляет риск, т.к. она ассоциирует с усилением клеточных повреждений и гибели (Gross and Auchampach,[2007]). Факторы, которые могут уменьшать повреждения во время развития MI и во время реперфузии привлекают много внимания клиницистов (Garcia-Dorado et al.,[2006]; Hausenloy and Yellon,[2006]). Исследования in vivo показали, что FGF2 LMW изоформа, инъецированная в левый желудочек крыс после коронарной закупорки, осуществляет важную защиту от потери ткани и контрактильной дисфункции (Jiang et al.,[2002]). Более того, исследование ex vivo также продемонстрировало, что перфузия с рекомбинантной FGF2 LMW изоформой крыс во время реперфузии вызывает значительное улучшение восстановления контрактильности и редуцирует апоптическую клеточную гибель (Jiang et al.,[2004]).
Некоторые предполагаемые механизмы могут вести к защитному эффекту FGF2 LMW изоформы от I-R повреждения. Предполагается. что FGF2 LMW изоформой обеспечиваемая кардиопротекция нуждается в активации FGFR1. Напр., Jiang and colleagues (Jiang et al.,[2002]) показали, что кардиопротекция в результате экзогенной обработки рекомбинантным крысиным LMW FGF2 сердца крыс во время I-R повреждений использует активацию FGFR1. Наши неопубликованные данные показали, что LMW изоформа высвобождается из сердца во время I-R повреждения и осуществляет защиту путем взаимодействия с FGFR1. В нашем исследовании FGFR ингибитор (PD173074) вызывает существенное снижение функции пост-ишемического сердца как у дикого типа, так и FGF2 HMW KO (присутствует только LMW изоформа) мышей. Роль человеческого миокардиального FGFR4 в I-R повреждении и в кардиопротекции предстоит выяснить.
Существуют три основых пути сигнальной трансдукции FGF, включая PLC/PKC, Ras-Raf-MEK-MAP киназу и PI3K/Akt, которые ингибируются за счет активации FGFR (Friesel and Maciag,[1995]; Bikfalvi et al.,[1997]; Padua et al.,[1998]; House et al.,[2007]). Избыточная экспрессия изоформы FGF2 LMW крыс увеличивает ассоциированную с мембраной PKC и ассоциированную с цитозолем PKC (Sheikh et al.,[2001]), это, как ожидается, обеспечивает кардиопротекцию. Нами показано, что FGF2-обеспечиваемая кардиопротекция (посредством кардио-специфической избыточной экспрессии гена Fgf2 человека) обеспечивается за счет PKC-зависимого пути и что PKC и MAPK сигнальные каскады интегрально соединены с нижестоящим FGF2 (House et al.,[2007]). Chelerythrine блокирует защитный эффект, когда экзогенная рекомбинантная крысиная FGF2 LMW изоформа применяется к изолированному сердцу (Padua et al.,[1998]) или кардиомиоцитам (Jiang et al.,[2002]). Находки нашей лаб. также демонстрируют, что FGF2 осуществляет свой кардиозащитный эффект против пост-ишемической кардиальной дисфункции и инфаркта миокарда путем активации ERK и инактивации p38 (House et al.,[2005]). В частности путь ERK участвует в FGF2 LMW изоформой осуществляемой кардиопротекции, действуя в качестве вышестоящего активатора PKC (Sheikh et al.,[2001]). Более того, доказательства из нашей лаб. показывают, что эндогенное устранение FGF2 LMW изоформы приводит к слабому восстановлению кардиальной функции после ischemia-reperfusion повреждения, а защитный эффект, осуществляемый с помощью LMW изоформы FGF2 использует инактивацию MKK7/JNK/c-Jun пути (Liao et al.,[2007b]). Кроме того, экзогенное применение рекомбинантной крысиной FGF2 LMW изоформы вызывает гипер-фосфорилирование connexin (Cx)-43 in vitro (Doble et al.,[1996],[2004]), а во взрослом perfused сердце (Srisakuldee et al.,[2006]) посредством пути PKC. Измененная локализация Cx-43 из щелевых соединений в митохондрии и общая редукция уровней Cx-43 являются распространенными признаками ишемической болезни сердца (Smith et al.,[1991]; Peters and Wit,[2000]). FGF2 LMW изоформа вызывает снижение митохондриального сцепления посредством фосфорилирования Cx-43 (Doble et al.,[1996]). Применение рекомбинантной крысиной или человеческой FGF2 LMW изоформы во время реперфузии также может активировать некоторые внутриклеточные сигналы (PKC, ERK, Akt), которые, как ожидается, оказывают благоприятные эффекты (Horrigan et al.,[1999]).
Не было прямых доказательств, подтверждающих участие FGF2 HMW изоформ в I-R в повреждениях до недавнего времени, когда группа Kardami (Jiang et al.,[2007]) показала, что инъекции в миокард рекомбинантной крысиной 23-kDa FGF2 HMW изоформы вызывает улучшение кардиальной функции и уменьшение размеров инфаркта миокарда спустя 24 часта после MI; однако спустя 7-8 недель после MI улучшение кардиальной функции и уменьшение размеров миокардиального инфаркта исчезали возможно из-за пост-ишемического гипертрофического эффекта FGF2 HMW iизоформ. И всё же роль эндогенных FGF2 HMW изоформ в I-R повреждениях не была выяснена. Данные нашей лаб. указывают на то, что мыши, лишенные эндогенных FGF2 HMW изоформ обнаруживают достоверное улучшение пост-ишемической кардиальной функции после I-R повреждения (unpublished data, Fig. 4). Напротив, мы показали, что у мышей, избыточно экспрессирующих 24-kDa человеческую FGF2 HMW изоформу, пост-ишемическая кардиальная функция достоверно снижается после I-R повреждения (unpublished data, Fig. 4). Во время кардиальной I-R, изоформа LMW обнаруживается в коронарном токе, тогда как HMW изоформы не высвобождаются сердцем. Итак, наши доказательства показывают, что FGF2 HMW изоформы оказывают повреждающий эффект при кардиальном I-R повреждении. Более того, недавние доказательства подтвердили, что FGF2 HMW может быть токсичным за счет увеличения высвобождения cytochrome C и уровней Bax, проапоптического белка, в клетках эмбриональных почек человека (Ma et al.,[2007]).
Болезнь коронарных артерий является главной причиной смертности в США и др. индустриальных странах (Association,[2007]). Недавние исследования показали возможность новых терапевтических подходов для защиты сердца от I-R повреждений, которые базируются на стимуляции роста коллатеральных кровеносных сосудов посредством FGF2 (Sellke et al.,[1998]; Laham et al.,[1999]; Rajanayagam et al.,[2000]; Udelson et al.,[2000]; Unger et al.,[2000]; Post et al.,[2001]; Simons et al.,[2002]). Современные клинические испытания используют рекомбинантную человеческую FGF2 (только LMW изоформу ) для лечения болезни коронарных артерий (Sellke et al.,[1998]; Laham et al.,[1999],[2000]; Udelson et al.,[2000]; Simons et al.,[2002]). Эти исследования оценили пригодность ангиогенных свойств FGF2 для лечения пациентов с коронарной болезнью сердца. Большинство законченных исследований было сфокусировано на проверке безопасности и эффективности FGF2 у пациентов с болезнью коронарных артерий (Sellke et al.,[1998]; Laham et al.,[1999],[2000]; Udelson et al.,[2000]). При лечении пациентов из группы FGF2 не отмечалось грудной жабы (angina) в течение 3-х мес. после коронарного шунтирования, тогда как в placebo гоуппе наблюдались повторные грудные жабы (Sellke et al.,[1998]; Laham et al.,[1999]). Эти эффекты зависели от дозы по сравнению с placebo-контролируемой группой (Laham et al.,[1999]). Дальнейшие исследования показали, что доставка FGF2 приводит к ослаблению индуцируемой стрессами ишемии и к улучшению остаточных миокардиальных perfusion повреждений спустя 180 дней после лечения (Udelson et al.,[2000]), но с зависимым от дозы гипертензивным эффектом (Udelson et al.,[2000]). Однако недавнее исследование оказалось неспособным подтвердить улучшение кардиальной функции после упражнений (Simons et al.,[2002]), указывая тем самым на несовместимость эффективности и потенциальных побочных эффектов FGF2. Хронические ангиогенные эффекты FGF2 являются осуществимой терапией для пациентов с коронарной болезнью сердца и подобное лечение может быть даже использовано у пациентов с риском болезни коронарных артерий. Однако, когда пациент находится в состоянии острого ишемического события, то ангиогенный эффект FGF2 не является непосредственным. Следовательно, не ангиогенное кардиозащитное действие FGF2 также является критическим для его потенциальной терапевтической оценки у пациентов с острой ишемией сердца.
FGF2 ISOFORMS IN CARDIAC HYPERTROPHY
Известна роль FGF2 в гипертрофической реакции в сердце с тех пор, как было отмечено, что FGF2 может позитивно регулировать белки, соответствующие тем, что индуцируются при повышенной гемодинамической нагрузке (Parker et al.,[1990]). У крыс, моделирующих гипертрофию после перевязки аорты, и FGF2 и FGFR-1 обнаруживали усиление активности (Hellman et al.,[2008]). Сходным образом мыши, моделирующие гипертрофию из-за повышенного давления, обнаруживали увеличение мРНК Fgf2 (Spruill et al.,[2008]). Такая позитивная регуляция FGF2 подтверждена также у людей в исследованиях, изучавших уровни мРНК у пациентов с гипертрофией желудочков (He et al.,[2005]). Зависимость вызываемой давлением гипертрофии от FGF2 подтверждена в нашей лаб., где было показано, что модельные мыши с отсутствием гена Fgf2 , подвергающиеся действию повышенного давления за счет коарктации аорты, обнаруживали пониженную гипертрофическую реакцию (Schultz et al.,[1999]). В дополнение к давлением индуцированной гипертрофии биохимические сигналы, ассоциированные с гипертрофией, также усиливали продукцию FGF2, с наивысшими уровнями FGF2 белка и мРНК, обнаруживаемыми у крыс, которым инъецировали высокие дозы isoproterenol (Padua and Kardami,[1993]). Кроме того, angiotensin II оказывается неспособным индуцировать компенсаторную гипертрофию у мышей, лишенных FGF2 (Pellieux et al.,[2001]).
Большинство из этих исследований, хотя и подтверждают роль FGF2's в гипертрофии, но не делают отличий между ролью индивидуальных изоформ FGF2.
In vitro исследования кардиомиоцитов новорожденных показали, что избыточная экспрессия как LMW, так и HMW FGF2 изоформ увеличивала пролиферацию клеток, но избыточная экспрессия только FGF2 HMW изоформ вызывала независимые от binucleation FGFR пути, возможно за счет непосредственного воздействия на структуру хроматина (Pasumarthi et al.,[1996]; Sun et al.,[2001]). Экспрессия FGF2 LMW изоформы активируется в сердцах, подверженных гемодинамическим стрессам и и последующей гипертрофии (Kardami et al.,[2004]; House,[2005]). Применение рекомбинантной человеческой FGF2 LMW изоформы к вентрикулярным миоцитам вызывает гипертрофию в отсутствие механических стрессов (Kaye et al.,[1996]) и реактивацию фетальных форм контрактильных белков (Parker et al.,[1990]). Данные также показывают, что избыточная экспрессия HMW FGF2 в линии клеток NIH-3T3 может стимулировать продукцию IL-6 цитокинов (Delrieu et al.,[1998]), которые могут обеспечивать гипертрофическую реакцию (Molkentin and Dorn,[2001]), с соотв. подавлением IL-6 за счет применения LMW FGF2. Более того данные Kardami and colleagues (Kardami et al.,[2004]) указывают на то, что гипертрофия сердца единственно ассоциирует с HMW FGF2, а не с 18-kDa LMW изоформой, т.к. применение одной только HMW FGF2 изоформы вызывает 40% увеличение размеров культивируемых миоцитов крыс. Кроме того, группа Kardami (Jiang et al.,[2007]) установила, что подвергнутые воздействию сердца крыс, которые подверглись перевязке левой коронарной артерии, экзогенных HMW and LMW FGF2 изоформ, продемонстрировали, что высокого, но не низкого мол. веса изоформы FGF2 ответственны за гипертрофическое ремоделирование после MI. Напротив, применение LMW FGF2 не вызывает увеличения синтеза клеточных белков или соотношения массы left ventricular (LV) к массе тела, но вносит вклад в увеличение плотности мелких сосудов в сердце после MI. В этом исследовании были также рассмотрены потенциальные пути HMW FGF2-усиления кардиальной гипертрофии, путем изучения про-гипертрофических цитокинов семейства IL-6. Было установлено, что cardiotrophin-1 и gp130, оба участвующие в гипертрофической реакции, обнаруживаются на высоких уровнях во всех компартментах сердца, где применялся HMW FGF2 (Aoyama et al.,[2000]; Freed et al.,[2003]). Наши данные (unpublished) согласуются с полученными группой Kardami, что не происходит спонтанной кардиальной гипертрофии, наблюдаемой в FGF2 HMW KO сердцах (присутствует только эндогенная LMW FGF2 изоформа). Интересно, что наши исследования (unpublished) использовали не ишемические 24-kDa HMW Tg сердца, чтобы продемонстрировать отсутствие спонтанного роста сердца, показали, что ни мышиная FGF2 LMW изоформа. ни человеческая FGF2 24-kDa HMW изоформа не вызывают спонтанной гипертрофии у наших модельных мышей. Эта несогласованность с эффектом FGF2 HMW изоформ на кардиальную гипертрофию может быть обусловлена различиями в моделях. В исследованиях Kardami and investigators (Kardami et al.,[2004]; Jiang et al.,[2007]), FGF2 HMW изоформы вводились экзогенно в короткий период (дни) в кардиомиоциты или в целое сердце, тогда как у наших модельных мышей человеческая 24-kDa FGF2 HMW изоформа хронически избыточно экспрессировалась с рождения. Наблюдаемые различия могут быть обусловлены или временным отрезком, когда производились измерения, или различиями между экзогенным воздействием и эндогенной активностью. Поскольку HMW FGF2 изоформы и FGF2 LMW изоформа связываются heparan со сходным сродством, то возможно, что экзогенно применяемые FGF2 HMW изоформы могут действовать посредством paracrine/autocrine способа действия на FGFR, тогда как FGF2 HMW изоформы избыточно экспрессируемые эндогенно работают только intracrine способом. Эти находки могут также указывать на то, что др. факторы роста, отсутствующие
in vitro системе, такие как TGF (Schultz et al.,[2002]; Azhar et al.,[2003]), могут обеспечивать гипертрофическую реакцию
in vivo, или. что гипертрофия не запускается в миокарде до тех пор, пока ишемия или гипоксия не активирует высвобождение ростовых факторов и передачу гипертрофических сигналов (Speir et al.,[1992]). Стимулы, с помощью которых HMW FGF2 индуцирует гипертрофию неясны. Кроме того, точный механизм, с помощью которого FGF2 HMW изоформы способны стимулировать позитивную регуляцию про-гипертрофических цитокинов, как предполагается, являются intracrine, из-за ядерной локализации изоформ, но которые пока не определены.
ROLES OF FGF2 ISOFORMS IN VASCULAR ALTERATION AND ANGIOGENESIS
Процесс ангиогенеза, при котором новые кровеносные сосуды образуются из предсуществующих сосудов с помощью процесса пролиферации и миграции эндотелиальных и сосудистых гладкомышечных клеток рассматривается как способ реваскуляризации больного и инфарктного сердца неинвазивным способом (Yanagisawa-Miwa et al.,[1992]; Unger et al.,[1994]). Т. к. FGF2 является известным активатором миграции мезодремы (Montesano et al.,[1986]) и ангиогенеза, то он считается одним из главных усиливающих факторов при раке человека. i
Ранние in vitro исследования избыточной экспрессии человеческих FGF2 изоформ в культивируемых аортальных эндотелиальных клетках начали выяснять различные роли LMW FGF2 и HMW FGF2 в ангиогенезе и васкулогенезе (Davis et al.,[1997]). Т.к. все FGF2 изоформы усиливают ДНК синтез, то ядерные FGF2 (предположительно HMW) изоформы делают это в большей степени, это указывает на их роль в пролиферации эндотелия. Хотя преимущественно цитозольная, секретируемая LMW изоформа ответственна за усиленный рост эндотелиальных клеток, intracrine-действующие (HMW) изоформы были способны амплифицировать пролиферативные эффекты др. факторов роста, включая PDGF и vascular endothelial growth factor. Группа Levin (Piotrowicz et al.,[2001]) расширила эти находки, обнаружив, что различные N-терминальные расширения обнаруживаются исключительно в FGF2 HMW изоформах и ингибируют миграцию, тогда как домены общие всем FGF2 изоформам стимулируют рост. Эта находка была подтверждена in vivo, где экспрессия укороченной формы HMW (24 kDa человека) FGF2 , сохранившей только свои 86 N-терминальных аминокислот ингибировала опухолевый рост перед сосудистой инфильтрацией, а также и саму васкуляризацию опухоли, но не хемотаксис иммунных клеток (Levin et al.,[2004]). Кроме того, случайное появление LMW FGF2 в ядре было отслежено по C-терминальной последовательности, которая, как предполагается, взаимодействует с оставшейся неметилированной частью N-конца этой изоформы (Foletti et al.,[2003]). Т.о., все FGF2 изоформы оказываются кандидатами на роль модуляторов транскрипционной активности.
Технология ДНК микромассивов была использована для изучения изменений в генной транскрипции, подстегиваемой экспрессией или LMW или HMW FGF2 в клонах линии эндотелиальных клеток (Quarto et al.,[2005]). LMW FGF2, как и ожидалось, увеличивала уровни транскриптов VEGF-независимых ангиогенных маркеров RPS5 и ANGPT1-4. Однако, HMW FGF2 увеличивал транскрипцию маркера остановки роста NF1X и опухолевого супрессора ST5, в то же время снижая пролиферативные маркеры PCNA и Egr1 и маркер рибосомальной активности MAPK6. Результаты исследования указывают на то, что , по крайней мере, при базовых условиях intracrine эффекты HMW FGF2 могут супрессировать ангиогенные сигналы до тех пор, пока не будут перекрыты доминантными, рецепторами-обусловленными, autocrine/paracrine LMW FGF2 пролиферативными сигналами.
Исследования передачи сигналов FGF2, индуцируемых эстрогеном, предоставили важную информацию о роли FGF2 изоформ в миграторном и пролиферативном компонентах ангиогенеза. Estradiol (E2) , как известно, стимулирует передачу сосудистых MAPK сигналов in vitro посредством FGF2 аутокринной петли (Kim-Schulze et al.,[1998]). Используя культивируемые эндотелиальные клетки, полученные от Fgf2 KO (все FGF2 изоформы устранены) и LMW FGF2 изоформы KO (присутствуют только HMW изоформы) модельных мышей, полученных группой Doetschman, группой Arnal(Garmy-Susini et al.,[2004]) показали, что активация интактных FGF2 HMW изоформ с помощью E2 способствует клеточной миграции в культуре независимо от экспрессии LMW FGF2. С др. стороны, синтез ДНК может быть индуцирован с помощью E2, но индуцировался с помощью экзогенной рекомбинантной LMW FGF2 изоформы, как в Fgf2 KO, так и LMW KO клетках, подтверждая, что LMW FGF2 необходима для E2-зависимой пролиферации, наблюдаемой в эндотелиальных клетках дикого типа. Передача сигналов посредством эстрогенных рецепторов сопровождается переключением на экспрессию преимущественно FGF2 белковой изоформы с LMW га HMW, в противовес 2.5-кратоному снижению экспрессии FGF2 мРНК, вообще то за счет увеличения опоры на элементы 3' нетранслируемой области для трансляции с вышестоящего CUG сайта. Estrogen также повышает экспрессию рецепторов высокого сродства FGFR1IIIc , чья последующая потеря не влияет на миграцию клеток, указывая тем самым на возможность измененной реакции на внеклеточную LMW FGF2 изоформу. Ранее неизвестный FGF2-взаимодействующий фактор был идентифицирован в этом исследовании, он активировался с помощью передачи сигналов эстрогенового рецептора и необходим для ядерных эффектов оставшихся FGF2 HMW изоформ у LMW KO мышей. Итак, эти результаты согласуются с потребностью для всех белковых изоформ FGF2 для estrogen-зависимого ангиогенеза.
Противоречивые доказательства относительно синергичных и антагонистических действий LMW и HMW FGF2 изоформ пробуждают интерес к пространственно-временному профилю ангиогенных действий FGF2. Более того, предыдущие модели не рассматривались непосредственно в контексте тканевых повреждений. таких как те, что встречаются во время атеросклероза и MI. Т.о., in vivo модель периваскулярных электрических повреждений была использована совместно с реципрокными трансплантациями костного мозга, затрагивающих Fgf2 KO (все изоформы устранены) и дикого типа мышей. Группа Arnal (Fontaine et al.,[2006]) установила, что экспрессия гена Fgf2 нуждается в костном мозге, но не в остальной части животного, для репарации сосудов. Более того, они установили, что передача сигналов эстрогена увеличивает экспрессию всех FGF2 белковых изоформ в костном мозге, но только HMW FGF2 в происходящих из аорты эндотелиальных клетках, культивируемых от мышей. Эти находки указывают на то, что экспрессия FGF2 клетками эндотелиальных предшественников из костного мозга ответственна за формирование новых сосудов, тогда как FGF2 в поврежденных или находящихся под стрессом сосудах может способствовать рекрутированию предшественников. Кроме того, группа Pintucci group (Yu et al.,[2008]) продемонстрировала расщепление HMW FGF2 с помощью thrombin до LMW-подобной формы с коротким N-терминальным расширением, ELF-2. Стимулирование миграции и пролиферации эндотелиальных клеток с помощью ELF-2 подтверждает возможность механизма рекрутирования, обеспечиваемого FGF2 HMW изоформой.
Находки, связанные с действием FGF2 изоформ в контексте рака, также могут предоставить информацию о разработке эффективных методов для индукции репаративной ангиогенной активности на фоне сердечно-сосудистых нарушений. В чувствительных к эстрогену опухолях гипофиза сосудистые каналы увеличиваются в количестве и в диаметре после 20 дневного воздействия эстрогеном, соизмеримо с экспрессией LMW FGF2 и локализацией FGF2 в митохондриях и эухроматине в гипофизарных lactotrophs и gonadotrophs (Mukdsi et al.,[2006]). Предполагаемый механизм FGF2 в этой модели, включая клеточные коммуникационные петли, использует Src kinase, Ras-p21, MAPK-p44/42 и cFos, которые поддерживают lactotroph фенотип, может также участвовать в коммуникациях между эндотелиальными и сосудистыми гладкомышечными клетками. Недавние исследования, в которых трансфицировали линию меланомных клеток человека, трансфицированных векторами, кодирующими только LMW FGF2 или все FGF2 изоформы и использовали в качестве трансплантатов опухоли, показали повышенную плотность и более мелкий диаметр опухолевой васкулатуры, приписываемые LMW FGF2 в одной из клеточных линий (Fontijn et al.,[2007]). Однако экспрессия некоторых HMW изоформ оказывается возможной в LMW-трансфицированных клонах. Различия между клеточными линиями могут отражать зависимость действия FGF2 изоформ от общего профиля генной экспрессии, включая уровни др. ростовых факторов, которые могут коррелировать с региональными физиологическими различиями в сосудистой экспрессии FGF2 изоформ и их ангиогенных эффектов.
PERSPECTIVES ON FGF2 ISOFORMS IN THE CARDIOVASCULAR SYSTEM
Several investigators have independently produced Fgf2 knockout mice (Zhou,[1997]; Dono et al.,[1998b]; Ortega et al., 1998). These mice have revealed important roles of FGF2 in cardiac hypertrophy (Schultz et al.,[1999]), I-R injury and myocardial infarction (House et al.,[2003]; Kardami et al.,[2007]), neuronal regeneration (Vaccarino et al.,[1999]), bone development and remodeling (Coffin et al.,[1995]; Montero et al.,[2000]), and vascular remodeling and vascular tone control (Zhou et al.,[1998]). FGF2 has the potential to be a powerful molecular therapeutic tool in the treatment of cardiovascular disease. Although FGF2 has been a candidate for treatment of ischemic heart disease for some time, clinical trials using FGF2 for gene therapy have been disappointing (Simons et al.,[2002]; Syed et al.,[2004]). The discovery of multiple isoforms of this growth factor has opened the possibility of therapeutic strategies that take advantage of the individual actions of each isoform to treat various cardiovascular diseases with regional or end-organ effects in mind. Exercise and statin treatments are regularly used in the management of cardiovascular disease, particularly in atherosclerosis. The proposal of the Arnal group (Fontaine et al.,[2006]), that the estrogen signaling-based induction of FGF2 may apply to other stressors or mitigants of stress, should be explored. Particular attention should be paid to addressing the roles that individual FGF2 isoforms may play in each context. Clearly, a better understanding of isoform-specific function of FGF2 in cardiovascular development and adult physiology will provide useful information that would be helpful in further advancing the field and realizing its clinical benefits.
This review provides evidence that the FGF2 LMW isoform and HMW isoforms have opposing roles in I-R injury and cardioprotection, which may be a reason that several ongoing clinical trials do not observe a sustained improvement in cardiac function (Sellke et al.,[1998]; Laham et al.,[1999],[2000]; Udelson et al.,[2000]; Simons et al.,[2002]). Most of the studies ignore the presence of the endogenous FGF2 HMW isoforms, which may counteract the beneficial role of the administered FGF2 LMW isoform. Also, a significant limiting factor to clinical trials on the safety and efficacy of FGF2 has been the inability to stably deliver any HMW isoform directly to patients. The development of noncleavable human recombinant HMW FGF2 with isoform specificity and nuclear delivery could provide some insight into the role of this isoform in cardiovascular protection. Additionally, further study of the thrombin-cleaved form of HMW FGF2, ELF-2, could help to delineate the dynamic effects of FGF2 isoforms. The apparent paradox of context-dependent synergy and antagonism between LMW and HMW FGF2 could also be clarified by exploring both acute and chronic changes in gene expression upon introduction of FGF2 isoform overexpression, particularly with regard to the presence and absence of the nuclear FGF2 interacting factor. If a therapy can harness the beneficial effects of both isoforms, it will produce greater cardioprotection. Furthermore, the inhibitor of FGFR (PD173074), which demonstrated that FGFR1 is necessary for LMW-induced postischemic recovery of cardiac function, is currently being evaluated in a clinical trial for cancer treatment (Sessa et al.,[2006]). However, potential actions of the inhibitor in the cardiovascular system, particularly abrogation of the cardioprotective effects of FGF2, needs to be taken into consideration when considering its usage in cancer treatment. Similarly, it is necessary to consider and account for the cardiovascular effects of both FGF2 LMW and HMW isoforms to develop effective therapies for treating ischemic heart disease.
Finally, development of novel mouse models with targeted ablation and transgenic overexpression of LMW and HMW isoforms of FGF2 have provided new avenues for determining the in vivo developmental and physiological function of these isoforms in the cardiovascular and other systems. Overexpression of human FGF2 isoforms on a murine Fgf2 KO background, as previously proposed (Davis et al.,[1997]), would likely yield great insight into isoform function without the mitigating factor of endogenous expression. Inducible and/or knockin models may represent direct approaches to delineating and differentiating acute and chronic FGF2 isoform effects.
Сайт создан в системе
uCoz