Существенный прогресс был достигнут в последние 50 лет в понимании энзимологии и регуляции биосинтеза PC и некоторых др. фосфолипидов.
PEMT превращает PE в PC в трех последовательных реакциях метилирования, которые используют S-adenosinmethionine в качестве донора метильной группы (Fig. I). PEMT экспрессируется в основном в печени (13) и продуцирует ~30% печеночного PC, тогда как путь CDP-choline продуцирует 70% PC (7). Ген мыши, кодирующий PEMT, (Pemt) был разрушен (14), Pemt-/- мыши, которых кормили соотв. диетой, не обнаруживали фенотипиеских отклонений. Если же Pemt-/- мышей кормили choline-deficient (CD) диетой, то концентрация печеночного PC у Pemt-/- мышей оказывалась ~50% ниже, чем в норме и недостаточность печени обнаруживалась спустя 3 дня (15), Т.о., PEMT, по-видимому, помогал выживать во время эволюции, предоставляя PC/choline, когда холина в пище было недостаточно.
Механизм, отвечающий за драматическую потерю печеночного PC, и как это ведет к печеночной недостаточности, был выяснен. Печень секретирует липопротеины и желчь, содержащие существенные количества PC. Поэтому существует огромная утечка PC из печени с желчью. Поэтому было предположено, что когда биосинтез PC ослабляется за счет одновременного отсутствия PEMT и холина в пище, то количество PC, секретируемого в желчь, не может быть замещено новым синтезом. Pemt-/- мыши были скрещены с мышами, у которых PC flippase (Mdr2) на мембране желчных канальцев была элиминирована и тем самым предотвращалась секреция PC в желчь (16). Mdr2-/- мышей и с двойным нокаутом мышей кормили CD диетой. Быстрое снижение PC, которое происходило в печени Pemt-/- мышей, было ослабленным у Pemt-/-/Mdr2-/- мышей (17). Эти мыши не обнаруживали печеночной недостаточности после 3-х дней дефицита холина и жили более 90 дней.
Неожиданно, PC в печени таких мышей, которых держали на CD диете в течение 21 дня, оказалось на 50% меньше, чем у мышей, получавших холин. Ясно, что печеночная недостаточность обусловлена не просто снижением печеночного PC. Более того, печеночная недостаточность не может быть связана с steatosis, поскольку Pemt
-/-/Mdr2
-/- мыши накапливают больше печеночного
Fig. 1. Genes of phospholipid synthesis that have been disrupled in mice. Cho, choline; Etn, ethanolaminc, Names in italics are genes encoding the following enzymes: Chka.b, choline kinase; Eki2, ethanolarnine kinase; Pcytla.b, CTP:phosphocholine cytidyty-transferase; PcytZ CTP:phosphoethanolamine cyiidylykransferase; Pemt, phosphatidylethanolamine N-methytransferase; Pisd, phos-pfiatidylserine decarboxylase: Pssl,2, phosphatidylserine synthase.
triacylglycerol (TO) gпосе 21 дня CD диеты, чем Pemt
-/- мыши после3-х дней. Поэтому изучали механизм, который вызывает печеночную недостаточность у Pemt
-/- мышей на CD диете (18). Был сделан вывод, что снижение молярного соотношения PC/PE отвечает за развитие steatohepatitis и печеночной недостаточности. Т.о., соотношение PC/PE в печени Pemt
-/- мышей на CD диете ~0.8 по сравнению с ~1.8 для мышей на диете с добавлением холина. предполагается, что некоторые PC клеточной поверхности (a cylindrical molecule) в Pemt
-/- гепатоцитах замещаются на PE (inverted cone-shaped molecule), это ведет к дефекту упаковки бислоя плазматической мембраны, так что молекулы протекают через плазматическую мембрану и это способствует воспалению, связанному со steatohepatitis. Последующие исследования подтвердили эту гипотезу (18). Т.о., соотношение PC/ PE, по-видимому, играет фундаментальную роль в поддержании целостности гепатоцитов.
PEMT, lipoprotein metabolism, and homocysteine homeostasis
Поскольку Pemt-/- мыши не обнаруживают заметных фенотипических отклонений, если питаются обычной пищей, но если провоцируются диетой с высоким содержанием жира и холестерола, то количество TG и apolipoprotein (apo) B100 в липопротеинах плазмы самцов мышей меньше, чем у Pemt+/+ на той же диете (19, 20). В дальнейшем более низкие количества TG и apo B100 в плазме вызывают снижение скорости секреции печеночных VLDL (19, 20). PC и cholesteryl ester в плазме мышей в основном содержатся в HDLs. У Pemt-/- мышей, содержащихся или на обычной пище или пище с высоким содержанием жира и холестерола, количество PC и cholesteryl в плазме было на 25%-45% ниже, чем у Pemt+/+ мышей на той же диете (20). Снижение липидов в плазме было обусловлено повышенной экспрессией scavenger receptor-B1 (21).
Продуктами PEMT реакции являются PC и S-adenosylhomocysteine. На каждую молекулу PC генерируется три молекулы S-adenosylhomocysteine, из которых происходит homocysteine в результате гидролиза. Уровень homocysteine в плазме Pemt
-/- мышей на 50% ниже, чем у Pemt
+/+ мышей (22). Более того, активность печеночной PEMT в 2 раза выше у мышей, нокаутных по печень-специфичой CTα, по сравнению с мышами дикого типа, а уровень homocysteine в плазме выше на 20-40% (23). Следовательно, PEMT генерирует ~50% homocysteine в плазме и это клинически важно, поскольку повышение homocysteine в плазме является фактором риска для сердечно-сосудистых заболеваний (24).
CT
CT кодируется двумя генами, Pcytlα and Pcytlβ. CTα (продукт гена Pcytlα ) в основном локализуется в ядрах многих различных типов клеток (25). Разрушение гена Pcytlα у мышей ведет к ранней эмбриональной гибели (26). CTβ (кодируемый Pcytlβ) локализуется в цитоплазме (27). Мыши экспрессируют две изоформы CTβ, CT62 и CT63, которые образуются за счет альтернативного сплайсинга CTβ транскрипта (28).
Ген Pcytlβ был разрушен у мышей. Мыши, лишенные CTβ2 выживают, но обнаруживают дисфункцию гонад (29). Основным местом экспрессии CTβ является головной мозг. Хотя Pcytlβ-/- мыши не обнаруживают очевидных нейрологических проблем, но ветвление аксонов нейронов, культивируемых от CT62-дефицитных мышей, тяжело нарушено (Deinizieux, L. and Vance, J.E., unpublished results). Эти находки согласуются с экспериментами, в которых снижение экспрессии CT62 в PC12 клетках с помощью RNA interference снижало ветвление нейритов на 60% .
Поскольку Pcytlα-/- мыши не выживают во время развития, то использовали Cre-lox системы для нарушения экспрессии CTα специфически в некоторых типах клеток in vivo. Pcytlα-/- макрофаги выглядят нормальными, хотя активность CT снижена на 70-90% (28). Если макрофаги получают ацетилированные LDLs, то активность CT увеличивается (31). Было предположено, что повышенная активность CT д. усиливать синтез PC и защищать макрофаги от клеточной гибели, вызываемой повышенным клеточным cholesterol, происходящим из липопротеинов. Подтверждает эту гипотезу то, что 71% CTα-дефицитных макрофагов выживает после инкубации ацетилированными LDL, тогда как выживает 98% макрофагов дикого типа (28). Стимуляция липополисахаридами макрофагов вызывает секрецию tumor necrosis factor-α и interleukin-6. Отсутствие экспрессии CTα в макрофагах мышей нарушает секрецию этих цитокинов, тогда как секреция interleukin-1/3 и apo E не изменяется (32). Очевидно, что PC, генерируемый посредством CTα необходим для нормальной секреции этих двух цитокинов.
Cre-lox система была также использована, чтобы инактивировать CTα в печени мышей. Дефицитные по печеночной CTα мыши жизнеспособны и плодовиты (33, 34) даже когда активность CT снижается на 85%. Количества плазматического PC, cholesterol и TG было ~50% ниже у нокаутных мышей, чем в контроле, как показано для HDLs (cholesterol and apo A1) и VLDLs (TG и apo B100). Более того, секреция как apo B100 , так и apo B48 была снижена у мышей, нокаутных по печеночной CTα (33) , а утечка cholesterol и PC была ниже у нокаутных, чем в контрольных гепатоцитах. Т.о., СTα-PC биосинтетический путь, по-видимому, является ключевым в поддержании гомеостаза липопротеинов плазмы.
Ген Pcytlα избирательно инактивируется в эпителиальных клетках легких мышей (35). Отсутствие CTα не нарушает развития мышей, но при рождении мыши страдают от легочной недостаточности. Dipalmitovl-PC в легких нокаутных мышей, также как и орошение альвеол существенно снижены. Т.о., CTα не нужен для пролиферации или дифференцировки легочного эпителия, но важен для нормальной секреции PC легкими (35).
CK
CK существует в трех разных изоформах (α1, α2 и β) , кодируемых двумя генами, Chkα and Chkβ (36). CKα экспрессируется на высоком уровне в семенниках и печени, тогда как CKβ обилен в сердце и печени. Разрушение гена Chkα у мышей вызывает эмбриональную летальность, это подчеркивает важность CKα для развития (37). Спонтанная рецессивная мутация в гена Chkβ была идентифицирована у мышей, которые характеризовались прогрессирующей мышечной дистрофией и деформациями костей у новорожденных (38). Активность CK почти полностью элиминирована в мышцах конечностей (38). Мышечная дистрофия задних конечностей у Chkβ
-/- мышей, по-видимому, вызывается ослаблением биосинтеза PC и усилением катаболизма PC
(Wu, G., Sher, R.B., Cox, G.A. and Vance, D.E.. unpublished results).
GENES ENCODING ENZYMES OF PS AND PE BIOSYNTHESIS
Клетки млекопитающих обладают двумя путями биосинтеза PE: the CDP-ethanolamine путь (1) на endoplasmic reticulum (ER) и PS decarboxylase (PSD) путь в митохондриях (39) (Fig. 1). Пространственное разделение двух путей указывает на то, что пулы PE могут быть компартментализованы в соответствии с источником биосинтеза. Количественный вклад PE биосинтетических путей в клетках млекопитающих не был тщательно исследован, хотя в некоторых типах клеток >80% PE продуцируется с помощью PSD (40).
Genes of the CDP-ethanolamine pathway
Два гена кодируют ethanolamine kinase (EK). Одна является двойной специфичности ethanolamine/CK, тогда как др. (EK-2) специфична для ethanolamine (41). Получены две линии мышей с целенаправленно нарушенным геном EK-2. В одной размер выводка уменьшен и ~20% детенышей погибает пренатально (42). В др. размер выводка и гибель детенышей и плодовитость нормальны, как и морфология эмбриональных и взрослых семенников (43). Причина различий между двумя линиями EK нокаутных мышей не установлена.
В противоположность CT, ET кодируется одиночным геном,
Pcyt2 (44). ET-дефицитные мыши были получены (45). Pcyt2
+/- мыши внешне нормальны и на тканевом уровне PE в норме. Однако ET важен для развития мышей, поскольку Pcyt2
-/- эмбрионы погибают до эмбрионального дня 8.5. Т.о., PE, синтезируемый с помощью PSD, не может замещать PE, созданный посредством CDP-ethanolamine.
Phosphatidylserine decarboxylase
PSD активность в клетках млекопитающих (Fig. 1) кодируется одиночным геном. РE синтез с помощью PSD происходит на внутренних мембранах митохондрий, а превращение PS в PE регулируется с помощью транспорта вновь-синтезированных PS с ER в митохондрии (46). Транспорт, скорее всего, использует временные контакты между митохондриями и ER доменом, называемым mitochondria-associated membranes (MAM) (47) Почти весь митохондриальный PE продуцируется
in situ в митохондриях с помощью PSD (48). Элиминация PSD у мышей вызывает эмбриональную летальность, тогда как Psd
+/- мыши выглядят нормальными. PSD-нулевые эмбрионы погибают приблизительно на 9.5 день эмбриогенеза и имеют морфологически аберрантные, фрагментированные митохондрии, указывающие на дефект слияния митохондрий (49). Вероятно, что PSD необходим для предоставления достаточных количеств митохондриального PE для нормального функционирования и слияния митохондрий. Т.о., клеточные пулы PE компартментализованы в соответствии с биосинтетическим источником и оба пути синтеза PE важны для развития мышей.
Genes of phosphatidylserine synthesis
Исследования мутантных клеток оварий Китайских хомячков показали, что PS синтезируется двумя разными PS synthases (PSSs) (Fig. 1) (50). PSS1 обменивает серин в холине из PC, тогда как PSS2 обменивает serine с PE. PSS1 и PSS2 локализуются в MAM и в основном отсутствуют в массе ER (51). PSS1 повсеместно экспрессируется в тканях мышей, но PSS2 наиболее высоко экспрессируется в семенниках (52). PSS2-нулевые мыши внешне нормальны. Однако семенники самцов Pss2-/- мышей меньше, чем у сибсов дикого типа и ~10% самцов бесплодны(52). Несмотря на 90% снижение активности по обмену серина (обеспечиваемого PSS1 и PSS2), количества PS и PE нормальны в Pss2+/- и Pss2-/- тканях (53). Т.о., PSS2 не нужен для жизнеспособности мышей, а PSS1 может , по большей части, замещать PSS2.
Полученые Pss1
-/- мыши были также жизнеспособны. Они имели нормальную продолжительность жизни, а самцы и самки плодовиты (54). Т.о., PSS1 не важен для развития и жизнеспособности мышей. Хотя общая serine-exchange активность в PSS1-дефицитных тканях была заметно снижена, PS/PE содержимое тканей не было существенно изменено. Pss1
-/- мыши были скрещены с Pss2
-/- мышами и как и ожидалось двойные нокаутные мыши Pss1
-/-/Pss2
-/- не рождались (54). Тем не менее мыши с тремя инактивированными Pss аллелями были жизнеспособны, несмотря на то, что некоторые ткани имели лишь ~10% от нормальной PSS активности и снижение в содержимом PS/PE достигало 40%. Т.о., мышам достаточно 10% от нормальной PSS активности и существенно сниженных количеств PS и PE, но минимальный порог PS/PSS, по-видимому, существенен. Эти исследования обнаруживают значительную перекрываемость двух PS биосинтетических путей. Эволюционное давление, которое сохраняет экспрессию двух PSSs остается неясным.
CONCLUSION AND THE FUTURE
Disruption of phospholipid biosynthetic genes in mice has greatly expanded our understanding of the physio logical requirements for phospholipids (Table 1). Many
gene disruptions were, not unexpectedly, embryonic lethal, because phospholipids maintain cell integrity. Several enzyme activities involved in the biosynthesis of PC, PE, and PS are encoded by multiple genes. Whereas PEMT deficiency is, for the most part, compensated by the CDP-choline pathway, ET and PSD do not substitute for one another, suggesting compartmentali/.ation of PE pools made by these pathways. Similarly, lack of CKct is not compensated by CKB, whereas in most tissues, CKB can be replaced by CKa. Moreover, PSS1 can apparently substitute for PSS2 and vice versa. Thus, only PE appears to have two functionally distinct biosynthetic routes.
If, 50 years ago, Eugene Kennedy were asked to speculate about where the phospholipid metabolism field would be in 2009, it is unlikely he would have predicted the striking development of knockout mice as a tool for understanding phospholipid function. In 1989, Kennedy wrote: "the dramatic development of eukaryotic genetics in recent years, however, will surely prove a great stimulus to studies of phospholipid biosynthesis in animal cells, as well as in yeast." (3). Twenty years later, the impact of knockout studies on understanding phospholipid metabolism and function has exceeded'expectations. If, in 1959, the question were asked: "what would be the biological impact of deleting a mouse gene of PC biosynthesis?" the answer would probably have been: embryonic death. Even in 1989, the idea was not on the radar screen that disruption of PC biosynthesis would lead to hepatic steatohepatitis, lipoprotein abnormalities, bone growth defects or muscular dystrophy, and improved protection against diet-induced obesity and type 2 diabetes (Jacobs, R.L., Zhao, Y., Koonen, D.P.Y., Kennedy, B., Dyck, J.R.B. and Vance, D.E.. unpublished results).
In the next decade, the remaining genes of phospholipid biosynthesis will likely be disrupted in mice. Perhaps therapies for human diseases will be developed based on findings in mice with disrupted genes of phospholipid
TABLE 1. Physiological consequences of gene disruptions in phospholipid biosynthesis
Mouse gene Enzyme deleted Diet Organ/cell Physiological consequence
Chkα CKα Chow All Embryonic lethality
Chkβ CKβ Chow All Hindi imb muscular dysu-ophv, neonatal bone deformity
Ek2 EK2 Chow All No apparent phenotype? Neonatal lethality?
PcytH CTα Chow Ml Embryonic lethality
Pcstlα CTα Chow Hepatocyte Reduced plasma lipoproteins
Pailα CTα HF Hepatocyte Steatosis./ steatohepatitis
Pcytlα era Chow Macrophage Resistant to cholesterol-induced cell death;
impaired secretion of cytokines
Piytlα CTα Chow Lung epithelial cells Neonatal respiratory failure
Pmiβ CTβ2 Chow All Gonadal dysfunction, defective axon branching
Pr/12 ET Chow All Embryonic lethality
Pemt PEMT Chow All No apparent phenotype
Pemt PEMT Choline deficiency All Liver failure (steatohepatitis) after 3 davs
Pemt PEMT HF/HC All Reduced plasma lipoproteins, decreased atherosclerosis
Pemt PEMT HF All Decreased obesity: increased insulin sensitivity
Psd PSD Chow All Embryonic lethality
Pss1 PSS1 Chow All No apparent phenotype
Pss2 PSS2 Chow All Male subferlilitv
Pss1/Pss2 PSS1/PSS2 Chow All Embtyonic lethality
References for these data are cited in the text. Abbreviations: HF, high fat; HF/HC; high fat/high cholesterol. Other abbreviations are as used in text.
Сайт создан в системе
uCoz