Disabled-2 (Dab2) мышей это в 96 kDa фосфобелок, участвующий в передаче сигналов CSF-1 в макрофагах, он первоначально обозначался как p96 [1]. Фрагмент Dab2 кДНК человека был изолирован на базе частой потери его экспрессии при раке яичников и был обозначен как DOC-2 (Differentially expressed in ovarian carcinoma gene 2) [2]. Гомология последовательности указыввает на то, что белок p96 является одним из двух ортологов гена Drosophila Disabled [3]; это послужило источником названия для экспрессируемого в нейронах млекопитающих Dab1 [4] и для более повсеместно экспрессируемого Dab2 [1,5].

Потеря экспрессии Dab2 при раке яичников и свойства регулирования роста в исследованиях клеточных культур привели к предположению, что Dab2 является опухолевым супрессором для рака яичников [6,7]. Впоследствии потеря или снижение экспрессии Dab2 было обнаружено и при др. типах рака, включая опухоли молочных желез крыс [8], рак молочной железы [9,10], рак толстой кишки [11], рак пищевода [12], уротелиальные карциномы [13], рак простаты [14], рак головы и шеи [15] и носоглоточные карциномы [16]. Для Dab2 были предположены механизмы по участию в организации эпителия [10,17,18] и в регуляции путей передачи сигналов Ras/MAPK [19-22], TGF beta [15,23,24] и Wnt [25-28].

Исследования по клеточной биологии выявили, что Dab2 является эндоцитотическим адапторным белком [29]. Dab2 содержит N-терминальный PTB домен, который соединяется с белками клеточной поверхности с NPXY мотивом в их цитоплазматических хвостах [30]; несколько мотивов, которые связывают clathrin и adaptin белки [31]; и C-терминальный регион, который связывает миозин myosin VI, двигательный белок направленного действия [32,33]. Т.о., Dab2 обеспечивает одновременное присоединение clathrin-покрытого груза, содержащего трансмембранные белки с одним или более мотивами NPXY, таким как low density lipoprotein (LDL) рецептором, megalin, и интегринов к миозиновым моторам, обеспечивая эндоцитоз и направленный перенос. Роль Dab2 в эндоцитозе и переносе интегринов и тем самым в подвижности клеток была подтверждена [34,35]. Модуляции эндоцитоза LDL рецепторов с помощью Dab2 в культивируемых клетках [36], и его роль in vivo ещё не установлены. Поляризованный перенос молекул клеточной адгезии, таких как интегрины и E-cadherin, может быть объяснен ролью Dab2 в полярности и организации эпителия [18], а передача сигналов рецепторов клеточной поверхности может объяснить его активность по модуляции множественных сигнальных путей [5,28,37].

Чтобы установить может ли любой из этих клеточных механизмов иметь биологическое значение и важность, получены делеции гена у мышей [17,38]. Замещение аллеля гена dab2 на betaGal-Neo привело к обнаружению ранней эмбриональной летальности у нокаутных мышей [17]. У мутантов внеэмбриональные энтодермальные клетки перемешаны с эктодермальными клетками у эмбрионов ст. E5.5 , а слой висцеральной энтодермы неспособен к развитию [17,18]. Гетерозиготные старые мыши, как было установлено, образуют кисты в яичниках и пред-неопластические изменения как в овариях, так и матке [39]. Мутация flox dab2 была получена и гомозиготные мутантные мыши с делецией также оказались эмбриональными леталями, но мутантные эмбрионы, как было установлено, персистируют до поздней стадии [38]. Кроме того, мозаики по делеции dab2 с использованием Meox2-Cre линии, как было установлено, продуцируют удивительно нормальных мышей c минорными дефектами в функции почек [38]. Единственным возможным объяснением расхождения между этими двумя dab2 мутантными линями является то, что экспрессия betaGal-Neo у dab2 мутантных эмбрионов [17] может приводить к более тяжелому фенотипу. Др. идея заключается в том, что dab2 flox мутантный аллель [38] может продуцировать укороченные белки в результате трансляции с альтернативного места старта. Следовательно, поздние нокауты могут не полными нулевыми и мутантные эмбрионы сохраняют возможность персистировать дольше.

Чтобы исследовать это различие в этих двух нокаутах и изучить дальнейшую связь биологических функций и возможной ролью опухолевого супрессора Dab2, мы получили др. flox dab2 мутантный аллель с более обширной делецией экзона, продуцирующего конституитивных и кондиционных мутантных мышей и исследовали их фенотипы, Представлена детальная характеристика эмбриональных фенотипов, кондиционных нокаутных мышей, мутантных эмбриональных стволовых клеток и эмбриоидных тел.

Discussion

Современные dab2-кондиционные делеционные мышиные модели выявляют критическую роль Dab2 в организации примитивной энтодермы [17,18]. Однако нормальное развитие после его делеции в эмбрионе собственно указывает, что ранее предположенная роль Dab2 в регуляции сигнальных путей в неоспоримых физиологических ситуациях или очень тонкая или перекрывается in vivo.

Рис. 4

Mechanism of epithelial organization and the embryonic lethal phenotype of dab2 knockout mice

Сегодняшнее исследование подтверждает предыдущие наблюдения, что дефицит Dab2 ведет к дезорганизации внеэмбриональной энтодермы [17,18]. Более того, наблюдалось, что дезорганизация примитивной энтодермы на ст. E4.5, следует непосредственно за имплантацией бластоциста. Клетки внеэмбриональной энтодермы присутствуют у Dab2-дефицитных эмбрионов, но перемешаны с клетками эпибласта вместо образования поверхностного слоя эпителия. Этот фенотип Dab2-дефицитных эмбрионов подтолкнул нас описывать dab2 в качестве "гена позиционирования поверхностного эпителия" [18], параллельно способу, с помощью которого dab1 был обозначен как "ген нейронального позиционирования" [4]. Предполагаемый механизм заключается в том, что Dab2 обеспечивает направленный эндоцитотический транспорт в эпителиальные клетки энтодермы, приводя к становлению апикальной полярности [18,46]. Ранее считалось, что высоко адгезивные эмбриональные клетки отсортировываются внутрь, а менее адгезивные клетки сортируются на периферию [47], в соответствии с Differential Adhesion Hypothesis [48,49]. Однако в случае примитивной энтодермы мыши способность устанавливать апикальную полярность скорее, чем дифференциальное адгезивное сродство предопределяет закрепление слоя примитивной энтодермы на поверхности [46]. Т.о., делеция dab2 ведет к потере или снижению доставки на клеточную поверхность адгезивных молекул, следовательно, к снижению способности устанавливать полярность и, наконец, к неспособности клеток примитивной энтодермы располагаться на поверхности [18,46].

Кроме того, делеция c-fos может частично устранять дезорганизацию энтодермы у Dab2-дефицитных эмбрионов [22]. Dab2 может негативно модулировать экспрессию c-Fos [19], а c-Fos может регулировать полярность эпителия [50]. Т.о., Dab2 может также влиять на организацию клеток энтодермы благодаря своему влиянию на путь передачи сигналов MAPK/c-Fos. Хотя это было предположено ранее, что добавочная активность Dab2 , а не супрессия c-For может воздействовать на органогенез [22], полученные результаты показывают, что потребность в Dab2 для развития ограничена внеэмбриональной энтодермой. Однако всё ещё возможно, что экспрессия Dab2 внутри внеэмбриональной энтодермы может влиять на эмбриональное развитие за счет клеточно неавтономного механизма.

Lack of developmental phenotypes in dab2 mosaic mutant mice

Принимая во внимание, что потеря Dab2 в примитивной энтодерме ведет к нарушению организации эпителия и тяжелому фенотипу у ранних эмбрионов, мы были озадачены тем, что dab2 кондиционные нокауты, получаемые или с помощью Meox2-Cre или Sox2-Cre не обнаруживали онтогенетических дефектов и имели слабые фенотипические отклонения у взрослых. Одна из возможностей заключается в том, что остающиеся Dab2-позитивные клетки у мозаичных dab2 мутантных мышей достаточны для важных онтогенетических функций. Альтернативно, экспрессия эндоцитотических адапторных белков, таких как Numb и Arh, которые имеют скодные с Dab2 структуру и функцию [31], могут компенсировать делецию dab2. Базируясь на PCR генотипировании хвостовых тканей и иммуноокрашивании почек, мы подсчитали, что около 5-10% клеток всё ещё содержат не делетированным ген dab2 при кондиционном Meox2-Cre нокауте. Напротив, аллель "fl" необнаружим в Sox2-Cre нокаутных линиях, всё же процент Dab2-позитивных клеток может быть более высоким на более ранних стадиях эмбрионального развития. Sox2 экспрессируется в является важным для трофобластного внеэмбрионального клона [51,52]. Однако, Sox2-Cre-вызываемая делеция гена dab2 не влияет на развитие трофэктодермы, т.о., Dab2 не является также существенным, по крайней мере, в субнаборе трофобластных клонов. Хотя ген dab2 может быть делетирован в большинстве соматических клеток без эффекта на эмбриональное развитие, мы рассматриваем возможность, что очень небольшая фракция Dab2-позитивных клеток может быть достаточной для выполнения его потенциально критических ролей. Несмотря на это, мы не смогли выявить какие-либо оставшиеся dab2 аллели на ст. E9.5 Sox2-Cre кондиционных нокаутных эмбрионов. Скорее всего, компенсаторная экспрессия Dab2-подобных белков, таких как Arh и Numb объясняет слабые фенотипические отклонения и действительное образование структур примитивной энтодермы, наблюдаемое в некоторых Dab2-дефицитных эмбриоидных телах.

Dab2 обеспечивает эндоцитоз и вносит вклад в метаболизм липопротеинов and contributes to lipoprotein metabolism in vivo

Хотя Dab2-дефицитные мыши выглядели нормально, мутантые мыши обнаруживали некоторые физиологические отличия, такие как избыточная экскреция плазменных белков в мочу и повышенные уровни холестерола и LDL в сыворотке. Эти физиологические фенотипические отклонения могут быть приписаны активности адаптора Dab2 для megalin и LDL рецепторов, соотв. Др. хорошо охарактеризованный связывающий Dab2 лиганд это integrin [34,35]. Хотя влияние Dab2 на клеточную миграцию наблюдается в культивируемых клетках, мы не нашли сходного физиологического фенотипического отклонения у мутантных мышей. Dab2 также, как полагают, обладает многими др. активностями, но эти фенотипические отклонения не обнаруживаются у мутантных мышей.

В случае эндоцитоза LDL рецепторов, повышенные уровни холестерола и уровни низкой плотности липопротеинов у Dab2 дефицитных мышей были небольшими, но постоянно обнаружимы. Повышенные сывороточный холестерин и уровни LDL, скорее всего, обусловлены отсутствием Dab2 белка в обеспечении отбора LDL частиц из кровообращения за счет Dab2-обеспечиваемого эндоцитоза. Этот результат подтверждает находки при изучении клеточных культур [36,45], что Dab2 участвует в эндоцитозе LDL рецепторов и поглощении LDL, и подтверждает, что Dab2 выполняет физиологическую роль в метаболизме холестерина. Обычно мыши, имеют относительно низкий уровень сывороточного LDL. Возможно, различия в уровнях сывороточного холестерола и LDL становятся более значительными у Dab2-дефицитных мышей, когда животных помещают на диету с высоким содержанием жира.

Вполне возможно, что в качестве эндоцитотического адаптора некоторых рецепторов клеточной поверхности, Dab2 может влиять на эндоцитоз и секрецию множественных лигандов и может регулировать множественные сигнальные пути. Функция Dab2 плейотропна, хотя он может служить в качестве тонко настраиваемого регулятора передачи сигналов и в качестве эндоцитотического адаптора с перекрывающейся специфичностью с др. адапторами, но влияние его делеции слабое в нормальных физиологических условиях. Однако, дополнительные фенотипы и Dab2 функции могут наблюдаться при более углубленном анализе Dab2 дефицитных мышей и также при помещении мутантных мышей в неподходящие ситуации.

Cellular actions of Dab2 in signaling and cell adhesion

Dab2 оказывает влияние на регуляцию сигнальных путей, включая Ras/MAPK/c-Fos [19-22], TGF-beta [15,23,24] и Wnt пути [25-28]. Dab2 также участвует в эндоцитотическом рециклинге E-cadherin [18] и интегринов [35] и тем самым воздействует на клеточную адгезивность и мобильность. Вполне правдоподобно, что Dab2 влияет на эти отличающиеся клеточные сигнальные пути благодаря своей роли в эндоцитозе и доставке; однако, являются ли эти активности физиологически важными, ранее не было решено. Путь Ras/MAPK [53-59], путь TGF-beta [60], путь Wnt [61,62], E-cadherin [63,64] и integrins [65] все они критические для эмбрионального развития и их пертурбации нарушают этот процесс. Поскольку делеция Dab2 у эмбрионов собственно оказывает минимальное влияние на эмбриональное развитие, то мы полагаем, что большинство предполагаемых функций Dab2, выявляемых при исследованиях in vitro, имеют небольшое значение in vivo. Dab2 может тонко настраивать активности этих сигнальных путей, но эффекты едва заметны и не всегда обнаруживаются в нормальных физиологических условиях у животных.

Loss of Dab2 in epithelial disorganization and cancer

Одним из наиболее распространенных наблюдений как при раннем эмбриональном развитии, так и при канцерогенезе является то, что потеря Dab2 ведет к эпителиальным морфологическим трансформациям. Потеря Dab2 прекрасно коррелирует с морфологическими изменениями, в частности с переходом от простого эпителиального монослоя к многослойному новообразованию при раке яичников [66]. Это напоминает дезорганизацию и потерю расположения на поверхности примитивной энтодермы у dab2-дефицитных эмбрионов и эмбриоидных тел. Dab2-обеспечиваемый направленный эндоцитотический трафик ведет к генерации апико-базальной эпителиальной полярности, а полярность играет критическую роль в позиционировании на поверхности [18]. Т.о., потеря Dab2 приводит к деполяризации эпителия и последующей дезорганизации, как это обнаруживается в карциноме яичников и у ранних эмбрионов [17,18,39,66]. Однако, поверхностный эпителий яичников являются монослойным и интактным у dab2-дефицитных мышей (not shown), демонстрируя, что потеря Dab2 в отдельности недостаточна, чтобы индуцировать дезорганизацию эпителия. В отличие от примитивной энтодермы эпителий в быстро растущих эмбрионах, зрелые эпителии у взрослых, скорее всего, обладают дополнительными механизмами, гарантирующими стабильность архитектуры.

Conclusion

The current results in the study of a new dab2 conditional mutant allele are consistent with the prior report that dab2 deletion leads to an early embryonic lethality at E5.5 [17,18]. This lethality occurs much earlier than the other report of mutants derived from a previously reported conditional allele [38]. Consistent with our prior conclusion [18,19], the current analysis of both embryos and embryoid bodies indicates that loss of Dab2 leads to disorganization of primitive endoderm and subsequent extraembryonic endoderm, although the differentiation to endoderm lineage is not impaired. Thus, the current study clarifies the discrepancy in embryonic phenotypes described for the two previous knockouts [17,38].

Conditional deletion indicated that Dab2 is dispensable for organ development, when the vast majority of the embryonic cells are dab2 null. A possibility is that additional endocytic adaptors such as Arh and Numb partially compensate for Dab2 loss. However, Dab2 has a physiological role in the endocytosis of lipoproteins and cholesterol metabolism.

Differential requirement for Dab2 in the development of embryonic and extra-embryonic tissues Robert Moore, Kathy Qi Cai, Wensi Tao, Elizabeth R Smith and Xiang-Xi Xu BMC Developmental Biology 2013, 13:39 doi:10.1186/1471-213X-13-39 (http://www.biomedcentral.com/1471-213X/13/39)

Differential requirement for Dab2 in the development of embryonic and extra-embryonic tissues
Robert Moore, Kathy Qi Cai, Wensi Tao, Elizabeth R Smith and Xiang-Xi Xu
BMC Developmental Biology 2013, 13:39 doi:10.1186/1471-213X-13-39 (http://www.biomedcentral.com/1471-213X/13/39)