Посещений:
Протокадхерин 18

Паттерн Экспрессии

Expression of protocadherin 18 in the CNS and pharyngeal arches of zebrafish embryos
FUMITAKA KUBOTA, TOHRU MURAKAMI, YUKI TAJIKA and HIROSHI YORIFUJI
Int. J. Dev. Biol. 52: 397-405 (2008) doi: 10.1387/ijdb.072424fk

Here, we report the results of molecular cloning and expression analyses of a nonclustered protocadherin (pcdh), pcdh18 in zebrafish embryos. The predicted zebrafish pcdh18 protein shows 65–66% identity and 78–79% homology with its mammalian and Xenopus counterparts. It has a Disabled-1 binding motif in its cytoplasmic domain, which is characteristic of pcdh18. Zebrafish embryos expressed pcdh18 by the early gastrula stage, 6 h post-fertilization (hpf), in their animal cap but not in the germ ring or the shield. pcdh18 was expressed in the neural tube and the central nervous system (CNS) from 12 hpf. Some populations of cells in the lateral neural tube and spinal cord of 12–18 hpf embryos expressed pcdh18, but expression in these cells disappeared by 24 hpf. The hindbrain of embryos at 24–56 hpf expressed pcdh18 in cells closely adjacent to the rostral and caudal rhombomeric boundaries in a thread-like pattern running in the dorsoventral direction. The pcdh18-positive cells were localized in the ventral part of the hindbrain at 24 hpf and in the dorsal part from 36 hpf. pcdh18 was also expressed in the telencephalon, diencephalon, tectum, upper rhombic lip, retina and otic vesicle. Expression in the CNS decreased markedly before hatching. Pharyngeal arch primordia, arches, jaws and gills expressed pcdh18, and the molecule was also expressed in some endodermal cells in late embryos
Дифференциальная адгезия играет жизненноважную роль в морфогенезе во время эмбрионального развития (Steinberg, 1970). Сверхсемейство cadherin , как полагают, составляет гласную молекулярную основу для такой клеточной адгезии (for review, Halbleib and Nelson, 2006; Takahashi et al., 2005). Protocadherins (pcdh) составляют наикрупнейшее подсемейство cadherins, которое обладает общими структурными признаками во внеклеточных доменах, но отсутствует существенное сходство их цитоплазматических доменов в отличие от классиыеских cadherins. Многие из pcdh формируют генные кластеры, аналогичные клестерам immunoglobulins. Сробранные в кластеры pcdh более или менее дифференциально экспрессируются в ЦНС? и как полагают, участвуют в систематическом контроле морфогенеза ЦНС (Bass et al., 2007, Esumi et al., 2005, Hirayama and Yagi, 2006, Tada et al., 2004). Однако недавние находки указали на аллельную и комбинационную генную регуляцию кластрированных pcdh (Morishita and Yagi, 2007). Это делает не собранные в кластеры pchd более привлекательными как по-разному контролируемые адегивные образования, функционирующие для обеспечения морфогенеза.
Немногие из не собранных в кластеры pcdh, а именно pcdh8, 10 и 15 играют известные роли в определенных морфогенетических событиях (Kazmierczak et al., 2007, Le Guedard et al., 2007, Murakami et al., 2006, Rhee et al., 2003, Yamamoto et al., 1998), хотя биологическое значение большинства не собранных в кластеры pcdh неищвестно. Субкласс некластированных pcdh включает pchd1, 7, 8, 9, 10, 11, 17, 18 и 19 характеризуется общим и сильно законсервированным цитоплазматическим мотивом неизвестной функции, CM-2 (Wolverton and Lalande, 2001). В ходе нашего исследования этого pcdh субкласса мы клонировали pcdh18 рыбок данио и его паттерн экспрессии у развивающи хся эмбрионов.

Cloning of pcdh18


кДНК pcdh18 рыбок данио была амплифицирована с помощью PCR из библиотеки cDNA (Supplimentary Fig. S1). Установленные последовательности pcdh18 рыбок данио представлены 1,150 аминокислотами и обнаруживают консервацию характерных признаков



Fig. 1. Overview of pcdh18 expression in zebrafish embryos. Panels show extended depth of field photographs (see Experimental Procedures) of embryos stained blue by in situ hybridization for pcdh18 transcripts. Orange numbers indicate hours post-fertilization. Black arrows indicate the germ ring. Black arrowheads indicate the shield. Thin white bars show the triangular area of expression in 9 hpf embryos. Open arrows indicate punctuate expression in the head and trunk. The animal pole is aligned toward the top in lateral, dorsal, and ventral views. Dorsal is to the right in lateral views and down in animal pole views. Abbreviations: G, gills; MHB, midbrain-hindbrain boundary; PA, pharyngeal arch primordia or arches; PF, pectoral fin.

семейства pcdh, включая сигналную последовательность, 6 cadherin домена, одиночный трансмембтранный домен и цитоплазматический домен (Supplementary Fig. S2). Он обнаруживает 65–66% идентичность и 78–79% гомологию на аминокислотном уровне с известным pcdh18 и KIAA1562 белками человека. мышей, крыс и Xenopus. Первые 5 кадхериновых доменов и трансмембранный домен обнаруживают высокую степень идентичности и гомологии (Supplementary Fig. S3). УВ рыбок данио pcdh18 имеет Disabled-1 (Dab1) связывающий мотив (F/YxNP илиr Phe/Tyr-any-Asn-Pro) в цитоплазматическом домене, который характерен для pcdh18 разных видов (Homayouni et al., 2001) (Supplementary Fig. S2). Dab1 является адапторным белком, который опосредует Reelin сигналы, которые влияют на клеточную миграцию и позиционирование в развитии головного мозга млекопитающих. Dab1 , как было показано, взаимодействует с pcdh18 посредством связывающего мотива. Рыбий pcdh18 имеет CM-2 мотив в цитоплазматическом домене.

pcdh18 expression in early embryos


Транскрипты pcdh18 сначала экспрессируются диффузно в анимальной шапочке эмбрионов ранней гаструлы на 6 hours post-fertilization (hpf) (Fig. 1, 6 hpf). Экспрессия иногда более интенсивна дорзальнее. чем вентральнее и исключается из зародышевого кольца и щитка (дорсальный организатор).На ст. средней гаструлы или 9 hpf, pcdh18 становится более явно локализованным на дорсальной половине эмбриона. Нрубо треугольный паттерн экспрессии появляется в проспективной головной области (Fig. 1, 9 hpf), и головные структуры продолжают экспрессировать pcdh18 в ходе всего развития (Fig. 1, 9–72 hpf). На 12 hpf, небольшая точечная экспрессия появляется в голове и туловище (Fig. 1, 12–14 hpf). Точки грубо выстраиваются в две или четыре парасагитальные линии, но не в точной симметрии. Точечная экспрессия начинает снижаться на ст. 18 hpf и почти полностью исчезает в 24 hpf (Fig. 1, 18–24 hpf). Поперечные cryostat срезы выявляют. что точки представлены pcdh18-экспрессирующими клетками в боковых частях нервной труки и спинного мозга (Fig. 2, A–C). Исходя из их локализации (Bernhardt et al., 1990, Kuwada et al., 1990, Myers et al., 1986), эти pcdh18-позитивные клетки, по-видимому, соответствуют субнабору спинальный интернейронов, а дорсо-латеральные клетки могут быть Rohon-Beard нейронами.

Expression in the brain


У 12-hpf эмбрионов, pcdh18 экспрессируется диффузно в ростральной области (Fig. 1, 12 hpf). в 14 hpf, экспрессия становится более четкой по отношению к ст руктурами, таким как глаза, передний мозг, средний и задний мозг и зачатки фарингеальных дуг (Fig. 1, 14 hpf). У 18-hpf



Fig. 2. pcdh18 expression in the hindbrain and spinal cord. Orange numbers indicate hours post-fertilization. Black dotted lines outline the structures indicated. Black arrowheads in transverse sections of the trunk of 12–18 hpf embryos (A-C) (dorsal to top) indicate pcdh18-expressing cells in the lateral neural tube and spinal cord. (D) Dorsal view of a 24 hpf embryo stained for pchd18 and krx-20 with single-color double in situ hybridization. Parentheses indicate rhombomeres. Inset shows a focal plane of an area of krx-20 expression which is located ventral to that of pcdh18 expression. Green arrowheads in the lateral view of a 28-hpf embryo (E) indicate focal planes in hand-cut sections (F-H)(dorsal to top) made from the very same embryo. (F) A composite picture of two closely adjacent focal planes. (I) A dorsal view of the hindbrain (rostral to the top) of a 42 hpf embryo with patterns of transverse dotted lines. Abbreviations: M, midbrain; N, notochord; NT, neural tube; OV, otic vesicle; R, rhombencephalon; r3 & 5, rhombomere 3 & 5; SC, spinal cord; URL, upper rhombic lip.

эмбрионов экспрессия pcdh18 прродолжается в зачатках глаз, отических пузырьках, переднем мозге и вентральных частях среднего мозга и свего заднего мозга (Fig. 1, 18 hpf). Обнаруживается перерыв экспрессии на границе между слредним и задним мозгом во время периода 14 -8 hpf (Fig. 1, 14–18 hpf). В 24 hpf, появляются поперечные линии экспрессии в дорсальном и латеральных аспектах rhombencephalon (Fig. 1, 24–56 hpf). Паттерн, заставивший нас идентифицировать расположение линий в ромбомерах в терминах сегментации ромбомеров. Двойное окрашивание на pcdh18 и krox-20 (Oxtoby and Jowett, 1993) транскрипты показало, что линии локализуются в тесной близи к ростральным и каудальным границам ромбомеров (Fig. 2, D). Изучение поперечных срезов цнлых окрашенных 28-hpf эмбрионов показало. что экспрессия локализуется в вентральной части ромбэнцнфалона, идущей в поперечной плоскости от ventrolateral к dorsomedial части (Fig. 2, E–H).




Fig. 3. Expression in the CNS and pharyngeal arches in sections. Orange numbers indicate hours post-fertilization. Colored lines A–O in the lateral view of a 42-hpf embryo (lower left) indicate planes of serial sections (A-G) (horizontal sections; rostral to the top) and (H-O) (transverse sections; dorsal to the top). Abbreviations: 4V, forth ventricle; C, chin; D, diencephalon; E, endoderm; M, midbrain; MLF, medial longitudinal fascicle; OV, otic vesicle; OP, olfactory pit; PA, pharyngeal arches; PF, pectoral fin; R, rhombencephalon; Rn, retina; S, somite; T, telencephalon; URL, upper rhombic lip.

Во время периода от 36 до 56 hpf, pcdh18 продолжает экспрессироваться в ромбэнцефалоне в поперечных линях, соседних с границами ромбомеров (Fig. 1, 42–56 hpf; Fig. 2, I). В отличие от более ранних эмбрионов, pchd18 экспрессируется в дорсальной части ромбэнцефалона с 36 hpf (Fig. 1, 36–56 hpf; Fig. 3, K–N). Изучение поперечных и коронарных срезов показало, что паттерн окраски действительно выявляет pcdh18-позитивные клетки, идущие дорсовентрально в попереой плоскости (Fig. 3), одинаково с радиальной глией (Trevarrow et al., 1990). Некоторые сигнальные и транскрипционные факторы, такие как deltaA (Delta-Notch signaling), rasgef1b (Ras GEF) и beta3.1 (bHLH), как сообщалось, обнаруживают сходные паттерны экспрессии в заднем мозге (Adolf et al., 2004, Epting et al., 2007, Riley et al., 2004). Хотя функциональные взаимоотношения между этими сигналами и pchd18 ещё предстоит выяснить, интересно отметить, что pcdh18 участвует в формировании границ между ромбомерами, управляемый передачей сигналов Delta-Notch.
Анализ срезов также показал. что pcdh18 экспрессируется в телэнцефалоне, медиальных продольных fascicle диэнцефалона, tectum и верхней ромбической губе. pcdh18 экспрессируется в сенсорных системах, таких как сетчатка и отические пузырьки, но не в обонятельных луковицах или боковых линиях (Fig. 3, A–O). Экспрессия в сетчатке наиболее интенсивна в наибоее внутреннем ганглиолярном клеточном. Экспрессия в ЦНС снижается к 56 hpf (Fig. 1, 56 hpf). Характерный паттерн в заднем мозге почти полностью исчезает к 72 hpf (Fig. 1, 72 hpf).

Expression in pharyngeal arches and other structures


pcdh18 экспрессируется в зачатках фарингеальных дуг с 14 hpf (Fig. 1, 14 hpf). Он эк в фарингеальной, максиллярной и мандибулярной дугах у более поздних эмбрионов (Fig. 3, F, G, I, J), и в бранхиальных и челюстных дугах в 72 hpf (Fig. 1, 72 hpf, and Supplimentary Fig. S4, A). Замороженные срезы 72 hpf эмбрионов показали, что pch18 экспрессируется в энкапсулированных бранхиальных хрящах (Supplimentary Fig. S4, A, C). Зачаток грудного плавника экспрессирует pcdh18 с 24 hpf до 56 hpf (Fig. 1, 24–56 hpf). Некоторые энтодермальные клетки, экспрессируют pcdh18 у поздних эмбрионов (Fig. 3, O). в
Предыдущие исследования показали, что pcdh18 белок и передача сигналов reelin-Dab1 участвуют в одонтогенезе у млекопитающих (Carroll et al., 2001, Fukasawa et al., 2005, Heymann et al., 2001, Homayouni et al., 2001). Рыбки данио имеют фарингеальные зубы, которые прикрепляются к 5th бранхиальной дуге на 4–6 days post fertilization (dpf). Т.к. у рыбок данио pcdh18 обладает сайтом связывания Dab1, mk мы ожидали увидеть некоторое увеличение экспрессии pcdh18 в этих или родственных зубах. Против ожиданий мы не нашли связанной с зубами экспрессии pchd18 ни в 72 hpf ни в 5 dpf (Supplementary Fig. S4).

Conclusions


We cloned a zebrafish non-clustered pcdh, pcdh18, and characterized its embryonic expressions in detail. pcdh18 was expressed in the neural tube, CNS, eyes, otocysts, pharyngeal arches, and some endodermal cells. The expression in the hindbrain was particularly interesting in terms of the rhombomere segmentation. We are addressing the identities of the cells expressing pchd18, and the functional significances of pcdh18 in the CNS morphogenesis.
The expression pattern of pcdh18 in zebrafish embryos seemed to be quite different from that in mice; pcdh18 expression is rather systemic in rodents (Homayouni et al., 2001, Kim et al., 2007), whereas it was limited to the CNS and head structures in zebrafish. Teleost fish including zebrafish often have diversified alleles homologous to a mammalian counterpart supposedly due to ancient whole gene duplications (Stock, 2007, Wittbrodt et al., 1998). Blast searches indicate that there are two alleles (EU267178 and our AB297803) in the zebrafish genome homologous to mammalian pcdh18. It is interesting to suppose these pcdh18 alleles acquired differential rolls in zebrafish development. Nonetheless, further comparative studies on the functional diversity of pcdh18 in different species are required.
Сайт создан в системе uCoz