C момента рождения (транскрипция) и до могилы (распад РНК), мРНК взаимодействует со многими разными RNA-binding proteins (RBPs). Эти RBPs выполняют ключевые роли в посттранскрипционной регуляции генной экспрессии (Burd and Dreyfuss 1994), такой как контроль качества РНК, ядерный экспорт и цитоплазматическая локализация, а также случайная трансляция и распад. Кстати, несколько разных типов РНК-связывающих мотивов было идентифицировано среди разных RBPs (Stefl et al. 2005; Lunde et al. 2007). Эти мотивы позволяют данному RBP взаимодействовать со своими мишенями специфическим образом в клетке. Часто эти RBPs соединяются со своими транскриптами вместе с др. белковыми факторами, чтобы сформировать крупные ribonucleoprotein (RNP) комплексы. RNPs представляют настоящие молекулярные машины, которые осуществляют множественные функции и детерминируют судьбу ассоциированных с ними транскриптов. Важность RBP/мРНК взаимодействия иллюстрируется тем фактом, что некоторые генетические нарушения вызываются аберрантной экспрессией или аномальной функцией RBPs (Burd and Dreyfuss 1994; Lukong et al. 2008)

Инициальное взаимодействие RBP и мРНК мишени происходит одновременно с транскрипцией, по мере роста транскрипта в длину. На этой стадии ключевое взаимодействие RBPs включает сплайс-факторы и exon-junction complex (EJC) , а также РНК шапероны, которые вносят вклад в упаковку РНК во вторичную или третичную структуру (Lorsch 2002). Как только РНК оказывается упакованной, др. RBPs будут присоединяться путем распознавания или специфичной первичной последовательности, определенной структуры или возможно комбинации обеих (Stefl et al. 2005). Мы только начинаем понимать детали, как RBPs специфически распознают свои РНК. Часто индивидуальные RNA-binding domains (RBDs) распознают определенную последовательность лишь с низким сродством. Поскольку любой данный RBP часто содержит несколько отличающихся RBDs, то это предполагает, что эти домены кооперируют, чтобы обеспечить высокую специфичность взаимодействия и биологическую активность RBP. Такая кооперативность может происходить или внутри- или меж-молекулярно. Здесь мы представим примеры обоих типов взаимодействий, которые могут объяснить два важных свойства функции RBP/РНК. Во-первых, RBPs способны связывать свои биологические мишени с высоким сродством, несмотря на тот факт, что их индивидуальные домены обладают только низкой специфичностью. Во-вторых, кооперативность RBDs внутри данного RBP может также объяснить, как RBP может избирательно различать между разными транскриптами в клетке.

Этого контекста касаются два недавних исследования Singer и сотр. (Chao et al. 2010; Patel et al. 2012), которые представляют др. привлекательный механизм того, как RBP могут взаимодействовать со своим грузом РНК. Они изучали zipcode-binding protein (ZBP1/IMP1/IgfIIBP1), который участвует в регуляции мРНК β-actin, первичный транскрипт, как было установлено, локализуется внутри фибробластов и нейронов. Исследователи предположили, что ZBP1 взаимодействует с неупакованной или рыхло свернутой РНК и что это взаимодействие заставляет РНК принимать вторичную структуру путем оборачивания вокруг ZBP1-они назвали это моделью петлеобразования (looping) (see Fig. 1).

Рис. 1

Внутри- и межмолекулярной кооперативности модели RBPs и распознавание ими субстратов. substrate recognition. Shown in the center are unstructured (left center panel) and structured (right center panel) RNAs. (Box 1) In the case of ZBP1, it recognizes an RNA zipcode in the β-actin transcript and binds the RNA via two KH domains forcing a conformational change in the RNA. (Box 2) For Egl and BicD, the RBP Egl recognizes the stem-loop of K10 RNA. Subsequent binding of the dynein adaptor BicD to Egl then increases its affinity for RNA. (Box 3) For She2p and She3p, both proteins cooperate together for ASH1 RNA binding. Proteins are depicted as colored spheres, and RNA is shown as black lines.

A crash course on ZBP1

ZBP1-член высоко консервативного семейства RBPs-играет важные роли в локализации, стабильности и трансляционном контроле клеточных мРНК (Yisraeli 2005). Белок содержит 6 канонических RBDs: два RNA recognition motifs (RRMs) и 4 hnRNP K homology (KH) домена (Ross et al. 1997). Предыдущая работа показала, что KH3 и KH4 (Chao et al. 2010) домены преимущественно обеспечивают распознавание РНК в 54-nucleotide (nt)-long degenerate РНК zipcode последовательности. Мотив этой последовательности первоначально был найден в β-actin мРНК (Kislauskis et al. 1994). ZBP1 KH34 домены связывают последовательность длиной в 28-nt внутри zipcode (Farina et al. 2003), а мультимеризация, по-видимому, не нужна для стабильного распознавания РНК (Chao et al. 2010). Структурные данные IMP1, человеческого гомолога ZBP1, показали, что KH34 домены формируют внутримолекулярный псевдодимер. Такое расположение РНК-связывающих поверхностей KH3 и KH4 на противоположных концах ZBP1 привело исследователей к предположению привлекательной модели, согласно которой два recognition elements (REs) внутри zipcode разделены спейсером. Это позволяет РНК обматываться вокруг ZBP1 и принимать анти-параллельную ориентацию. anti-parallel orientation. Замечание ценно тем, что когда это пространство укорачивается ≥6 nt, то связывание РНК сильно уменьшается. R

A detailed look at RNA binding by ZBP1

В своём новом исследовании Patel et al. (2012) расширили предыдущие исследования из лаб. Singer, сфокусировавшись на 5' и 3' концах β-actin zipcode. Они осуществили эксперименты на полиакриламидном геле методом electrophoretic mobility shift assay (EMSA), чтобы сравнить связывание ZBP1 с дикого типа и мутантной последовательностью РНК. Предыдущая работа показала, что одиночные KH домены часто распознают короткие, ~4-nt участки внутри их РНК мишеней. Хотя был идентифицирован высоко консервативный 5' RE (5RE) (CGGAC), не было отмечено строгой консервации в 3' RE (3RE; C/A-CA-C/U). Благодаря обилию цитозинов 3RE, in vitro SELEX экспериментах (скорее, чем одиночные точковые мутации) было использовано для определения взаимодействия РНК/белок. Ориентация KH34 в отношении РНК была затем определена с использованием nuclear magnetic resonance (NMR) спектроскопии KH34 в комплексе с или 5RE или 3RE. Эти эксперименты предсказали, что KH4 соединяется с 5RE, тогда как KH3 распознает 3RE. Исследования также показали swapped позиции 5RE и 3RE внутри zipcode. Поскольку это новое расположение, как ожидается, д. изменять позицию РНК по отношению к ZBP1 , так, что спейсерная область внутри РНК теперь становится оппозитной к линкерной области KH34, это не влияет на связывание РНК. Это указывает на то, что белковый линкер не осуществляет непосредственного контакта с петлеобразной РНК.

A more general consensus for ZBP1 target mRNAs

Характеристика определенной спейсер-содержащей, двухсоставной RE консенсусной последовательности позволила исследователям предсказать мишень мРНК для ZBP1. Как человеческий, так и мышиный транскриптомы были проанализированы и идентифицированы 114 эволюционно законсервированных мишеней. Хотя предыдущие исследования сообщали о дополнительных мишенях для ZBP1 (see Chao et al. 2010 and references therein; Hafner et al. 2010), этот новый вычислительный метод расширил список потенциальных новых кандидатов РНК для ZBP1. Важность новых кандидатов подчеркивается анализом генной онтологии, который идентифицировал категории с онтогенетическими и морфологическими функциями и специфический акцент был сделан на нейрологических заболеваниях и раке. Фактически, предсказание, что ZBP1 обладает важными функциями во время развития, коррелирует с наблюдениями, что он преимущественно экспрессируется во время раннего эмбриогенеза. Исследователи затем экспериментально верифицировали субнабор потенциальных новых кандидатов путем осуществления иммунопреципитационных экспериментов с ZBP1 в экстрактах эмбрионального головного мозга мышей, с выделением ассоциированных РНК и затем анализировали их концентрации с помощью количественной PCR (qPCR). Соответственно, 17 из 24 тестированных транскриптов, в самом деле, были обогащены более чем в 4 раза в иммунопреципитатах ZBP1. Эти находки подтверждают многосторонний подход исследователей к получению как пространственной информации, так и специфичности последовательностей при идентификации мРНК мишеней для ZBP1.

ZBP1-dependent dendritic targeting of spinophilin mRNA?

Интересно, что одна из идентифицированных мРНК, которая кодирует spinophilin, как полагают, локализуется на дендритах нейронов гиппокампа (Zhong et al. 2006). Когда обе копии ZBP1-связывающих сайтов в последовательностях spinophilin были делетированы из репортерной конструкции, то наблюдалось заметное снижение локализации в дендритах. Более того, исследователи использовали преимущества ZBP1 нокаутных мышей (Z Katz and RH Singer, in prep.) и исследовали, в самом ли деле, затрагивается локализация мРНК spinophilin mRNA в дендритах нейронов у ZBP1-дефицитных мышей. В то время как количество spinophilin мРНК puncta в дендритах снижалось вдвое у нокаутных животных по сравнению с нормой, его локализация в дистальных частях дендритов существенно не изменялась. Исследователи пришли к заключению, что, скорее всего, ZBP1 работает совместно с др. RBPs чтобы доставить мРНК spinophilin в дендриты. Интересный вопрос на будущее, вносит ли вклад ZBP1 в доставку в дендриты или он влияет на стабильность РНК и/или контроль трансляции.

A new form of RNA recognition for an RBP

Patel et al. (2012) идентифицировали новый механизм распознавания РНК груза с помощью RBP-в данном случае, β-actin мРНК с помощью ZBP1. Как указывалось выше, многие RBPs часто содержат множественные копии одного типа RBD, такие как домен KH. Интересно, что ранее сообщалось, что KH домены связывают свои мишени или независимо или кооперативно (Paziewska et al. 2004). Однако современные исследования расширяют наши знания, предоставляя детальную информацию о том, как два KH домена кооперируют в распознавании РНК. Как упоминалось выше, кооперативность может проявляться или внутри RBP (внутримолекулярно) или между несколькими RBPs (межмолекулярно). Примером внутримолекулярной кооперативности являются разные dsRBDs в разных белках, включая Staufen белки (Lunde et al. 2007), или РНК-редактирующие энзимы ADAR1 и ADAR2 (Doyle and Jantsch 2003; Macbeth et al. 2004). Кроме того, два RRMs внутри Drosophila пол детерминирующего белка Sex Lethal работают кооперативно, чтобы детерминировать альтернативный сплайсинг своего собственного транскрипта, а также transformer (Handa et al. 1999). Примером межмолекулярной кооперативности являются, по крайней мере, два выдающихся случая, при которых два разных белка действуют совместно, чтобы распознавать структурные элементы РНК. Первый пример из Drosophila, где два белка кооперируют, чтобы обеспечить высокое сродство распознавания высоко структуированной РНК stem-loop внутри K10 РНК (Dienstbier et al. 2009). Здесь RBP Egalitarian (Egl) распознает локализацию элементов в K10 РНК посредством неидентифицированного RBD (see Fig. 1, inset 2). Связывание dynein кофактора Bicaudal-D (BicD) с Egl затем увеличивает сродство Egl к РНК. Во втором примере, два дрожжевых RBPs, She2p и She3p, оба распознают структуированные REs внутри ASH1 мРНК (Muller et al. 2011). Действуя синергично, они драматически увеличивают специфичность и сродство в связывании структуированной ASH1 РНК (see Fig. 1, inset 3; Muller et al. 2011). Однако значительно менее известно о том, как два She белка связывают свою РНК (Niessing et al. 2004; Muller et al. 2011).

How does RNA recognition work for an unfolded RNA?

В противоположность примерам межмолекулярной кооперативности, описанным выше, где два разных белка распознают элементы структуированной РНК, два тандемных домена KH в ZBP1 распознают короткую, первичную последовательность внутри состоящей из двух частей последовательности неупакованной РНК (Patel et al. 2012). В то время как инициальный контакт одного из KH доменов обладает низким сродством, кооперация между обоими RBDs вызывает высокого сродства распознавание РНК. Идентификация важного спейсерного региона (Chao et al. 2010) не только накладывает дальнейшие ограничения на РНК, но и также делает возможной её структурную конформацию. В то время как несвязанная РНК является неупакованной или флексибельной, связывание её с помощью двух доменов KH в ZBP1 заставляет РНК оборачиваться вокруг белка (Fig. 1, inset 1). Это вызывает ~180° изменение в ориентации РНК, это делает возможным прямой контакт с KH3 и KH4, которые расположены на противоположных сторонах ZBP1 (Chao et al. 2010).

Итак, этот новый способ распознавания РНК с помощью RBP имеет несколько важных значений. Во-первых, единый сайт для одиночного RBD не отражает того, как полной длины RBPs соединяются с и регулируют свои мРНК мишени in vivo. Поэтому наблюдаемая кооперативность KH доменов вместе с новыми пространственными ограничениями РНК, помогают лучше объяснить высокую специфичность сродства распознавания. Во-вторых, как подчеркивается исследователями, знание структурного расположения нескольких RBDs внутри RBP может позволить нам улучшить наше понимание того, как данный RBP различает между разными транскриптами. Недавно Sattler с сотр. (Mackereth et al. 2011) идентифицировали две разные конформации RRM12 в факторе сплайсинга U2AF64. В этом случае сплайсинг модулируется присутствием или отсутствием сильного polypyrimidine трека в субстрате (Mackereth et al. 2011).

В конечном итоге, подход Patel et al. (2012) подготовил почву для выяснения сложных РНК-связывающих специфичностей в будущем. Их данные добавили др. слой в концепцию "RNA signature", которая была недавно предложена (Doyle and Kiebler 2011). Здесь мРНК может рассматриваться как имеющая уникальную сигнатуру из множественных регуляторных элементов как в первичной последовательности, так и на структурных уровнях, которые распознаются определенными транс-действующими факторами или RBPs. С этой РНК-центрической точки зрения РНК, которые рекрутируют различные RBPs, они затем оказываются ответственными за нижестоящие функции; напр., стабильность мРНК, локализацию мРНК, трансляционный контроль и локальный синтез белка среди многих прочих. Следовательно, исследования Patel et al. (2012) добавляют друго динамичный уровень сложности к сигнатуре РНК, они продемонстрировали, что RBP могут модулировать РНК путем вызываемых конформационных изменений. Итак, RBP-в их случае, ZBP1-который является ключевым игроком, действующим на РНК, а не наоборот. Следовательно, было бы интересно посмотреть в будущем и для др. RBPs и RNAs, кто из них водитель и кто пассажир в этом динамическом взаимоотношении.

A zipcode unzipped Michael Doyle and Michael A. Kieblerdoi: 10.1101/gad.184945.111 | Genes & Dev. 2012. 26: 110-113

A zipcode unzipped
Michael Doyle and Michael A. Kiebler
doi: 10.1101/gad.184945.111 | Genes & Dev. 2012. 26: 110-113