Irxl1 впервые идентифицирован у мышей как новый член TALE суперкласса гомеобоксных генов. Поиск по базам данных выявил, что предполагаемые irxl1 ортологи существуют в геноме различных видов. Мы клонировали ген irxl1 рыбок данио и показали, что он высоко консервативен среди видов позвоночных. Удивительно, гомеодомен обнаруживает 100% гомологию с ортологами позвоночных. Кроме того, белковые последовательности, геномная организация irxl1 также гомологичны. Гены организованы в 7 экзонов и занимают протяженность 73 т.п.н., 70 и 47 в геноме человека, мыши и рыбок данио, соотв. Размеры экзонов варьируют от 34 п.н. в экзоне 6 ( у всех трех видов)до 2,541 п.н. у человека),2,055 п.н.(мышь) и 1,882 п.н. (рыбок данио) в экзоне 7. Размеры интронов довольно большие, с крупнейшим интроном 5(59 т.п.н. у человека, 55 т.п.н. у мыши, и 27 т.п.н. у рыбок данио (Weinmann et al., 2005; Anderson it al., 2006). Высокая степень гомологии в структуре и последовательностях генов irxl1 у позвоночных, особенно в гомеодоменовом регионе, строго указывает на то, что он является ключевым регулятором развития позвоночных. Интересно, что два сплайс-варианта irxl1 обнаруживаются у эмбрионов и во взрослых тканях рыбок данио. Поскольку b изоформа не была описана у др.видов, то неясно на данный момент, представляет она уникальную форму или выполняет какую-то специфическую роль у рыбок данио.

Во время эмбрионального развития мышей экспрессия РНК irxl1 впервые обнаруживается на ст. E8.5-E9.5 в дорсальном регионе дермомиотома передних сомитов (Anderson et al., 2006; Liu et al., 2006; Takeuchi and Bru-neau, 2007). Позднее (E10.5-E11.5), домен экспрессии расширяется кзади на туловищные и хвостовые сомиты,в основном ограниченная клетками предшественниками скелетных мышц,сухожилий и хрящей (Anderson et al., 2006). Соотв, RT-PCR анализ показал,что экспрессия irxl1 в развивающихся эмбрионах рыбок данио начинается на ст. 18 hpf (18 сомитов), которая соответствует ст. эмбриогенеза мыши (E)9.5 (20-сомитов). Хотя WISH анализ оказался неспособным выявить чётко выраженный паттерн транскриптов irxl1 в развивающихся сомитах,но экспрессия irxl1 в области туловища была подтверждена с помощью RT-PCR эмбрионов ст. 24-72 hpf (Supp. Fig. SI). Возможно, что низкие уровни irxl1,экспрессируются в регионе туловища, или напротив, лишь немногие клетки в этой области экспрессируют irxl1. В самом деле, мышиный Mkx не транскрибируется в компартменте миотома сомитов, скорее его экспрессия ограничена дорсомедиальной и вентролатеральной губами дермамиотома, где находятся миогенные предшественники (Anderson et al., 2009).

На ст. 24 hpf, чёткая экспрессия irxl1 у рыбок обнаруживается в тканях головного мозга,включая телэнцефалон. У эмбрионов мыши высокий уровень экспрессии РНК irxl1 также обнаруживается в регионе лба (forehead) вентральнее телэнцефалических пузырей (Liu et aL, 2006). Кроме того сильная экспрессия irxl1 обнаруживается в производной нервного гребня головной мезенхиме, нёбной мезенхиме и в мезенхимных клетках перед оссификацией, окружающих Меккелев хрящ в нижней челюсти (Liu et aL, 2006). Этот паттерн челюстно-лицевой экспрессии одинаков у эмбрионов мышей и рыбок данио. Более того, irxl1 рыбок данио широко транскрибируется в различных взрослых тканях, включая мышцы и семенники, которые, как было показано, экспрессируют irxl1 и у мышей. Т.о., irxl1 рыбок данио может регулировать процессы развития преимущественно на более поздних стадиях или только в субнаборах клеток и т.о., минимально экспрессируются в туловище во время сомитогенеза. Недавно было продемонстрировано,что мышиный irxl1 (Mkx)действует как репрессор транскрипции. Будучи внесенным в 10T1/2 фибробласты, irxl1 был способен блокировать MyoD-управляемую конверсию фибробластов в миобласты (Anderson et al., 2009). Это согласуется с нашим наблюдением,что транскрипцияmyoD в туловищных сомитах активируется у irxl1 morphants на ст. 48-58 hpf (Fig,. 6H, 9). Фактически, наши предварительные данные показали, что irxl1 рыбок данио может репрессировать активность промотора myoD (unpublished results). т.о., irxl1 может быть необязательным во время ранних стадий миогенной дифференцировки, но его активность необходима для подавления миогенных факторов после завершения миогенеза.

irxl1 является наиболее близким к irx генам,т.к. было показано, что регулирует экспрессию пронейральных генов и специфицирует нейроэктодерму как у Drosophila так и у позвоночных.

В сотрудничестве с др. транскрипционными факторами гены irx также участвуют в подразделении нервной пластинки (Gomez-Skarmeta and Modolell, 2002). У рыбок данио 11 irx генов экспрессируются в определенных доменах нервной системы и, как полагают, участвуют в формировании нейрального паттерна, нейрогенезе и нейрональной спецификации (Lecaudey et aL, 2005). ген irxl1 также экспрессируется в нервной системе мышей и рыбок данио. Наши результаты показали, что нокдаун irxl1 ведет к дефектному морфогенезу головного мозга.  У затронутых эмбрионов дифференцировка всех основных регионов головного мозга и региональная спецификация вдоль  передне-задней и дорсо-вентральной осей нервной системы, по-видимому,  нормальна, как показывает экспрессия специфических маркерных генов (Fig. 5G-L and data not shown). Однако головной мозг неспособен удлиняться нормально вдоль передне-задней оси и формирование желудочков переднего и среднего мозга дефектно. Т.о., в отличие от генов Irx, ген irxl1, по-видимому, не участвует в ранней нейральной спецификации и формировании паттерна. Вместо этого он может функционировать в морфогенезе головного мозга на более поздних стадиях. Это также согласуется с его довольно поздней ст. экспрессии во время эмбриогенеза рыбок данио. В дополнение к морфогенезу головного мозга наиболее выраженный дефект у морфантов irxl1 обнаруживается в фарингеальных дугах. Развитие фарингеальных дуг затрагивает энтодермальные, мезодермальные и нервного гребня производные, все эти компоненты обнаруживают дефекты у irxl1 эмбрионов морфантов. Во-первых, энтодермальные карманы были представлены, но они оказывались слиты и дезорганизованы (Fig. 6D). Было показано, что энтодерма, также как и нервный гребень, играют важную роль в установлении и формировании паттерна фарингеальных дуг (Graham, 2003). Т.о., дезорганизация энтодермальных карманов может вести к деформации дуг у морфантов. Во-вторых, большинство головных мышц возникает из краниальной параксиальной мезодермы. Путем взаимодействий в окружающим краниальным нервным гребнем мезодерма дифференцируется в зачатки головных мышц, которые в дальнейшем формируют окологлазные мышцы и мышцы фарингеальных дуг (Noden et al., 1999; Kimmel et aL, 2001). Как было продемонстрировано с помощью экспрессии myoD, формирование мышц головы, особенно мышц фарингеальных дуг, нарушается у irxl1 морфантов (Fig. 6F,H). Наконец, анализ маркеров нервного гребня sox9b и snail2 на ст. 18-24 hpf выявил значительное снижение уровней и доменов экспрессии у irxl1 морфантов (Fig. 7), указывая тем самым на раннюю дифференцировку и миграцию клеток нервного гребня, уже затронутого нокдауном irxl1.

Это также подтверждается исследованием экспрессии dlx2 на более поздней стадии (30 hpf). Уменьшение мигрирующих клеток нервного гребня чётко выявляется в фарингеальных дугах, особенно в задних фарингеальных дугах морфантов (Fig. 6J,L). Впоследствии дефекты нервного гребня ведут к уменьшению конденсации прехондрогенных клеток (sox9a⁺) и дифференцировки скелетогенных клеток (runx2b⁺; Fig.6M-S), приводя к формированию аномальных фарингеальных хрящей, как это наблюдается на ст. 5 dpf (Fig. 8). Дефекты внешней морфологии и формирования черепно-лицевых мышц у морфантов могут быть устранены по большей части инъекцией irxl1 cRNA, указывая тем самым, что фенотипы вызываются потерей функции irxl1. Поскольку клетки нервного гребня генерируют большинство хрящевой, нервной и соединительной тканей головы, то черепно-лицевые аномалии в основном могут быть приписаны дефектам формирования, миграции и дифференцировки клеток нервного гребня (Trainor, 2005).

Наши данные подтверждают потенциальную роль irxl1 в регуляции развития нервного гребня. Интересно, что мышиный irxl1 был идентифицирован в локусе Twirler (Tw) и рассматривался как прекрасный кандидат на роль гена Tw, исходя из его онтогенетического паттерна экспрессии (Liu et aL, 2006). Мутация Twirler вызывает расщепление губы и нёба у гомозиготных мутантных мышей. Фенотип образования дефектных хрящей в дугах irxl1 морфантов рыбок данио строго подтверждает мнение, что мышиный ген irxl1 ответственен за мутацию Tw.

Итак, мы клонировали и проанализировали ген irxl1 рыбок данио. Ингибирование трансляции irxl1 ведет к дефектному морфогенезу головного мозга, не затрагивая региональной спецификации нервной системы. Оно также вызывает дефекты формирования и/или миграции клеток нервного гребня и в конечном итоге ведет к потере черепно-лицевых мышц и деформации хрящей дуг. Эти результаты указывают на то, что белок irxl1 может регулировать факторы, которые необходимы для дифференцировки нервного гребня и хондроцитов и тем самым участвует в морфогенеза дуг у рыбок данио.