Cholesterol is an essential structural component in the cell membranes of most vertebrates. The biophysical properties of cholesterol and the enzymology of cholesterol metabolism provide the basis for how cells handle cholesterol and exchange it with one another. A tightly controlled — but only partially characterized — network of cellular signalling and lipid transfer systems orchestrates the functional compartmentalization of this lipid within and between organellar membranes. This largely dictates the exchange of cholesterol between tissues at the whole body level. Increased understanding of these processes and their integration at the organ systems level provides fundamental insights into the physiology of cholesterol trafficking.
С момента его выделения из желчных камней в 1789 во времена Французской Революции, холестерол изучался очень активно. С его сложным биосинтезом и метаболизмом (Fig. 1), он первоначально привлекал внимание химиков, а его уникальная структура и физические характеристики пленили биофизиков. В качестве важного компонента мембран у высших эукариот холестерол помогает генерировать полупроницаемый барьер между клеточными компартментами и регулирует текучесть мембран. Холестерол модулирует также функции мембранных белков и участвует в нескольких процессах мембранного транспорта и передачи трансмембранных сигналов, например передачи сигналов с помощью G protein-coupled рецептора1. Метаболиты холестерола - стероиды и желчные кислоты - выполняют важные биологические роли в качестве передатчиков сигналов и растворителей др. липидов. Более того, холестерол важен не только в патогенезе сосудистых заболеваний сердца и головного мозга, но он также участвует в возникновении деменции, диабета и рака, а также некоторых редких моногенных болезней (таких как и )2, 3.
Большинство клеток позвоночных содержит холестерол и, следовательно, может быть исследован почти в любых клетках или тканях. Однако наше современное представление о принципах клеточного перемещения и компартментализации холестерола в основном базируется на изучении фибробластов и др. легко получаемых клеточных культур. Менее известно о доставке холестерола во многих физиологически важных типах клеток, таких как гепатоциты, энтероциты или клетки ЦНС. Из нескольких используемых модельных организмов мыши остаются наиболее популярными, хотя в их кровотоке обнаруживается в основном высокой плотности липопротеин (high-density lipoprotein ()), делающих животных резистентными к атеросклерозу4 и, следовательно, они не являются идеальными для изучения середчно-сосудистых заболеваний. Кроме того, низшие позвоночные и беспозвоночные предоставляют всё увеличивающуюся информацию о биологии холестерола5, 6. Отметим, холестерол в теле человека происходит из двух источников -пищи и синтеза de novo - тогда как у некоторых модельных животных оказывается предпочтительным или потребление или биосинтез в качестве источника стерола. Напр., Saccharomyces cerevisiae полагаются на de novo биосинтез стерола в условиях аэробного роста, тогда как Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans являются ауксотрофами стерола. В принципе геномные последовательности позволяют идентифицировать все белки, которые участвуют в транспорте холестерола между мембранами или компартментализации внутри мембран. Однако липиды не являются генетически закодированными так что геномные и/или транскриптомные изменения могут отражать гомеостаз холестерола только косвенно. Кроме того, многие из белков, которые поддерживают гомеостаз клеточного холестерола, обнаруживают существенное функциональное перекрывание, что конечно благоприятно для организма, но затрудняет исследования.
В обзоре будут рассмотрены общие аспекты биологии холестерола в клеточных мембранах и источники клеточного холестерола. Транспорт холестерола между специфическими внутриклеточными компартментами и их коммуникации с донорами и акцепторами внеклеточного холестерола и затем будут обсуждены пути доставки холестерола в специализированные, -секретирующие клетки.
Cholesterol: cellular organization and functions
Холестерол является существенной составляющей в клеточных мембранах млекопитающих, общее соотношение холестерол:белок варьирует существенно (что д. учитываться для культур клеток)7. Более того, холестерол распределяется гетерогенно между клеточными мембранами. Холестеролом богата плазматическая мембрана, где он обычно составляет 20-25% от молекул липидов, остальное составляют phospholipids, sphingomyelin и glycolipids (see the review by van Meer and colleagues in this issue). Холестеролом также богат компартмент эндоцитотического рециклинга и часть комплекса Гольджи, преимущественно компартменты trans-Golgi8, 9. Напротив, endoplasmic reticulum (ER) обнаруживает низкое содержание холестерола, всего около 1% от общего содержания холестерола в клетке10. Концентрация холестерола в ER, по-видимому, контролирует несколько функций, которые связаны с ER и ER-Golgi мембранным транспортом, такими как операция стерол-гомеостатического аппарата11, активность постоянно присутствующих ER белков и выход вновь синтезированных мембранных белков из ER12-14. Удивительно, истощение стерола в ER ингибирует транспорт ER-->-Golgi секреторного маркерного белка13, 14, но усиливает транспорт стерольного регулятора (, белка, активирующего расщепление, )15. Как осуществляется подобная дифференциальная регуляция неясно, но она, по-видимому, использует вмешательство стерола в рекрутирование COPII покровного белка14 и в заполнение грузом 16, и возможно также влияет на COPII изоформы17, которые обладают разной чувствительностью к стеролам.
The functions of membrane cholesterol. Холестерол затрагивает клеточные процессы благодаря взаимодействию с др. мембранными липидами, а также со специфическими белками. Уникальная складчатая четырех-кольцевая структура холестерола обеспечивает его специальными биофизическими свойствами, которые повышают упорядоченность (слипчивость и упаковку) соседних липидов. Благодаря остову из ригидного стерола холестерол преимущественно располагается в тесной близости к насыщенным углеводным цепочкам соседних липидов, т.к. они являются наиболее жесткими и удлиненными по сравнению с таковыми у ненасыщенных липидов18. Повышенное боковое упорядочивание липидов, которое обеспечивается холестеролом впоследствии влияет на биофизические свойства мембран, благодаря снижению жидкого состояния и редукции проницаемости полярных молекул, напр. 18. Это позволяет разным ионам и растворимым веществам существовать на каждой из сторон мембраны. Напротив, слишком высокая степень упорядоченности является вредной, т.к. это д. замедлять диффузию мембранных белков и повышать состояние изгиба мембраны.
Некоторые мембранные белки соединяются плотно с холестеролом19. Более того, некоторые ключевые белки, которые участвуют в гомеостазе или доставке клеточного холестерола (такие как hydroxymethylglutaryl CoA (HMG-CoA) reductase (), SCAP и Niemann-Pick C1 protein ()) обладают консервативным 5 раз пронизывающим мембрану спиральным доменом, наз. sterol-sensing domain (SSD)15. Однако точная функция этого домена неясна. Лишь в случае SCAP , как было показано, этот домен соединяется с холестеролом, причем связывание с холестеролом регулирует рекрутирование SCAP в COPII пузырьки20. Др. белки имеют консервативные цитоплазматические стерол-связывающие карманы, но могут обладать мембранными якорями или последовательностями, находящими мембрану. Примерами являются oxysterol-binding protein () и др. OSBP-родственные белки (ORPs)21. а также steroidogenic acute regulatory protein () и StAR-related (START) белки22. Некоторые белки, принадлежащие к этим семействам, обнаруживают сродство к холестеролу, но многие из них также связывают и др. стеролы, также как и др. липиды и демонстрируют сложные фенотипы в гомеостазе липидов. Т.о., часто очень трудно определить, действуют ли они как непосредственные транспортеры стеролов или как сенсоры стеролов, которые руководят клеточными функциями, такими как гомеостаз липидов, перенос с помощью пузырьков и передача сигналов (see below). Помимо законсервированных гидрофобных карманов, идентифицированы короткие мотивы, которые потенциально участвуют в связывании холестерола23, 24, хотя сродство к холестеролу и/или чувствительность белка не всегда можно дедуцировать, исходя из первичной структуры. Напр., стеролом-индуцируемые альтерации биофизических свойств мембраны могут косвенно влиять на функции белков25.
The lateral and transbilayer distribution of cholesterol. Было предложено несколько схем для объяснения механизмов взаимодействий холестерол-липиды, такие как модель зонтика26 и модель конденсированных комплексов27 (Box 1). Важно отметить, что эти схемы исходят из исследований in vitro и что стабильность и размер межлипидных ансамблей в мембранах живых клеток не определены. Эти вопросы нелегко решить из-за узкого диапазона временного и пространственного порядка, который генерируют липиды, высокой концентрации белков и интимных взаимодействий между белками- и липид-управляемыми силами28. В целом, множественные слабые межлипидные интересы направляют системы в направлении энергетически благоприятного взаимодействия, но дополнительная энергия вносится за счет зависимых от белков процессов, которые предохраняют систему от достижения или, по крайней мере, от удержания в равновесии.
Латеральная организация клеточных мембран нуждается организации мембранных специализаций. Однако не достигается согласия относительно действительного размера, динамических свойств и лежащих в основе сил таких доменов. Гипотеза липидных плотиков (raft) постулирует предпочтительную ассоциацию холестерола со sphingolipids, чтобы сформировать динамические платформы или плотики. в отношении которых обнаруживают сродство специфические белки18, 29. Это, по-видимому, помогает кластерам белков формировать функциональные ансамбли для различных процессов, таких как передача сигналов, мембранный трафик и клеточная адгезия30, 31. Однако модель плотиков и некоторые др. модели латеральной организации 32-36 не могут быть с легкостью подтверждены прежде чем не будут улучшены экспериментальные подходы, которые смогут определить длину и временную шкалу организации липидов.
В регионах мембран, богатых по cholesterol-sphingolipid, плотность липидов может быть выше, чем в основной массе плазматической мембраны, как это показано с помощью исследований37. В иммуноизолированных кавеолах концентрация холестерола была выше, чем в основной фракции плазматической мембраны37. Однако с помощью светового микроскопа распределение стерола в плазматической мембране отражает общую топологию клеточной поверхности скорее, чем предполагаемые стероидные домены, как это наблюдается с помощью наблюдений над живыми клетками с флюоресцентным стеролом38. Учитывая, что индивидуальные и собранные в кластеры кавеолы могут быть различимы с помощью световой микроскопии с использованием анализа интенсивности флюоресценции39, то это д. говорить против обогащения кавеол стеролами. Т.о., вопрос, обогащены ли кавеолы холестеролом или др. типы плотиков в клеточной мембране остается не урегулированным.
Распределение холестерола поперек бислоя также остается нерешенным. Очевидно, что между листками быстрый40 и холестерол оказывается высоко мобильным липидом, который спонтанно диффундирует между мембранами, это д. быстро гомогенизировать распределение холестерола между мембранами. Однако взаимодействия с др. более закрепленными липидами (такими как большинство sphingolipids, которыми обогащен наружный листок плазматической мембраны) и специфическими белками может способствовать не-униформному распределению41. Более того, некоторые обусловленные белками механизмы оперируют, чтобы активно переносить холестерол между субклеточными мембранами и поддерживать градиенты холестерола (discussed below). Однако сначала мы рассмотрим основные ресурсы холестерола, которые служат исходной точкой для циклов переноса внутриклеточного холестерола.
Sources of cellular cholesterol
Вклад синтеза de novo холестерола в противовес потреблению с пищей большей части холестерола определено как соотношение приблизительно 70:30 (Ref. 42). На практике это безусловно существенно варьирует между индивидами в зависимости от генетической конституции (эффективности продукции холестерола в противовес абсорбции) и потребления холестерола с пищей.
De novo cholesterol synthesis. Все ядерные клетки могут синтезировать холестерол из acetyl CoA посредством mevalonate пути. Первым промежуточным стеролом на этом пути является lanosterol, который в дальнейшем приводится в порядок с помощью нескольких энзимов, чтобы сформировать холестерол (Fig. 1). В некоторых клетках, избранные post-lanosterol ступени оперируют медленно, приводя к накоплению предшественников холестерола и/или их секреции из клеток43-45. Физиологическое значение этого феномена изучено плохо. Некоторые предшественники холестерола могут 'вытекать' из клеток, т.к. они оказываются более гидрофильными, чем холестерол. Однако это не объясняет, почему lathosterol (который отличается от холестерола положением одного двойного мостика), напр., секретируется46. Пост-lanosterol предшественник холестерола был охарактеризован как мейоз-активирующий стерол47. Следовательно, может предполагать, что предшественники холестерола могут действовать как биоактивные липиды в более разнообразных процессах, чем это предполагалось.
Скорость-ограничивающей ступенью пути mevalonate является превращение HMG-CoA в mevalonate с помощью HMG-CoAR. Этот и некоторые др. энзимы, которые действуют на более поздних ступенях синтеза холестерола являются интегральными ER мембранными белками. ER содержит также энзимы для некоторых ключевых ступеней процессинга холестерола, таких как гидроксилирование, чтобы генерировать (с hydroxyl группами, обычно добавляемыми к углеродам боковых цепочек стерола) и ацетилирования жира, чтобы сформировать steryl эфиры (холестерол с жирной кислотой, этерифицированный по углероду carbon 3). Oxysterols обычно присутствуют в клетках в минимальных количествах (приблизительно 1:1000 по сравнению с холестеролом) , тогда как steryl эфиры могут накапливаться до уровней, превосходящих уровни не эфиризироваанного холестерола в некоторых клетках, таких как макрофаги3. Дополнительные гидроксильные группы делают стерол более гидрофильным. Т.о., окисленные производные обладают более высоким химическим потенциалом в мембране и они перемещаются более свободно в жидкой цитоплазматической среде, чем холестерол, действуя как мощные сигнальные пептиды. Если в высоких концентрациях окисленные производные холестерола действуют как растворители мембран, то являются средством, с помощью которого холестерол смещается (как желчная кислота). Напротив, замещение только одной гидроксильной группы холестерола жирной кислотой делает стерол менее водорастворимым. Cholesteryl esters не расщепляются эффективно в бислоях, но интеркалируются в липидные капельки, которые функционируют как клеточные хранилища холестерола. Как cholesteryl esters липидных капель, так и cholesteryl esters, которые поступают в клетку из липопротеинов, сначала гидролизуются. чтобы генерировать неэфиризированный холестерол для доставки в клеточные мембраны.
Dietary cholesterol and transfer between tissues. Холестерол, получаемый из пищи первоначально транспортируется из кишечника в печень, из которой он поставляется по всему телу. Перенос на длинные расстояния между клетками осуществляется посредством жидекой среды (лимфы и крови), энтероцитов и гепатоцитов в виде упакованного холестерола и cholesteryl эфиров в липопротеины различных размеров и состава, которые в далее модифицируются в кровотоке. Короче, пищевой холестерол абсорбируется энтероцитами тонкого кишечника, которые его упаковывают вместе с триглицеридами в . Некоторые из триглицеридов гидролизуются в кровобращении и добавляются новые апопротеины, такие как , чтобы генерировать chylomicron остатки, которые поступают в гепатоциты. Гепатоциты, в свою очередь, секретируют липиды в частицы липопротеинов очень низкой плотности (very low density lipoprotein ()) , которые превращаются в кровообращении в липопротеины низкой плотности (low density lipoprotein ()), основной липопротеин, который доставляет холестерол в периферические клетки.
Когда внепеченочные ткани обнаруживают избыток холестерола, то он может высвобождаться в HDL, который также возникает в результате синтеза в печени. HDL возвращает липид в печень в процессе, наз. . Из печени холестерол секретируется в желчь (или как холестерол или после того как они метаболизируется желчными кислотами) , которая поступает в тонкий кишечник. От сюда холестерол и желчные соли или реабсорбируются (энтеро-печеночный цикл) или выводятся с калом. Головной мозг изолирован от этой системы, но внутри ЦНС липопротеины используются, чтобы транспортировать липиды между разными типами клеток. Чтобы регулировать мембранные уровни холестерола, клетки используют механизмы поглощения холестерола, чтобы он курсировал между органеллами, и высвобождения его из клеток.
Транскрипционная регуляция гомеостаза холестерола посредством SREBP является одним из наиболее тщательно исследованных механизмов клеточной биологии холестерола. SREBP располагается в ER и активируется в условиях нехватки стерола путем транспорта в комплекс Golgi, где он подвергается протеолитическому процессингу11 (Fig. 2). Фрагмент процессинга затем импортируется в ядро, где он переключает транскрипцию HMG-CoAR и др. стеролом-регулируемых генов, таких как LDL receptor (). Стеролы ингибируют ER-Golgi транспорт SREBP путем индукции конформационных изменений в двух хаперонах, SCAP и INSIG. SCAP является SREBP Golgi эскортным белком, а является ER якорным белком. Соединение холестерола с SCAP и соединение 25-hydroxycholesterol с INSIG заставляет эти хапероны соединяться др. с др. 50, 51 и отдавать сигнал сортировки, что SCAP недоступен для COPII комплекса, так что SCAP больше не вступает в ER-Golgi транспортные пузырьки16. Дополнительный уровень регуляции обеспечивается предшественником холестерола lanosterol, которые управляет протеосомной деградацией HMG-CoAR52.
Intracellular cholesterol transport
Ключевые ступени процессинга холестерола происходят в разных субклеточных местах; следовательно, перемещение между этими местами является важным способом регуляции этих реакций. Известно, что холестерол переносится между субклеточными мембранами с помощью мембранного (или везикулярного) транспорта и с помощью не-везикулярных механизмов3, 53. Транспорт между мембранами осуществляется посредством везикулярных и тубулярных промежуточных образований, которые переправляют компоненты мембран и их грузы между субклеточными органеллами вдоль цитоскелетных треков. Некоторые переносчики как эндоцитических, так и экзоцитических маршрутов мембранного транспорта обогащены холестеролом54, 55.
Механизмы не-везикулярного переноса холестерола преимущественно используют белки переноса цитозольных липидов, они управляют мембранными контактами или их комбинациями - до сих пор они оставались неуловимы. Белок, который облегчает перенос липидов между компартментами и который содержит домены для связывания липидов и для нахождения донорских и акцепторных мембран был охарактеризован как ceramide (известен как ceramide transfer protein; )56. Этого типа перенос липидов может быть облегчен с помощью сайтов мембранных контактов и может использоваться также для стеролов. В самом деле, CERT принадлежит семейству START белков, др. члены которого связывают холестерол57. Более того, OSBP обладает сродством к холестеролу, а также к некоторым oxysterols58, 59 и было также показано, что он играет роль в ER-Golgi транспорте ceramide60, в усилении регуляции тесных взаимосвязей между sterol и sphingolipid.
Наиболее прямым доказательством роли белков, переносящих липиды при межмембранном транспорте стеролов получены на дрожжах. S. cerevisiae лишены гомолога белка START, но обладают семью Osh белками, которые гомологичны ORPs млекопитающих с липид-связывающими доменами, напоминающими те, что в OSBP. Когда все Osh белки были делетированы определенными условиями, то доставка стерола из плазматической мембраны в ER достоверно снижалась61. Эти данные указывают на то, что некоторые Osh белки выполняют перекрывающиеся функции в транспорте стерола, а также на то, что процесс регулируется с помощью др. липидов, а именно, phosphoinositides61. Однако, в настоящее время возможность, что Osh (или ORP млекопитающих) белки действуют, прежде всего, как сенсоры стерола или транспортеры и/или сенсоры др. липидов, которые косвенно участвуют в транспорте стерола, нельзя исключить62, 63.
Destinations of cholesterol leaving the ER. Синтезированный de novo холестерол быстро покидает ER, в основном благодаря не-везикулярным механизмам, которые обходят ER-Golgi мембранный транспорт64, 65 (Fig. 3), помогая тем самым поддерживать низкое содержание холестерола в ER. Биосинтетические стеролы, включая холестерол и существенную фракцию его предшественников - таких как zymosterol, lathosterol and desmosterol - быстро доставляются на плазматическую мембрану и становятся доступны внеклеточным акцепторам44. Альтернативно, вновь синтезированный холестерол может начать уравновешиваться с помощью предсуществующего клеточного пула холестерола и доступности др. сайтов, таких как эндосомные компартменты66. У дрожжей, Osh белки участвуют в транспорте стеролов ER-плазматическая мембрана скорее, чем являются транспортерами стерола, поэтому было предположено, что белки влияют на транспорт стеролов, влияя на способность плазматической мембраны секвестрировать стеролы67. Аналогично, усиливает транспорт вновь синтезированного стерола с ER, но также влияет на такие события плазматической мембраны, как эндоцитоз, делая трудной идентификацию первичной функции ORP2 (Ref. 68).
Важным буферным механизмом для снижения уровней неэфиризированных стеролов в ER является этерификация, которая катализируется с помощью acyl CoA cholesterol acyltransferase (). Эфиры стеролов жирных кислот хранятся в липидных капельках, которые формируются на ER. Липидные капельки первоначально рассматривались как пассивные депо жира, но сегодня на них смотрят как на динамические, регулируемые органеллы69. Механизмы биогенеза и оборота липидных капелек сегодня неясны, предложено несколько теорий ( see Refs 70,71). В некоторых клетках, таких как адипоциты, существенные количества неэфиризированного холестерола хранятся в липидных капельках72. Одним из интересных белков в этом отношении является , который ассоциирует с кавеолами и жировыми капельками73. Добавление холестерола, как было установлено, индуцирует транспорт кавеолина плазматической мембраны в липидные капельки, в которых кавеолин выполняет роль по поддержанию уровней неэфиризированного холестерола74. Имеются также некоторые указания на взаимодействие между кавеолами и жировыми капельками в метаболизме триглицеридов75. Более того, недавние данные показали, что ATP-binding cassette , который облегчает удаление клеточного холестерола. также регулирует хранение триглицеридов76. Как хранение и мобилизация холестерола и триглицеридов происходят в жировых капельках является открытым вопросом.
Mitochondrial cholesterol transport. Принципиальными steroidogenic органами тела являются гонады, надпочечники и головной мозг. De novo синтез стероидных гормонов из холестерола катализируется с помощью энзима, отщепляющего боковые цепочки, P450SCC, который располагается на внутренней митохондриальной мембране77 (Fig. 3). Все первичные steroidogenic клетки экспрессируют скорость-ограничивающий энзим. Кроме того, многочисленные др. типы клеток способны модифицировать пред-существующие стероиды. StAR, белок с холестерол-связывающим карманом, действует на митохондриальную наружную мембрану, чтобы облегчить перенос холестерола на внутреннюю мембрану78. Острая стероидогенная реакция регулируется на этой ступени и использует быстрый синтез StAR. Стоихометрия и компартментализация этого процесса переноса понятны в высшей степени по сравнению с большинством др. ступеней переноса клеточного холестерола77. Расчитано, что 400 молекул холестерола в минуту переносится в митохондрии, каждая с помощью вновь синтезированной молекулы StAR. Активность переноса нуждается в конформационном изменении в StAR. Сперктороскопические и имитационные исследования показали, что белок подвергается molten globule transition (переходу с расплавлением глобул), при котором третичная структура изменяется, а вторичная структура сохраняет открытым стероид-связывающий карман79. Однако в соответствии с др. имитациями, и меньших деформирующих изменений в конформации белка может быть достаточно для связывания и высвобождения холестерола80.
Др. белки со StAR-родственными lipid-transfer доменами, у которых отсутствуют доказательства реципиентных последовательностей, такие как , могут быть ответственны за цитоплазматическую доставку холестерола на наружную митохондриальную мембрану 77, 81. Периферический benzodiazepine receptor () является белком наружной митохондриальной мембраны, который также участвует в митохондриальном импорте холестерола для стероидогенеза82. Растут доказательства функционального взаимодействия между PBR и StAR. Одна из возможностей заключается в том, что домен распознавания холестерола у PBR содержит резервуар лабильного холестерола, который с помощью StAR может быть мобилизован для стероидогенеза77. Недавно идентифицированы дополнительные белки, которые участвуют в формировании сигнального комплекса. Помимо PBR, этот комплекс включает PBR-ассоциированный белок , (PAP7-связывающую регуляторную субъединицу cyclic-AMP-зависимой протеин киназы) и StAR81. Было предположено, что этот комплекс формирует остов в наружной митохондриальной мебмрене и опосредует эффекты гормонов посредством цАМФ митохондриальный транспорт холестерола83.
Cholesterol influx and endosomal traffic
Альтернативным de novo синтезом для приобретения клеточного холестерола является поглощение из липопротеинов внеклеточной среды посредством рецепторами опосредованных механизмов. LDLR, который присутствует на плазматической мембране большинства клеток, связывает частицы, которые содержат APOB или APOE белки, такие как остатки chylomicron, VLDL и LDL. Уже известно с 1980s, что частицы подвергаются эндоцитозу с помощью и транспортируются в кислые эндоцитотические компартменты, где cholesteryl эфиры гидролизуются с помощью кислой липазы, чтобы предоставить неэфиризированный холестерол для клеточных нужд (Fig. 4). Компартменты рециклинга и внутренние пузырьки из мультивезикулярных тел содержат большую часть холестерола эндоцитотического пути, с ~20% представленностью в recycling tubulo-vesicles и ~60% в , особенно внутри внутренней мембраны55. Мембраны лизосом обычно бедны холестеролом, это благоприятствует перевариванию sphingolipid84. Это указывает на то, что большая часть холестерола обычно покидает мембраны эндосом прежде их вступления в лизосомы. Как это происходит пока неясно. Внутри-эндосомные мембраны мультивезикулярных поздних эндосом, которые богаты фосфолипидом LBPA/BMP (lysobisphosphatidic acid/ bismonoacylglycerophosphate), служат в качестве важных регуляторов транспорта холестерола85. LBPA структурно важен для формирования высоко искривленных внутренних мембран мультивезикулярных тел86 и участвует в мобилизации холестерола85, возможно путем контроля за обратным слиянием внутренних пузырьков с ограничивающими мембранами поздних эндосом87.
Мультивезикулярные поздние эндосомы содержат два белка, NPC1 и , которые, по-видимому, критические для перемещения холестерола из системы эндосом. Это происходит из-за дефицита любого из белков и ведет к накоплению LDL-производного неэфиризированного холестерола в поздних эндоцитотических органеллах88. Генетические и фенотипические доказательства у мутантных мышей указывают на то, что NPC белки участвуют в разных ступеня. одного и того же пути и что ни одни из них не компенсирует др.89. Оба белка могут связывать стерол90, 91, но участвуют также в связывании или мобилизации sphingolipid92-94. Т.о., вопрос о первичной функции NPC белков - участвуют ли они в мобилизации cholesterol или sphingolipid или в чем то ещё - всё ещё ждет своего решения. NPC2 является малым растворимым белком, который действует как переносчик холестерола in vitro, способствуя кислой pH и присутствию LBPA95. Напротив, NPC1 является крупным гликопротеином, который, как полагают, представлен 13 доменами, пронизывающими мембрану, 5 из которых составляют SSD96. Cholesterol и oxysterols , как было показано соединяются с первой просветной петлей97, 98, но функциональная роль этого взаимодействия неизвестна. Возможный сценарий заключается в том, что NPC2 переносит холестерол или из внутри-эндосомных мембран или непосредственно в результате гидролиза acid-lipase-катализируемого эфира на NPC1, что помогает его транспорту из эндолизосомной системы. При этом может использоваться или NPC1-опосредованный транспорт холестерола через мембрану и стерол попадает на белки, переносящие цитозольные липиды, или NPC1-регулируемый мембранный транспорт, который удаляет холестерол и возможно sphingolipids92, из оборота поздних эндосом.
После высвобождения из эндолизосомной системы, холестерол доставляется на др. мембраны, такие как плазматическая мембрана, ER, recycling эндосомы и митохондрии. Какие мембраны служат в качестве инициального акцептора холестерола, который покидает эндосомы, не определено из-за быстрой кинетики, с помощью которой холестерол достигает мест предназначения и недостаточного разрешения доступных методов.
Идентифицированы два белка поздних эндосом со стерол-связывающими доменами, которые находятся в цитозоле. Эти белки, и , связывают холестерол и 25-hydroxycholesterol, соотв.57, 99. Несмотря на их топологию, прямых доказательств их роли в качестве транспортеров стеролов из этих компартментов нет. Оба, по-видимому, участвуют в регуляции субклеточного распределения и мембранном транспорте поздних эндосом. MLN64 вызывает обогащение стеролом поздних эндосом, вероятно облегчая ассоциацию актина и актин-связывающих белков с эндосомами, которые в свою очередь регулируют позиционирование и слияние эндосом100. Напротив, ORP1 переносит комплекс из Rab7, его эффектора Rab7-interacting lysosomal protein (RILP) и субъединицы моторного микротрубочкового белка dynein, с мембранным рецептором101, способствуя тем самым перемещению поздних эндосом в направлении минус конца микротрубочек. Является ли ORP1 sterol-связывающим предстоит определить.
Др. местом эндоцитотического пути для обмена активного стерола является recycling компартмент. Recycling эндосомы обогащены стеролом и sphingolipid102, и могут служить в качестве акцепторов для не-везикулярного истока стерола через цитоплазму, когда стеролы вставляются непосредственно из cyclodextrin комплекса в плазматическую мембрану, напр.103. Везикулярный транспорт, в особенности мембранный транспорт, регулируемый с помощью Rab11 GTPase, участвует в рециклинге мембранного холестерола на плазматическую мембрану104. LDL не пересекается с эндосомными recycling circuits на пути к поздним эндосомам104, но lipoprotein sterol, который выходит из эндосом может делать это103. В свою очередь, холестерол влияет на локализацию Rab11 и Rab11-регулируемый мембранный трафик способом. который зависит слияния клеток7. Такая регуляция рециклинга может быть важной для ведения субнаборов липидов и белков в растущие клеточные отростки. Для некоторых , высокое содержание холестерола в мембранах снижает их возвращение из мембран-мишеней с помощью ингибитора GDP-диссоциации. Это косвенно ингибирует активность Rabs, которые участвуют в эндосомном мембранном транспорте105-107. Увеличение уровней Rab может частично смягчить эту проблему, т.к. исходя из способности избыточно экспрессирующих поздними эндосомами Rab7 или Rab9 снижает отложения холестерола в клетках, которые затронуты лизосомными болезнями хранения108.
Cholesterol efflux
Элиминация холестерола из макрофагов является ключевым процессом, который служит для предупреждения удержания холестерола при , и представляет первую критическую ступень в обратном транспорте холестерола. Большая часть холестерола пузырчатых (foam) клеток хранится в липидных каплях, а увеличение гидролиза холестеролового эфира макрофагов увеличивает истечение холестерола из макрофагов109. ABC транспортеры являются ключевыми регуляторами экспорта клеточного холестерола, не только из макрофагов, но и также из др. типов клеток, с ABC транспортером A1 () обеспечивающим скорость-ограничивающую ступень в формировании частиц HDL и поддержание уровней HDL в плазме110. ABCA1 экспрессируется повсеместно и изучение ткане-специфичных нокаутов ABCA1 показало, что экспрессия печеночного и кишечного ABCA1 являются главными детерминантами уровней HDL у мышей111.
Связывание бедного липидами или свободного apoprotein A-I (APOA-I; основного апопротеина HDL) с ABCA1 транспортером, по-видимому, служит в качестве пускового механизма для мульти-ступенчатого процесса, с помощью которого фосфолипиды и холестерол переносятся на APOA-I , чтобы генерировать (Fig. 5). Представлено несколько моделей для объяснения, как ABCA1 облегчает высвобождение липидов на APOA-I (see Refs 112,113 for reviews) настолько, насколько мембранные домены, которые обладают ABCA1 и которые участвуют в высвобождении холестерола и фосфолипидов на APOA-I были проанализированы с помощью классических биохимических методов114, 115. Принимая во внимание, что обогащение sphingolipid донорской мембраны обычно тормозит мобилизацию холестерола, то очень возможно, что большая часть истечения липидов происходит в более жидких доменах. Это сравнимо со следующими находками: места с высокой APOA-I связывающей способностью являются богатой phosphatidylcholine (скорее, чем богатой sphingomyelin) областью112; ABCA1 разрушает платформенные микродомены116; а кавеолы могут не представлять собой преимущественные места для утечки холестерола этого пути117.
Процесс истечения холестерола использует плазматическую мембрану и эндоцитотические события, но как биохимически различимые стадии ABCA1-APOA-I-зависимого высвобождения липидов компартментализованы в клетке, остается неизвестным. lipid release are compartmentalized in the cell remains to be addressed. Очевидно, что эндосомы играют важную роль: ABCA1 вносит вклад в истечение холестерола из поздних эндосом, и иногода вовлекаются белки поздних эндосом, такие как cathepsin D и NPC1118, 119. Более того, белки, которые регулируют рециклинг или поставку экзоцитических мембран, такие как Rab8, усиливают истечение холестерола на APOA-I, возможно путем облегчения recycling circuits (круга превращения) и тем предупреждая образование богатых холестеролом лизосомных sink (приёмников)120.
Второй ABC транспортер, ABCG1, кооперирует с ABCA1 путем дальнейшего добавления клеточных липидов к возникающим частицам, это ведет к созреванию HDL (Fig. 5). Ранние исследования роли ABCG1 в истечении холестерола и в атеросклерозе дали противоречивые результаты121-123, частично, возможно, из-за компенсаторной позитивной регуляции ABCA1. Более недавние данные показали, что ABCA1 и ABCG1 действуют синергично для обеспечения экспорта холестерола на APOA-I124, 125. Целенаправленное разрушение ABCA1 и ABCG1 макрофагов ведет к полному устранению утечки холестерола in vitro, снижению специфичного для макрофагов обратного транспорта холестерола в каловые массы in vivo и к ускоренному атеросклерозу126, 127. Вместо этого, scavenger receptor B1 (), который также может облегчать переход холестерола в HDL, не способствует истоку холестерола из макрофагов in vivo128. Это возможно из-за параллельного увеличения клеточного потребления HDL cholesteryl эфира с помощью SRB1 (Ref. 129).
Specialized pathways of cholesterol trafficking
Enterocytes. Внутри просвета кишечника, micellar растворение пищевых стеролов с помощью желчных кислот помогает им перемещаться посредством диффузии через барьер абсорбтивных клеток, энтероцитов. Растительные стеролы и обладают более высоким сродством к мицеллам желчных солей, чем холестерол и путем вытеснения холестерола из мицелл они снижают его абсорбцию. Следовательно, повышенное потребление пищевых растительных стеролов или stanols может использоваться как стратегия снижения холестерола. ABCG5/G8 транспортер функционирует на апикальной части мембраны энтероцитов, чтобы экспортировать абсорбированный холестерол и растительные стеролы из энтероцитов в в просвет кишечника130 (Fig. 6).
Более того, NPC1-подобный белок , который обнаруживается на апикальной мембране энтероцитов, может активно усиливать поглощение холестерола, способствуя прохождению стеролов через brush пограничную мембрану131. NPC1L1 структурно гомологичен NPC1 и включает SSD, но его экспрессия ограничена тонким кишечником и печенью, тогда как NPC1 экспрессируется повсеместно. Как и для NPC1, точный механизм переноса холестерола с помощью NPC1L1 неизвестен, но белок локализуется в апикальном домене энтероцитов и несколько линий доказательств указывают на то, что NPC1L1 является мишенью для ингибитора абсорбции холестерола ezetimibe131. Как абсорбированный холестерол транспортируется в энтероциты, чтобы достичь места сборки chylomicron в ER, в основном неизвестно. NPC1L1 может быть функционально связан с NPC1 у некотоирых видов, таких как D. melanogaster, у которых NPC1 ортолог влияет на потребление холестерола132. Однако у мышей ни NPC1, ни NPC2, по-видимому, не играют роли в абсорбции кишечного холестерола133. Безусловно, поиск дополнительных белков, которые участвуют в абсорбции стерола intra-enterocyte оправдан, не только из-за их потенциала служить мишенью, ограничивающей поглощение пищевого холестерола.
Укороченный вариант APOB, APOB48, используется как апопротеин для упаковки абсорбированных липидов, чтобы сформировать chylomicrons в энтероцитах. В ER энтероцитов холестерол становится эфиризированным с помощью энзима ACAT2 и частицы секретируются из ER в покрытые COPII пузырьки, чтобы достичь лимфатических сосудов на базолатеральной стороне эпителия134.
Hepatocytes. Чтобы секретировать триглицериды и холестерол, гепатоциты собирают VLDL частицы. Если липиды доступны в ER, то вновь синтезированный полипептид APOB взаимодействует co-translationally с микросомальным белком переноса триглицеридов (microsomal triglyceride transfer protein ()). Как MTP катализирует инкорпорацию липидов для облегчения сборки VLDL не очень понятно. Недавние результаты указывают на то, что нейтральные липиды (cholesteryl эфиры и триглицериды) не нужны, т.к. активности МТР по переносу phospholipid достаточно для сборки и секреции примордиальных APOB липопротеинов135. Несмотря на это добавление липидов помогает белку APOB укладываться на формирующейся частице и тем самым защищать от деградации136. Незрелые, частично lipidated VLDL частицы затем секретируются в покрытые COPII пузырьки из ER и транспортируются в комплекс Golgi137 (Fig. 7). Масса триглицеридов добавляется на post-ER станции, преимущественно в Golgi, благодаря зависимости процесса от - GTPase, которая необходима для событий Golgi trafficking138. Динамика, которая участвует в дальнейшем созревании частиц VLDL, чтобы увеличить их lipidation, неизвестна. Липидные капельки могут вносить вклад в рост частиц137. Более того, процессинг LDL рецептора и эндосомных липидов также участвует в регуляции APOB lipidation и сборки VLDL139, 140.
Гепатоциты также являются основным источником APOA-I и HDL. Эндогенно продуцируемый APOA-I может быть lipidated как с помощью de novo синтезированного, так и LDL-производного холестерола, а печеночная ABCA1 участвует в процессе на уровне Гольджи и плазматической мембраны141. В резком контрасте с макрофагами, у гепатоцитов отсутствие функции NPC1 ассоциирует в повышенной lipidation APOA-I, отражающей повышенные уровни ABCA1142.
Как часть процесса обратного транспорта холестерола, гепатоциты потребляют холестерол из HDL посредством scavenger receptor SRB1. В этом процессе только холестерол и cholesteryl эфиры, как полагают. селективно переносятся в клетки, тогда как др. липиды и апопротеины остаются в липопротеиновых частицах. Компартмент, участвующий в гидролизе стероловых эфиров, которые проходят по этому пути, неизвестен, но он не использует функцию NPC1143. Экспрессия SRB1 коррелирует с секрецией холестерола с желчью, но зависит ли это от активности SRB1 в этой и/или от базолатерального эндоцитического рециклинга HDL остается открытым144, 145. Интересно, что часть митохондриального ATP synthase комплекса также была идентифицирована как рецептор гепатоцитов для поглощения целых HDL частиц. Цепочка β ATP synthase (лучше известная как домен, который обеспечивает связывание и гидролиз нуклеотидов) , ка кбыло обнаружено, действует как APOA-I рецептор в печеночном эндоцитозе HDL146.
Проникший стерол в гепатоциты посредством SRB1 курсирует в канальцевую мембрану, где он секретируется ABCG5/G8-transporter-зависимым способом в желчь147. Более того, недавние находки указывают на то, что помимо своей роли в энтероцитах, NPC1L1 действует также в гепатоцитах, чтобы регулировать концентрацию холестерола в желчи. Действие печеночного NPC1L1, по-видимому, служит противовесом действию ABCG5/G8 , т.к. трансгенная экспрессия NPC1L1 приводит к снижению уровней холестерола в желчи148.
Cholesterol trafficking in the CNS. Некоторые ABC транспортеры, включая ABCA1, ABCG1 и ABCG4, экспрессируются в ЦНС и доказательств их роли в транспорте холестерола как в нейронах, так и глие горы149-151. Однако нет количественной информации о переносе стеролов между разными типами клеток в головном мозге. Холестерол удаляется из ЦНС, чему способствует генерация 24S-hydroxycholesterol ER энзимом , который экспрессируется преимущественно в головном мозге152. Cerebrosterol диффундирует поперек энцефало-кровяного барьера и затем превращается в желчные кислоты с помощью печени153. Однако др. системы элиминации холестерола возможно оперируют параллельно, т.к. нокаут этого пути лишь частично ингибирует исток холестерола из головного мозга154. Несмотря на высокое содержание холестерола в головном мозге, эта экскреция стерола составляет только около сотой части от всех не печеночных тканей из-за низкого оборота холестерола в миэлине. Очевидно. что это не исключает возможности того, что субпопуляции клеток в ЦНС могут быть высоко активными в отношении метаболизирования и транспорта стеролов.
Некоторые липоротеиновые рецепторы и аполипопротеины экспрессируются в ЦНС, но роль большинства из них в транспорте холестерола неизвестна. Наиболее охарактеризованной системой доставки холестерола является секреция APOE-содержащих липопротеинов с помощью астроцитов. Эти глиальные поставки холестерола рассматриваются как важные для созревания функциональных синапсов155. Более того, по крайней мере, некоторые взрослые нейроны могут удовлетворять свою нужду в холестероле из своего окружения, возможно используя стерол из глии паракринным способом
156.
Conclusions and future directions
Significant advances in the complex area of cellular cholesterol trafficking and compartmentalization have been reached during the past few years. New regulators of these processes have been identified and are being studied in increasingly sophisticated models, such as tissue-specific gene-knockout mice. Methods are being developed for high-resolution imaging of lipid movement and for in vivo tissue imaging in live animals. These improvements will continue to make the study of cholesterol transport and distribution much more accessible to research.
Several issues await further studies. Parameters for cholesterol movement and interaction with other lipids in the membranes of living cells need to be characterized. These should essentially help to interpret and make predictions about larger-scale sterol movement between organelles or exchange between membranes and lipoproteins. For most sterol transport processes, only a limited number of proteins that are involved have been identified. There is still little understanding of the interplay between the different proteins, and considering the paucity of characterized protein–protein interactions, important players must be missing. Further studies on members of large lipid-binding protein families, such as ORPs and START proteins, as well as genome-wide strategies, should reveal new components. New readouts for sterol transport and distribution that are compatible with high-throughput screens should also be developed.
In addition, there is an apparent need to understand the orchestration of sterol balance in complex systems, such as between individual cell types of the brain, and in key cells that are relevant for whole-body sterol metabolism, particularly hepatocytes and enterocytes. Also, less recognized territories in cholesterol research, such as the muscle and skin, deserve attention. Besides increasing our insights into the physiology of cholesterol trafficking, the information obtained should help to develop improved strategies for controlling cholesterol-related pathologies.
