Белки в клетках эукариот являются предметом для огромного разнообразия пост-трансляционных модификаций, которые в значительной степени расширяют функциональное разнообразие и динамику протеома. Белки могут быть модифицированы добавлением небольших молекул, таких как фосфатные группы, метильные группы или ацетильные группы, или, обычно лишь временно, определенных белков1-3. Первая такая модификация белка была описана как ubiquitin. Ubiquitin является малым белком, который чрезвычайно хорошо законсервирован среди Eukaryota, но отсутствует в двух др. сверх-царствах Eubacteria и Archaea. Он может быть временно прикреплен к тысячам различных белков.
Сложная ферментативная система катализирует модификацию белков субстратов с помощью ubiquitin, процесса, известного как ubiquitylation (Box 1). Сходным образом, самостоятельные, но эволюционно родственные каскады катализируют прикрепление ubiquitin-like proteins (UBLs) к белкам или др. молекулам4. Т.к. ubiquitin и UBLs обладают одной и той же трехмерной стержневой структурой - β-grasp складка - то ясно, что разные системы UBL-модификаций имеют общего родоначальника.
В первые несколько декад после открытия ubiquitin в 1975, эволюционные предшественники ubiquitin-conjugation системы оставались в основном неизвестными. Ubiquitin сам по себе рассматривается как один из наиболее высоко законсервированных белков эукариот5, но до сих пор алгоритмы сравнения последовательностей были недостаточно чувствительны для детекции каких-либо бактериальных белков со сходными аминокислотными последовательностями. Эта ситуация существенно изменилась в последние несколько лет. Во-первых, методы сравнения последовательностей стали более утонченными, открыв неожиданное сходство между компонентами ubiquitin-пути (включая ubiquitin) и различными бактериальными белками6. Во-вторых, детерминация структур показала, что ubiquitin-подобная складка образуется многими эукариотическими и прокариотическими белками (или их доменами), даже если сходство аминокислотных последовательностей с ubiquitin минимально. В-третьих, механистический анализ биосинтеза вторичных метаболитов и кофакторов энзимов, таких как thiamine (витамин B1) у прокариот, открыл параллели с активацией и конъюгацией UBLs7. Итак, эти исследования показали, что ubiquitin система была собрана ('cobbled together') из разных предсуществующих частей и путей, которые уже подверглись значительному разнообразию у прокариот1, 6.
Разнообразие процессов, регулируемых с помощью ubiquitin-белок модификаций, экстраординарно4, 8 и последствия модификаций зависят от того будет ли ubiquitin прикреплен к белку как мономер или как polyubiquitin цепь (Fig. 1). Внутри цепи разные ubiquitin-ubiquitin соединения помогают диктовать судьбу модифицированного субстрата. Часто, когда белок субстрат связан с polyubiquitin цепочкой, то он соединяется с 26S протеосомой, крупным мультисубъединичным протеазным комплексом, который деградирует субстрат до мелких пептидов и вновь пускается в оборот ubiquitin метку. Это случается с субстратом, который д. быть элиминирован для собственно прогресса клеточного цикла, регуляции транскрипции, контроля качества белка, сигнальной трансдукции или циркадных ритмов. Ubiquitylation также используется в не-протеолитических регуляторных механизмах, таких как эндоцитоз мембранного белка и внутриклеточный перенос, обеспечиваемая хроматином регуляция транскрипции репарация ДНК и сборка сигнальных комплексов. В свете этого неудивительно, что список болезней, связанных с неправильной регуляцией ubiquitin системы, постоянно растет и сегодня он включает многие раковые опухоли, некоторые тяжелые типы умственной отсталости (такие как синдром Angelman), нейродегенеративные нарушения, такие как болезнь Parkinson's, Huntington's и Alzheimer's и типа 2 диабет9.
Исследования, начатые в конце 1980s, идентифицировали interferon-стимулированный генный продукт в 15 kDa (ISG15), который обнаруживал значительное сходство последовательностей с ubiquitin и также ковалентно модифицировал др. белки12, 13. ISG15 в свою очередь оказался первым членом семейства UBLs, функционирующего как белковые модификаторы (Table 1). Несмотря на это функция ISG15 до сих пор изучена плохо и его E1-подобный (ISG15-activating) и E2-подобный (ISG15-conjugating) энзимы (Box 1) не были идентифицированы влоть до недавнего времени14-17. Эти энзимы, подобно самому ISG15 строго индуцируются с помощью типа I interferons. результаты исследований на мышиных моделях показали, что конъюгация ISG15 с белками вносит вклад в антивирусную реакцию, это согласуется с тем, что ISG15 индуцируется с помощью type I interferons18-20, которые являются одними из первых факторов, продуцируемых врожденной иммунной системой в ответ на вирусы.
Подобно ubiquitin, девять UBLs, как было установлено, ковалентно модифицируют др. макромолекулы, обычно белки (Table 1), и некоторые др. факторы, как полагают, обладают этой способностью. Этот список UBLs возможно неполон. Ubiquitin модифицирует более 1,000 различных белков у дрожжей21. Некоторые UBLs, такие как SUMO (small ubiquitin-related modifier), могут находить такие же количества и разнообразие субстратов, но др. обладают значительно более ограниченным набором субстратов, чем ubiquitin4. Напр., дрожжевой белок Atg12, по-видимому, обладает одиночной мишенью (Atg5), а Atg8 прикрепляется к специфическому фосфолипиду, phosphatidylethanolamine22.
Как отмечалось ранее, большинство путей UBL-модификаций использует сходные энзиматические механизмы. Основные пути конъюгации белков, по-видимому, используют повторяющиеся раунды дупликаций и диверсификации энзимов и белковых модификаторов, происходящих из родоначального биосинтетического пути. Однако несколько необычных механизмов UBL-конъюгации было предположено для специфических UBL путей. В одной из этих моделей ubiquitin hydrolase, как полагают, способна не только отщеплять ubiquitin от субстратов, но и также работать в обратном направлении, фактически, и связывать ubiquitin с белком23. Др. нестандартная модель выяснилась в результате анализа последовательностей необычной группы предполагаемых само-сплайсируемых полипротеинов у реснитчатых24. Эти полипротеины состоят из тандемной серии вариантных UBL доменов с с вкрапленными само-сплайсируемыми bacterial intein-like (BIL) доменами; соотв. гены, возможно, возникают из гена, кодирующего polyubiquitin, который приобрел последовательность, кодирующую BIL домен.
BIL домены имеют serine или cysteine остаток на своем N-конце и они активируют перестройку пептидных мостиков, в которых вышестоящая peptide acyl цепочка переносится с N на O (для серина) или с N на S (для cysteine) на терминальной BIL аминокислоте. Эта перестройка инициирует реакции разрезания или самосплайсинга24. Acyl сдвиги (N→S shifts), запускаемые с помощью BIL доменов в BIL-ubiquitin-like (BUBL) белках, чтобы облегчать нуклеофильную атаку на возникающий в результате тиоэфир с помощью белка (или др. молекулы) во время аутокаталитического процессинга, приводят к связыванию (ligation) вышестоящей UBL последовательности с атакующей молекулой24. Если атакующая группа была лизиновой боковой цепочкой белка, то возникающий в результате продукт д. быть UBL-белковым конъюгатом, сходным с теми, что образуются благодаря стандартному пути (Box 1), даже если не участвует E1 или E2 (или ATФ) . Следовательно, последовательности, стоящие выше BIL доменов в BUBL предшественниках не нуждаются в UBLs. Т.о., д. существовать класс белков модификаторов, которые не связаны с ubiquitin, но слиты с вышестоящими доменами с функциями, сходными с таковыми BIL доменов.
Имеется также множество родственных ubiquitin белков, в которых ubiquitin-like domain (ULD) является частью более крупного полипептида, но, обычно, не подвергается процессингу и не присоединяется ковалентно к др. белкам1. Такие ULDs наделяют белок свойствами, которые сходны с теми что допускают перенос UBL, включая способность соединяться со специфическими белками мишенями. Некоторые ULDs могут расщепляться при специфических условиях (а некоторые могут даже стать компетентными к связыванию с др. белками). Напр., ауторасщепление по внутреннему ULD происходит в deubiquitylating энзиме USP1 после повреждения клеток с помощью УФ лучей. Повреждения, т. о., ведут к инактивации энзима и делают возможным накопление monoubiquitylated proliferating cell nuclear antigen (PCNA), который необходим для trans-lesion синтеза ДНК25.
Beta-grasp складкой обладают все структурно охарактеризованные UBLs и ULDs, она филетически широко распространена и древняя; она могла возникнуть как РНК-связывающий модуль в примитивной системе трансляции белка26. Она оказалась адаптированной к широкому набору функций, от образования каркаса для различных ферментативных активностей и связывания кластеров iron-sulphur до адапторной молекулы, специфической для межбелковых взаимодействий.
Consequences of UBL-protein conjugation
Ранние работы по ubiquitin концентрировались в основном на его роли в протеолизе27-29. Протеосомы 26S ответственны за деградацию polyubiquitylated белков и прямое связывание polyubiquitin цепочки с протеосомами может полностью объяснить наблюдаемое сродство модельных model polyubiquitylated белков с этим протеазным комплексом30. Короче, polyubiquitin цепочка предоставляет характерный признак сродства, что приводит к тесному связыванию протеолитического субстрата с протеосомами (Fig. 2). Множественные рецепторы polyubiquitin присутствуют внутри протеосом31-33. Кроме того, polyubiquitin-связывающие домены обнаруживаются в мобильных факторах переносчиках, которые направляют polyubiquitylated белки на протеосомы34-36.
Специфические взаимодействия между ubiquitin и ubiquitin-binding domains (UBDs) не ограничиваются связыванием ubiquitylated молекул протеосомами. Всеобщая тема, которая возникла в последнюю декаду, заключается в том, что многие функции ubiquitin и UBLs обеспечиваются за счет ассоциации с UBDs37. Напр., UBD в Vps23/TSG101, мембранные белки сортирующем факторе, обеспечивает распознавание monoubiquitylated мембранных белков, а некоторые отличающиеся UBDs в deubiquitylating энзиме Ubp14/USP5 позволяют им специфически распознавать незакрепленные polyubiquitin цепочки. По крайней мере, 16 структурно отличающихся UBD классов было охарактеризовано подобным образом и домены в этих классах варьировали существенно в размере (от ~30 до 150 остатков) и третичной структуре37. Эволюция этих разных типов UBD сделала возможной обширную экспансию клеточных процессов, которые зависят от конъюгации ubiquitin у современных эукариот.
UBDs обычно соединяются с ubiquitin очень слабо37. Несмотря на общее низкое сродство, мутационные исследования подтвердили физиологическое значение этих ассоциаций. Связывание множественных ubiquitin половинок в цепочку может оказывать заметные эффекты на сродство или жадность ubiquitin в отношении белков мишеней. прекрасный пример получен при анализе polyubiquitin-proteasome связывания30. Cecile Pickart с коллегами30 измеряли степень, с которой деградация модельных субстратов ингибируется в присутствии ubiquitin цепочек разной длины. Тетрамерные цепочки обладали сильной ингибирующаей активностью. Напротив, ингибирование было чрезвычайно слабым в присутствии трехмерных цепочек и не обнаружимо при димерных цепочках. Отсутствие простой зависимости сродства от длины цепочки указывает на то. что формирование тетрамерных цепочек создает уникальный детерминант связывания, который отсутствует в коротких цепочках или в monoubiquitin38.
Среди UBLs, SUMO изучался наиболее активно. Анализ взаимодействий между SUMO и др. белками подтвердил и расширил многие идеи относительно взаимодействий ubiquitin-белок, а находки генетических, биохимических и биофизических исследований сошлись на единственном, нековалентном SUMO-связывающем элементе, наз. SUMO-interaction motif (SIM)39. SIM-несущие пептиды короткие в 9 остатков (значительно короче, чем домены, которые обычно связывают ubiquitin) обладают константами диссоциации между 5 µ:M и 10µM, это существенно более тесное соединение, чем то, что наблюдается у большинства известных UBDs. SIM консенсусная последовательность содержит центральную группу из 3-х или 4-х гидрофобных остатков, обычно с кластером кислых остатков на одной из сторон. SIM образует β-нить, которая располагается на гидрофобной поверхности вдавления между β2-нитью и α1-спиралью of SUMO; кислые остатки на концах SIM взаимодействуют с щелочными остатками на поверхности SUMO40, 41. Это является противоположной поверхностью (face) β-grasp складки, с помощью которой распознаётся ubiquitin с помощью большинства UBDs; распознаваемая поверхность является гидрофобным участком, центрированным на остатке isoleucine в позиции 44 у ubiquitin. Т.о., разные UBLs могут действовать аналогично как адапторные модули, но способ, с помощью которого они соединяются с белками мишенями не обязательно д. быть тем же самым.
Ясно, поэтому, что конъюгация UBLs с белками мишенями часто необходима, чтобы способствовать взаимодействию мишени и др. белками. Если такие модификации усиливают взаимодействия мишеней с др. макромолекулами, то они обычно осуществляют это за счет непосредственного участия в образовании связующего интерфейса с молекулой мишенью (Fig. 3a). Взаимодействие может быть также модулировано за счет аллостерического изменения в сайте связывания мишени, индуцированного за счет присоединенного UBL (Fig. 3b). Большинство известных случаев регуляции с помощью UBLs приходится на первую категорию и только горстка оперирует с оставшейся42, 43. Даже если только небольшая пропорция клеточного белка модифицируется с помощью UBL, измененная активность белка д. оказаться достаточной, чтобы вызвать изменение в физиологическом состоянии. Такие нековалентные взаимодействия UBL-белок имеют тенденцию быть слабыми. Специфическое связывание может быть существенно усилено или за счет полимеризации ubiquitin или UBL сигнала или за счет комбинирования слабого связывания с ubiquitin/UBL с дополнительными сайтами слабого связывания в конъюгирующем белке (Fig. 3a, c). В качестве примера такого мультивалентного связывания может служить ассоциация SUMO-conjugated RanGAP1 с комплексом ядерной поры; ни SUMO , ни RanGAP1 в отдельности не могут тесно соединиться с этим комплексом44.
Учитывая их вместимость, др. путем, с помощью которого UBLs могут осуществлять свои функции, является стерическое несоответствие (steric hindrance): прикрепленный UBL может просто блокировать связывание одного белка с др. (или с др. частью того же самого белка) (Fig. 3d). Существует довольно мало хорошо установленных примеров
in vivo такого механизма межмолекулярного ингибирования. Одной из возможных причин является то, что для эффективного оперирования такого механизма большая пропорция клеточных белков нуждается в модификации с помощью UBL. Однако для большинства белков лишь очень небольшие количества обнаруживаются в конъюгированной форме. В принципе, такой ингибирующий механизм д. всё ещё оперировать, если небольшая пропорция модифицированного белка локализуется на функционально привилегированном клеточном сайте или если временной модификации оказалось достаточно, чтобы сдвинуть белок к новому состоянию.
Origins of UBL-protein conjugation
Первые указания на конъюгацию UBL-белок получены при анализе аминокислотных последовательностей дрожжевого ubiquitin-активирующего энзима E1. E1 , как было установлено, обладает слабым, но достаточным сходством последовательностей с MoeB, белком
Escherichia coli , который необходим для биосинтеза molybdenum cofactor (Moco)
45. Но биохимическая функция MoeB была неизвестно. когда был секвенирован E1 в 1991, так как это сходство не особенно информативно. Позднее, однако, белковые последовательности и каталитические механизмы энзимов, используемые для синтеза Moco (и thiamine), начали расшифровываться и было отмечено интригующее сходство с активацией ubiquitin
46-48. Т.к. путь синтеза thiamine присутствует практически во всех видах бактерий и энзимы синтеза Moco также были найдены у широкого круга бактерий, то эти ферментативные системы, как полагают, эволюционно наиболее древние, чем для конъюгации ubiquitin
6.
UBL-related sulphur-carrier proteins
Чтобы синтезировать кофакторы Moco и thiamine, необходимые атомы серы, вставленные в их предшественников. Небольшие переносящие серу белки (MoaD в синтезе Moco и ThiS в синтезе thiamine) предоставляют необходимую серу. Сера берется из thiocarboxylate группы, формируемой на С конце этих белков (Fig. 4). MoaD и ThiS родственны и подобно ubiquitin их последовательности заканчиваются парой остатков glycine. Превращение C-терминального glycine carboxylate в thiocarboxylate у этих белков предшествует аденилированию С конца с помощью E1-родственного энзима: MoeB для MoaD и ThiF для ThiS47-49. Подобно ubiquitin, и MoaD и ThiS обладают β-grasp crkflrjq, несмотря на минимальное сходство последовательностей с ubiquitin50, 51. Следовательно, ubiquitin, MoaD и ThiS являются структурно родственными белками с С-концом, который активируется благодаря аденилированию с помощью гомологов E1-подобных энзимов52, 53.
В начале 2000s, дальнейшая информация о потенциальной эволюционной связи между этими системами переноса серы и активацией UBL была получена с открытием ubiquitin-related modifier 1 (Urm1) (ref. 54), белок впервые был обнаружен у
Saccharomyces cerevisiae благодаря своему родству с MoaD и ThiS (Fig. 4, right). Хотя
S. cerevisiae лишены каких-либо Moco-содержащих энзимов и исползуют др. механизм синтеза thiamine, они экспрессируют E1-родственный белок, Uba4, который обнаруживает сходство последовательностей с ThiF и MoeB. Uba4 соединяется с Urm1 и стимулирует ковалентное добавление Urm1 к клеточным белкам
54, 55. Эти находки показали, что Urm1 и Uba4 действуют как часть системы конъюгации UBL-белок, несмотря на существование значительно более тесного родства последовательностей с бактериальными переносящими серу энзимами. Однако, Uba4 также участвует в переносе серы, так что он может быть бифункциональным энзимом
56. Система Urm1-Uba4 система может быть, следовательно, 'молекулярным ископаемым' , которая сохранила свойства более древнего пути переноса серы и всё же она может также конъюгировать UBLs с белками.
Potential dual function of Urm1
Ферментативная активация C концов UBLs с помощью ATФ-зависимых E1-родственных энзимов аналогична др. реакциям аденилирования, таким как активация аминокислот с помощью aminoacyl-tRNA synthetases2. Для UBLs энергия гидролиза АТФ консервируется благодаря образованию сцепления E1-UBL тиоэфир. Однако, несмотря на существование химической активации, все известные UBLs (Table 1) , за исключением Urm1, также подвергаются энергетически нейтральной трансэфиризации в thiol вторым энзимом, E2 (Box 1). Одним из очевидных исключений по использованию E1-E2 смены, является путь Urm1, обладающий отличительными свойствами, который является общим с бактериальными путями переноса серы. Uba4 (E1 в Urm1 пути) содержит rhodanese-homology domain (RHD), в отличие от E1s для др. UBLs1, 56 (Fig. 4). Rhodanese и некоторые RHD-содержащие белки являются sulphurtransferases и они оперируют путем переноса серы на мишени с помощью промежуточных persulphide (S-S-H) , на их цистеиновые остатки активного сайта57. Большинство белков семейства MoeB имеют доменовую организацию, сходную с таковой у Uba4, с E1-подобным доменом и с C концом к нему, на RHD. Предполагается, что образование thiocarboxylate на MoaD осуществляется посредством acyl disulphide промежуточных образований между MoaD и RHD из MoeB-родственного энзима и что по аналогии перенос Urm1 с Uba4 на субстрат использует RHD в Uba4 (ref. 1). В частности, было предположено, что Uba4 RHD формирует временное промежуточное образование тиоэфира с Urm1, которое затем переносится непосредственно на субстрат, обходя потребность в отдельной E2 (Fig. 4). У S. cerevisiae, остаток цистеина в RHD необходим для связывания Urm1-белок42.
В работе Jennifer Schmitz с коллегами56 было показано, что RHD из Uba4 может также формировать persulphide и может переносить терминальную серу с C конца Urm1 in vitro, давая Urm1-thiocarboxylate. E1-доменовый остаток цистеина не нужен для этого и авт. не нашли доказательств существования Urm1-Uba4 тиоэфира. Вместо этого они установили, что аденилированный Urm1 атакуется с помощью persulphide на RHD, формируя acyl-disulphide промежуточные образования с Urm1, с последующим высвобождением thiocarboxylate. Они полагают, что это может также быть промежуточным образованием при конъюгации Urm1-белок56.
Вновь открытая функция для пути Urm1 заключается в замене S на O в позиции 2 wobble uridine в антикодоне определенных тРНК, процесс, который модулирует их специфичность декодирования58, 59. Urm1 , необходимый для этих реакций thiolation, по-видимому, функционирует как переносчик серы в форме Urm1-thiocarboxylate. Степень, с которой модификации tRNA с помощью пути Urm1 объясняют плейотропную физиологическую роль Urm1, ещё предстоит определить. Модификации белков с помощью Urm1 могут также стимулировать tRNA thiolation59, но минимальная гипотеза необходима только для образования Urm1-Uba4 acyl disulphide, который превращается в Urm1-thiocarboxylate, из которого сера в конечном итоге переносится на tRNA.
Хотя консервативный E1-доменовый цистеин в Uba4 несущественен для образования Urm1-thiocarboxylate
in vitro, он необходим для конъюгации белка с Urm1
in vivo54. Этот цистеин может действовать в восстановительном расщеплении связи Urm1-RHD
56, но это д. стимулировать образование Urm1 C-терминального thiocarboxylate скорее, чем Urm1-белок amide связи. Потенциально или E1-like цистеин подвергается persulphide обмену с RHD, высвобождая RHD thiol для атаки на Urm1-adenylate (not shown in Fig. 4), или Urm1-adenylate непосредственно атакуется с помощью лизиновго остатка в субстрате, хотя это не объясняет потребности в двух цистеиновых остатках в Uba4 активном сайте. Восстановительное расщепление Urm1-RHD дисульфида с помощью E1-domain active-site sulphydryl группы может позволить регенерировать RHD thiol, потенциально делая его компетентным к образованию Urm1-thioester. Отражает ли механизм связывания Urm1-белок раннего предшественника с др. механизмами UBL-конъюгации, неизвестно. Возможно, что во время эволюции UBL-конъюгационой системы, самостоятельный E2-like фактор может быть кооптирован, приводя к потере RHD из E1 и тем самым элиминируя persulphide-thiocarboxylate 'побочную реакцию'. Альтернативно, пути модификации эукариотических UBL могут эволюционировать из самостоятельной прокариотической β-grasp системы модификации белка
6.
Radiation of E2s and UBL-specific proteases
Когда же возникают E2-like энзимы и когда они впервые ассоциируют с E1-like белками. чтобы сформировать сегодняшнюю почти универсальную E1-E2 смену с использованием конъюгации UBL-белок? Ранние исследования последовательностей не выявили каких-либо E2-like белков у бактерий, но недавно были выявлены удивительные количества E2-родственных последовательностей в тех же самых ДНК окружениях (т.е., в презумптивных оперонах, доменах слияний или ко-регулируемых генах) как UBL-родственные, E1-like или JAMM (JAB1/MPN/Mov34) metalloprotease кодирующих последовательностях6, 60. У эукариот специфические JAMM-класса протеазы действуют как deubiquitylating энзимы (DUBs) или UBL-specific proteases (ULPs)61.
Поразительное распространение E2-like белков, следовательно, по-видимому, произошло у бактерий, сопровождаемое диверсификацией UBL и E1-like белков. Это подсемейство наиболее тесно связано с классическими UBL-conjugating E2 энзимами и как полагают является родоначальным для эукариотических UBL E2s60. Хотя ни один из этих прокариотических E2-like белков еще не был проверен в отношении катализа модификаций UBL-субстрата совместно с E1, эти контекстуальные ассоциации указывают на то, что, по крайней мере, некоторые из них делают это.
DUBs (или ULPs в случае UBLs), часто необходимы для C-терминального процессинга предшественников UBL и для удаления UBLs с их мишеней (Box 1). Хотя множественные JAMM энзимы теперь связаны с помощью контекстуального анализа последовательностей с потенциальными системами UBL-модификаций у прокариот, некоторые JAMM энзимы участвуют в механизмах переноса серы скорее, чем в конъюгации UBL-белок. Напр.,
Mycobacterium tuberculosis обладают необычным путем биосинтеза цистеина, который использует получение thiocarboxylate из CysO, β-grasp белка, с помощью E1-родственного MoeZ белка
62. Ген для JAMM энзимов образует кластеры с геном для CysO, и возможно гидролизует его цистеин из CysO в финальной ступени биосинтеза цистеина. Синтез содержащего серу thioquinolobactin siderophore (железо-chelating соединение) у
Pseudomonas fluorescens нуждается в белке, переносящем серу, наз. QbsE, который близок к MoaD и ThiS. QbsE, однако, возникает в форме предшественника с двумя дополнительными аминокислотами после diglycine мотива
63. JAMM протеаза, экспрессируемая в том же самом thioquinolobactin биосинтетическом опероне, отщепляет эти два последние остатка от QbsE. Следовательно, протеазы типа, который используется эукариотами для удаления UBLs из конъюгатов с белками, могли первоначально быть частью бактериальных биосинтетических путей, базирующихся на β-grasp белках, почти таких же как UBLs и E1-like (и возможно E2-like) энзимах.
E1-like activation of a non-UBL substrate
E1-like сверхсемейство аденилирующих энзимов катализирует спектр биохимических реакций, которые лежат за C-терминальной активацией β-grasp белков. Лучшие доказательства этому получены на энтеробактириях, которые синтезируют и секретируют малый антибиотик microcin C7 (MccC7). MccC7 является модифицированным гептапептидом, кодируемым крупной
E. coli плазмидой
64. Isoasparaginyl половинка на C конце у MccC7 обладает phosphoramidate связью с модифицированным аденилатом, а закрепление этого модифицированного АМФ нуждается в кодируемом плазмидой продукте mccB. MccB является членом сверхсемейства E1-like энзимов. Поэтому субстратом этого E1-like энзима не является β-grasp белок и химия C-терминальной модификации отлична от той, описана выше для sulphurtransferases, даже если инициальное аденилирование C-терминального α-carboxylate с помощью E1-related энзимов сходно.
Outlook
How much of the diversity of UBL-protein modification or analogous conjugation systems is yet to be discovered? Some UBLs are difficult to recognize by amino-acid sequence comparison, so additional beta-grasp/UBL modifiers might still have been overlooked. The exciting possibility of a multitude of prokaryotic UBL-related protein-modification systems, none of which has been analysed experimentally, was made apparent when contextual sequence analyses suggested the existence of a bevy of bacterial regulons that bring together genes encoding novel beta-grasp proteins, E1-like enzymes, E2-like proteins and hydrolases related to those in known UBL systems. Moreover, not all E1-like enzymes act on beta-grasp/UBL proteins, so further insight into the ability of such enzymes to modify specific proteins or peptides (or other molecules) can be anticipated.
Conversely, there may be intracellular protein–protein conjugation mechanisms that involve neither E1-like adenylating enzymes nor beta-grasp proteins, such as intein-mediated protein trans-splicing. Along these lines, a 64-residue protein in M. tuberculosis called Pup (prokaryotic ubiquitin-like protein) has been shown to modify specific proteins in vivo and, remarkably, to target them for degradation by the mycobacterial proteasome65. Pup is not a beta-grasp/UBL protein, and Pup attachment involves linkage of a substrate lysine to what had originally been a glutamine residue at the Pup C terminus. The terminal Pup glutamine is converted to a glutamate either during or before substrate conjugation. Similar amide-bond-forming reactions are seen with transglutaminases and gamma-glutamylcysteine synthetases (involved in glutathione synthesis). In fact, the M. tuberculosis PafA protein, which is required for substrate pupylation65, has distant sequence similarity to gamma-glutamylcysteine synthetases and glutamine synthetases66. Mass spectrometry-based proteomic studies could yield further surprises about protein modification and ligation in vivo. Viewed through this wider lens, protein–protein conjugation can be seen as a multifaceted and nearly universally employed means of cellular regulation, and we are only just starting to understand some of the underlying mechanisms.
Сайт создан в системе
uCoz 
