Ядрышко крупнейшая видимая структура внутри клеточного ядра. Оно существует как динамический и стабильный регион в зависимости от природы и количества молекул, которые его составляют. основной функцией этой структуры является биогенез рибосом. Этот процесс использует транскрипцию рДНК, процессинг рРНК и сборку рибосомальных белков (Kressler et al., 1999). Ядрышко состоит из трех компонентов: фибриллярных центров (FCs), плотнрого фибриллярного компонента (DFC) и гранулярного компонента. Свыше 4500 белков было идентифицировано с помощью масс-спектрометрии, участвующих в нескольких клеточных процессах (Ahmad et al., 2009). Поскольку биогенез рибосом и несколько др. функций были приписаны ядрышку, такие как молчание генов, ход клеточного цикла, старение и биогенез малых ядерных РНК и пролиферации tRNAs и многие формы реакций на стрессы (Andersen et al., 2005; Hinsby et al., 2006; Boisvert et al., 2007; Shaw and Brown, 2012). Среди ядрышковых белков (NOP), fibrillarin является важным белком, который законсервировал свои последовательности и функции в ходе эволюции (Ochs et al., 1985; Jansen et al., 1991). Обычно во время интерфазы fibrillarin может быть обнаружен в переходной зоне между FC и DFC, где происходит транскрипция рДНК и в DFC, где осуществляется пре-рРНК процессинг в клетках эукариот (Ochs et al., 1985; Sobol et al., 2013). Поэтому он используется в качестве маркера активных ядрышек.

В зависимости от организма масса fibrillarin варьирует в пределах 34 и 38 KDa и первоначально он был описан в ядрышке Physarum polycephalum (Christensen et al., 1977). Он входит в сверхсемейство Rossmann-fold S-adenosylmethionine (SAM) метилтрансфераз (MTases) (Wang et al., 2000). Характеристики этого сверхсемейства включают консервативный SAM-связывающий мотив, каталитические triad/tetrad [K-D-K-(H)] и состоящий из 7 нитей β-лист, фланкированный α -спиралями, чтобы сформировать α -β -α cnhernehe (Rakitina et al., 2011). Их первичная и вторичная структуры консервативны и одной из принципиальных характеристик является сайт, богатый остатками аргинина и глицина и специфическим мотивом для связывания РНК.

Fibrillarin переносит метильную группу из SAM на 2-hydroxyl группу мишени рибозы (Omer et al., 2002; Ye et al., 2009). MTase активность была подтверждена с помощью реконструкции небольшого рибонуклеопротеина из Archaea Sulfobus solfataricus. Тестирование реконструированого комплекса мутациями внутри MTase домена гена Fbl помогло подтвердить активность метилирования с помощью Archaea fibrillarin (aFIB) (Omer et al., 2002). Недавно новая метилирующая активность была приписана fibrillarin. Она обеспечивает метилирование Gln-105 в гистоне H2A, эта модификация ухудшает связывание facilitates chromatin transcription complex (FACT) и специфически присутствует в локусе 35S рибосомальной ДНК, оказывая эпигенетический эффект, специфичный для активного промотора RNA polymerase I (RNA pol I). Аномальные уровни fibrillarin обнаружены при некоторых типах раков, таких как рак груди и рак простаты (Koh et al., 2011; Miller et al., 2012) , а также при взаимодействии с вирусными белками от вируса гриппа A и до белка транс-активатора транскрипции (Tat) из HIV (Yoo et al.,2003; Melen et al., 2012).

Fibrillarin phylogenetics

Термин 'fibrillarin' использовался неопределенно для нескольких белков у многих организмов; в частности, aFIBs , который обнаруживает существенные различия и может смущать новичков. Более того, существет несколько синонимов в литературе, такие как 34 kDa nucleolar scleroderma antigen, Dmel_CG9888, CG9888, Dmel_CG9888ri, GCR-6, GCR6, Pen59C5, fib, pen59C5, Fib, FIB, FBL, Fbl, FIB1, FLRN, RNU3IP1, rRNA 2'-O-methyltransferase fibrillarin, NOP1, nop1, fibM и aFIB в зависимости от организма и времени публикации. Здесь, чтобы избегать путаницы и делать различия между организмами, мы будем использовать термин 'fibrillarin' для fibrillarins у всех эукариот за исключениме дрожжевого fibrillarin (NOP1) и определяя сведения об индивидуальных организмах путем добавления рода и вида прежнего термина из уникального наблюдения. Мы будем использовать термин aFIB для всех archaeal организмов, как это сделали Omer et al. (2002). Мы думаем, что особенно важно делать эти различия, принимая во внимание огромное количество биохимических и структурных данных, которые были получены от archaeal организмов aFIB которых не полностью выполняют соотв. специфические fibrillarins эукариот. Более того, т.к. fibrillarin эукариотических клеток располагается преимущественнов ядрышках, а Archaea не имеют ядра, то вряд ли все функции будут законсервированы. Archaeal fibrillarins были использованы при очистке рекомбинантного белка благодаря их высокопродуктивной экспрессии и готовности к удалению др. бактериальных белков при высокой температуре. Высших растений или позвоночных fibrillarins обнаруживают очень плохую экспрессию у бактерий в нативной форме. Они были очищены от телец включаний и в большинстве случаев упаковывались по новому перед провдедением биохимических экспериментов (Pearson et al., 1999). С др. стороны, большинство генетических экспериментов были проделаны с NOP1, а детельные исследования по локализации проделаны с fibrillarins позвоночных. Остается определить, являются ли нестандартные взаимодействующие партнеры теми же самыми по всем разным царствам, а также на разных стадиях развития. Одно четкое отличие заключается в том, что aFIB обнаруживают плохое связывание РНК (Omer et al., 2002), тогда как fibrillarin от разных эукариотических организмов обнаруживают хорошо известную активность по связыванию РНК, а в некоторых случаях имеют до двух сайтов связывания РНК (Rakitina et al., 2011).

Функция NOP1 является важной для модификации и процессинга pre-rRNA. NOP1 может быть замещен fibrillarin от Arabidopsis thaliana (Barneche et al., 2000) , а также человеческим и Xenopus fibrillarins (Schimmang et al., 1989; Jansen et al., 1991). Однако, fibrillarin простейших от Tetrahymena termophila не зможно из-за различий в N-терминальном деомене. Домен, который богат остатками глицина и аргинина (наз. GAR домен) и имеющмий низкое сходство последовательностей при сравнении разных организмов (David et al., 1997). Это может указывать на более низкую консервацию, чем обычно принято считать. Более того, замещение NOP1 человеческим, Xenopus или A. thaliana fibrillarin изменяет рост и ядерную морфологию у дрожжей, демонстрируя тем самым, что не все функции fibrillarin законсервированы (Jansen et al., 1993).

Выравнивание последовательностей и сравнение10 моделей эукариотических fibrillarins ивсех, несущих aFIBs (Figure 1A). Archaea бактерии пред ставляют широкий спектр cladograms, которые отделяются от др. групп. Сравнение последовательностей для всех завершается эукариотическими фибриллинами (Figure 1B). Кладограмма выявляет 9 первичных ветвей, которые отделяют группы грибов, беспозвоночных растения и позвоночных. cВ целом последовательности варьируют значительно внутри каждой группы. Имеются наивысшие сходства последовательностей у растений (63%) и у позвоночных (61%), тогда как беспозвоночные, грибы и Archaea обнарудивают большее расхождение последовательностей (33, 27 и 20%, соотв.). Полученны проценты сходства последовательностей между удаленно расположенными членами каждого класса. Беспозвоночные fibrillarins очень отличаются в некоторых группах, расположенных внутри ветви позвоночных и растительных clads. Остается определить, объясняют ли эти различия некоторые специфические функции. Напр., Xenopus и человеческие fibrillarins разденлены на два разных clads и они обнаруживают разщный уровееь комплеметации у NOP1 мутантов (Jansen et al., 1993). Анализируя последовательности мы получилиопределенную сигнатиуру, которая уникальна для fibrillarins, расположенная в центральном регионе белка (Table 1).

Figure 1. Evolutionary relationships of taxa (A) The analysis involved 371 amino acid sequences of complete Archaea fibrillarins and eukaryotic fibrillarins lacking the GAR sequence to be comparable in size and domain composition. There were a total of 21 positions in the final dataset. The tree with the highest log likelihood is shown. (B) The analysis involved 212 amino acid sequences of complete eukaryotic fibrillarins. For both analyses, all positions containing gaps and missing data were eliminated. Evolutionary analyses were conducted in MEGA6. CK1 protein was used to root the tree as a non-related protein. The evolutionary history was inferred by using the maximum likelihood method based on the JTT matrix-based model.

Table 1. Fibrillarin signatures

Archaea L-Y-L-G-(A/I)-(A/S)-(S/A)-G-T-T-S-H-(V/L/I)-(S/A)-D
Fungi V-L-Y-(L/I)-G-(A/S/G)- (A/S)-S-G-T-(S/T)-V-S-H-V-(A/S)-D-(L/I/V)-V-G
Plants P-G-(A/T/S)-(K/R)-V-L-Y-L-G-A-(A/S)-S-G-(T/Y)-T-(V/I)-S-H-V-S-D-(L/I)-V-G
Invertebrate K-(V/L)-L-Y-L-G-(A/G)-(A/S)-(S/N/T)-G-T-(T/S)-V-S-H-(V/C)-(S/A)-D
Vertebrate V-(L/M)-Y-L-G-A-A-S-G-T-T-V-S-H-V-S-D-(I/V)-(V/I)-G

Некоторые отличающиеся семейства fibrillarins могут быть выведены из филогенетических исследований, но до сих пор более определенные доступные биохимические и генетические данные слишком сырые, чтобы делать это. Принимая во внимание рентгеновские кристаллографические данные, имеющиеся для определенных fibrillarins clads (Figure 2), мы можем видеть, что наблюдаемые различия последовательностей между ними лишь слегка изменяют общую струк туру белка. Остается протестировать являются ли разнные конформации и партенры приспособеными к fibrillarins из разных clads.

Figure 2. Structural alignment of different fibrillarin

(A) Representation of the primary structure of the Archaea and Eukarya fibrillarin. The fibrillarin sequence is divided in four regions: The GAR domain is a sequence rich in glycine and arginine. BCO: a sequence with undefined activity. The methyltransferase domain contains the enzymatic activity as well as a conserved RNA binding sequence. This domain can be subdivided into RNA binding domain and the ?-helix region that interacts with Nop56/58. The average amino acid position of each domain is given below the bar. (B) Six crystal structures of the fibrillarin from different organism were compared: In orange is from Pyrococcus horikoshii (protein data base ID: 1G8A); in dark yellow from Methanococcus jannaschii (protein data base ID: 1FBN); in blue from Homo sapiens (protein data base ID: 2IPX); in light yellow fromAeropyrum pernix (protein data base ID: 4DF3); in purple from Pyrococcus furiosus (Protein Data Base ID: 1PRY); in green from Sulfolobus solfataricus(Protein Data Base ID: 3ID6). (C) The six crystal structures of fibrillarin were aligned to visualise the overlap of structures. Protean 3D was used to perform the structural alignment of fibrillarin with rigid-body alignment (TM-aling). The localisation of the calcium ion and the S-Adenosyl methionine are shown as well as the domain regions.

Fibrillarin structure and domain functions

Последовательность fibrillarin белка может быть подразделена на два больших домена: N-терминальный домен и домен с MTase. У A. thaliana, N-терминальный домен подразделен на два региона: (1) GAR домен с приблизительно 77 аминокислотами и (2) спейсерный ренгион с 61 аминокислотой (Figure 2A). Домен GAR ответственен зап взаимодействие с разщными клеточными и вирусными белками и содержит ядрышковый удерживающий сигнал. Snaar пришел к заключению, что домен GAR направляет белок в ядро и используется для удержания в ядрышке. Однако для локализации в ядрышке необходим РНК-связывающий мотив (Snaar et al., 2000). Более того, этот регион не нужен для локлизации fibrillarin в тельцах Кахаля (CBs). Домен GAR человеческого fibrillarin и Arabidopsis fibrillarin полностью необходим для локализации в ядрышке (Pih et al., 2000; Levitskii et al., 2004) и он метилирован по нескольким остаткам аргинина. Fibrillarin,как было установлено, является субстратом для метилирования аргинина c помощью protein arginine N-methyltransferase 1 (PRMT1) , а метилированные остатки соответствуют 45% от всех аргининов в fibrillarin (Lischwe et al., 1985). метилирование может способствовать специфическому связыванию с некоторыми белками, такими как survival of motor neuron 1 (SMN1).

Домен MTase подразделяется на два региона: (1) R или централный регион с 87 аминокислотами и (2) регион из 95 аминокислот, богатый α-спиральными структурами. Внутри R региона имеется характерный РНК-связывающий мотив GCVYAVCF, специфичный для белков, которые связывают РНК (Aris and Blobel, 1991). Rakitina et al. (2011) показали, что последоватенльность GCVYAVCF не целиком необходима для взаимодействия с РНК . Используя разные конструкции мутантного A. thaliana fibrillarin 2, были найдены два дополнительные региона для связывания РНК. Один внутри R региона межэду аминокислотами 138 и 179, и др. в регионе, богатом α-спиральными структурами между ам инокислотами 225 и 281. Оба РНК-связывающих сайта работат независимо и могут взаимодействовать с разными РНК; более того, делеция или этих двух регионов не оказывает негативного эффекта на связывани е РНК, но имееттся синергичный эффект, когда присутствуют оба, на это указывают высокий коээфициент Hill. C-терминальный конец характеризуется консервативной структурой, состоящей из 7 α-спиралей и трех консервативных аминокислот, которые окружают AdoMet-связывающий регион (Deng et al., 2004). Этот регион fibrillarin взаимодействetn также с белком Nop56 (Lechertier et al.,2009). Более того, аминокислотные остатки MTase каталитической триады Arabidopsis fibrillarin 2, K138/D231/K260, располагаются внутри R-(K138) и α-богатого-(D231 and K260) РНК-связывающих сайтов. Yanagida et al. (2004) продемонстрировали, что GAR и spacer регион человеческого fibrillarin взаимодействуют со сплайс-фактором 2, ассоцированным с p32, а MTase домен взаимодействetn с PRMT5. Fibrillarin взаимодействetn как с PRMT1, так и с PRMT5 на разных сайтах, это отражает сложность метилирования его GAR домена или возможность того, что он также участвует в процессе метилирования белков c помощью одного из этих энзимов, в то же время соединяясьь с fibrillarin (Yanagida et al., 2004).

У дрожжей NOP1 охарактеризован группой Tollervey, в которой были получены чувствительные к температуре мутантиы и показано, что разные функции NOP1 контролируются c помощью разных сайтов белка. Мутации NOP1 в некоторых позициях (D186G, D223N, D263G, K138E, S257P и T284A) обнапруживали дефект процессинга 35S pre-rRNA. Мутации в позициях V87G, E103G, A175V и P219S ингибировали метилирования ядрышка 35S рРНК. Мутации в позициях E198G и A245V ограничивают конформационные изменения пре-рибосомальных субъединиц. Мы можем ожидать, что точковые мутации в белке NOP1, которые зхатрагивают метилирование и сборку рибосом, д. иметь консервативные аминокислоты. Однако мутации в белке NOP1 затрагивают расщепление pre-рРНК, сюда входят мутации S257, D263, T284, отличающиеся в др. fibrillarins, таких как Arabidopsis fibrillarin 1 слоответствующих A234, T240, A261, и в At-fibrillarin 2 соответствующих A245, S251, A272. Следовательно, различия в ключевых аинокислотах в растительных fibrillarin могут влиять на полноту функциональной комплемнтации в дрожжах (Barneche et al., 2000). Детальная структура была определена для небольшого количетва fibrillarins, которые предоставили информацию о механизме метилирования РНК и формировании комплекса. Мы сравнивали известные структуры fibrillarins от разных организмов. Состав показал (Figure 2) , что структура fibrillarin хоошо законсервирована от Archaea до человека. Информация от Molecular Modelling Database из National Center of Biotechnology Information содержит кристаллические структуры человеческого fibrillarin в комплексе с S-adenosyl-L-homocysteine (unpublished data by Plotnikov's group, http://www.thesgc.org/structures/2ipx), Aeropyrum pernix fibrillarin в комплексе с SAM (de Silva et al.,2012), fibrillarin в комплексе с Archaea белком Nop56/58 (Oruganti et al., 2007), гипертермофильный Archaea Pyrococcus furiosus fibrillarin (Deng et al., 2004), гипертермофильный Archaea Pyrococcus horikoshii fibrillarin (unpublished data by Boisvert, D.C. and Kim, S.H.; http://pdbj.org/emnavi//quick.php?id=1g8a), Methanococcus jannaschii fibrillarin (Wang et al., 2000), fibrillarin в комплексе с белком Nop5 из S. solfataricus (Ye et al., 2009) и с небльшим ядрышковым рибонуклеопротеином (snoRNP) от S. solfataricus (Ye et al., 2009). Уивительнло структуры обнаруживают общий впечатляющий уровень структурной консервации. Уроки преподнесенные рентгеновскими данными постулируют интересный механизм действия метилирования РНК путем образования двойных комплексов с 4 fibrillarins, взаимодействующими в определнное время с направляющей РНК, чтобы метилировать разные регионы в рРНК (Lapinaite et al., 2013). Детаьная информация о каталитическоми сайте энзима также была получена. iОднако возникают некотолрые вопросы относительно действительной консервации структуры fibrillarin. Поскольку большинство из тестируемых fibrillarins сохраняют сходную форму, человеческий аналог и протестированные эукариотические стартуют с позиции 93 и поэтому GAR домен отсутствует, это напоминает archaeal fibrillarins (Figure 2A). Отсутствие этой части белка важно для интерпертации др. межбелковых взаимодействий с эукариотическими fibrillarins. Поскольку информация о том, как человеческий fibrillarin кристаллизуется, опубликована, остается посмотреть, является ли эта структура хорошо законсервирована. Кроме того, 7 ключевых аимнокислот из NOP1 в позициях 87, 103, 138, 176, 257, 263 и 284 не законсервированы у aFIB, поэтому возникает вопрос, невыплняют ли эти ключевые аминокислоты др. роли в клетках эукариот .

Post-transcriptional modifications by fibrillarin

Fibrillarin-специфический комплекс некосредственно участвует в разных пост-транскрипционных процессах, таких как расщепление пре-рРНК, метилирование рРНК и сборка рибосом (Tollervey et al., 1993). Метилирование рРНК осуществляется в более чем в 100 сайтах, при этом некоторые вариации зависят от организма. Однако для всех этих сайтов fibrillarin главным кандидатом на метилирование. Из-за низкого сродства РНК aFIB нуждается в L7Ae белке, чтобы формировать комплекс для облегчения связывания ведущей РНК, сопровождаемого взаимодействием с Nop5. Этот комплекс принадлежит семейству сходных комплексов, наз. snoRNP (и малыми нуклеопротеинами у Archaea) (Dunbar et al., 2000; Reichow et al., 2007; Lechertier et al., 2009). snoRNP использует малую ядрышковую РНК (snoRNA), чтобы наводить на пару оснований в молекуле мишени РНК, кооторые д. быть модифицированы. Каждый snoRNP имеет от 70 до 600 нуклеотидов и свои собственные ассоциируемые белки. Имеются два основных типа snoRNP, один с боксом C/D, обладающим функцией метилирования на рРНК и второй с боксом H/ACA, обладающим функцией pseudouridylation. Метилированная ведущая (guide) snoRNA обладает C боксом (RUGAUGA, R это пурин) вблизи 5' концаи боксом D (CUGA) вблизи 3' конца. Боксы C и D образуют пеолю (kink-turn). Ведущая snoRNA содержит также последовательность из 10 - 21 пн в дополнение к сайту метилирования РНК мишени; метилирование происходит по пятому нуклеотиду выше бокса D (Cavaille et al., 1996; Kiss-Laszlo et al., 1996). В общем snoRNAs кодируются или своими собственными генами или c помощью интронных последовательностей генов, кодирующих NOPs, связанных с биогенезом рибосом, таких как nucleolin и fibrillarin (Bratkovic and Rogelj 2014).

Комплекс метилирования состоит из aFIB, Nop5 и L7Ae белка у Archaea. У эукариотических организмов белки паралоги Nop56 и Nop58 замещают Nop5, а белок 15.5K замещает L7Ae. Рекомбинантные белки были использованы, чтобы показать взаимодействие fibrillarin с Nop5 как первую ступень, сопровождаемую взаимодействием с белком L7Ae, который связывает ведущую РНК на ранней ступени (Motorin and Helm,2011). N-терминальный домен Nop5 взаимодействует с aFIB, а C-терминальный домен Nop5 соединяется с белком L7Ae, чтобы создать активный комплекс с целью содействия ведущей (guide) РНК. Малые РНК, как известно, взаимодействуют с fibrillarin, это U3, U8, U13, U14, U60, x, y, snR3, snR4, snR8, snR9, snR10, snR11, snR30, snR189 и snR190 (Schimmang et al., 1989; Fournier and Maxwell, 1993). Активность комплекса была протестирована на рекомбинантных белках с использованием aFIB (Omer et al., 2002) и NOP1 c помощью генетического дрожжевого подхода (Tollervey et al., 1993). Из множественных метилирований, которые имеют место на рРНК, нет определенного метилирования, коррелирующего со специфической функцией. По-видимому, некоторые метилирования необходимы, чтобы повлиять на архитектуру и функцию рибосом (Basu et al., 2011). В настоящее время роль индивидуального метилирования всё ещё неизвестна; однако исследованияя с нокаутом показали, что неправилдьное метилирование рРНК ассоциирует с модификацией фенотипа клеток (Newton et al., 2003; Amsterdam et al., 2004; Marcel et al., 2013).

Недавно метилирование в гистоне H2A глютамина, как было установлено, осуществляется c помощью fibrillarin. Эта модификация являетсяспецифической для ядрышка, где наблюдается наивысшая концентрация fibrillarin. H2A, метилированный по Q105 у дрожжей и по Q104 у человека, является первой эпигенетической модификацией гистона, обнаруженной только в ядрышке и играющей возможную роль в архитектуре ядрышка при участии FACT в кмачестве ремодельера хроматина (Tessarz et al., 2014).

У многоклеточных организмов роль метилирования, обеспечиваемого fibrillarin, изучалась с исползованием нокдауна fibrillarin у модельных мышей. Нативный fibrillarin был замещен таковым, который лишен MTase домена и N-терминального домена. Возникающий в результате белок имел только GAR регион. Гомозиготные после нокдауна эмбрионы обнаруживали массиыный апоптоз и не развивались. в отличие от гетерозиготнрых животных после нокдауна, которые не обнаруживали видимых дефектов. Во втором поколении среди животных, происходящих от гетерозигот первого поколения пропорция гомозиготных животных без мутациий была выше, чем от гетерозиготных животных из популяции. Следовательно, некоторые гетерозиготные эмбрионы, возможно с пониженными уровнями fibrillarin не развиваются (Newton et al., 2003). Fibrillarin, как было установлено, также является важным геном у рыбок данио во время эмбрионального развития как было установлено c помощью инсерционного мутагенеза (Amsterdam et al., 2004). Более того, у растений снижение уровней fibrillarin с использванием RNAi показало появление карликовых апоптических фенотипов, когда уровни fibrillarin снижались более чем на 90% и не обнаруживалсь влияния на фенотип растений при меньшем снижеии fibrillarin (Kim et al., 2007).

Fibrillarin localisation and cell cycle

Fibrillarin также как и др. ядерные белки (alternative splicing factor/splicing factor 2 (ASF/SF2), high mobility group protein 17) высоко динамичен, скорее всего, из-за оттока молекул, необходимых для запуска процесса биогенеза рибосом. Исследования динамики fibrillarin были проведены c помощью мечения белка зеленым флюоресцентным белком, при этом флюоресценция наблюдалась после экспериментов c помощью фотообесцвечи вания. Наблюдения за флюоресцуентным белком fibrillarin выявили быстрый обемен fibrillarin в ядрышках и нуклеоплазме, также выявлена слегка отличающаяся кинетика в зависимости от локализации fibrillarin (Phair and Misteli, 2000; Snaar et al., 2000). В этих условиях молекулы fibrillarin присутствовали в CB и ядрышках только в течени е короткого времени. Это говорит против постой локальной активности метилирования процессинга рРНК и как показала группа Misteli, это может указывать на то, что fibrillarin может странствовать по ядру в поиске специфических партнёров для связывания (Phair and Misteli, 2000).

Обилие и локализация fibrillarin во время миозов была изучена детельн на нескольких моделях (Amin et al., 2007; Hernandez-Verdun et al., 2013). Во время интерфазы fibrillarin располагается в DFC ядрышка и его концентрация может удваиваться от G1 к G2 (Cerdido and Medina, 1995). После вступления в профазу одновременно прекращаются конденсация хроматина, транслокация рДНК и процессинг рРНК и ядрышко начинает дезинт егрироваться. Fibrillarin вместе с компонентами комплекса процессинга, тамики как пре-рРНК, nucleolin, U3 и U14 snoRNAs перемещаются на периферию хромосом, где они образуют часть околохромосомной оболочки (Medina et al., 1995) или в околохромосомный компартмент (Angelier et al., 2005). Fibrillarin был также обнаружен диспергированным в цитоплазме миотических клеток, это означает, что часть комплексов процессинга разбирается и может быть направлена на деградацию в это выремя. В телофазе перед вступлением в повторную сбрку ядрышек fibrillarin располагается в комплексе процессинга, компонентах pre-nucleolar bodies (PNBs) (Medina et al., 1995). Взаимодействия, выявляемые между белками одного и того же аппарата процессинга рРНК как в PNBs, так и ядрышках, подтверждает, что PNBs являются платформами для предварительной сборки комплексов процессинга рРНК (Angelier et al., 2005). Затем PNBs становятся ассоциироваными с регионами ядрышковых организаторов (NORs), которые представляют собой рДНК, связанную с компонентами транскрипционного комплекса, такими как вышестоящий фактор связывания (у позвоночных) и RNA polymerase I. Эта ассоциация регулируется во времени и fibrillarin является одним из первых ранних факторов процессинга, который перемещается из PNBs в NORs (Leung et al., 2004). Было продемонстрировано, что уже восстановлденная активная транскрипция рДНК необходима для привлечения факторов процессинга рРНК (Benavente et al., 1987; Azum-Gelade et al., 1994; Sobol et al., 2013); однако, во время эмбриогенеза Xenopus laevis присутствие 'материнской' презрРНК важно и достаточно для такого рекрутирования (Verheggen et al., 2000). С др. стороны, было предположено, что киназы и/или фосфатазы, используемые при переходе от митоза к интерфазе, могут регулировать инициальное привлечение fibrillarin на NORs перед инициацией транскрипции рДНК (Dousset et al., 2000). В этом случае сборка ядрышка после митоза временно и пространственно регулируется c помощью активного механизм фосфорилирования белков скорее, чем за счет косвенного эффекта активации транскрипции pol (Dousset et al., 2000; Leung et al.,2004). Тем не менее очевидно, что PNBs обязательны для инициальрного накопления и/или предварительной сборки компонентов аппарата процессинга рРНК перед последующей ассоциацией с NORs.

Involvement of fibrillarin in viral infection

Некоторые вирусы (umbraviruses, Influenza A, HIV, etc.) с ядерной фазой взаимордейсчтвцуют с белками, расположенными в CB и ядрышках для своей репликации и транспорта внутрь клетки. Динамика fibrillarin между CB и ядрышками может быть одной из причин, почему этот белок подвергается действию некоторых вирусов. Среди них, nut rosette virus принадлежит семейству umbraviruses, которые кодируют белок ORF3. Fibrillarin взаимодействует непосредственно с ORF3 посредством богатого лизином домена в ORF3 и богатого аргинином домена в fibrillarin, это сопровождается снование этого вирусного белка между CB и ядрышком (Kim et al., 2007). Две стадии жизненного цикла umbravirus подтверждают участие fibrillarin, которые поврторно перераспределяет ся в цитоплазме и участвует в образовании вирусных рибонклеопротеинов, способных перемещаться через флоэму растений, вызывая завершение инфекции растений (Kim et al., 2007). Следовательно, взаимодействие между вирусными ядрышковыми антигенами растений и fibrillarin в ядрышке является ключом к системному распространению этого типа растительрного вируса (Hiscox, 2002; Zheng et al., 2014).

Др. известные вирусы, присутвтующие в клетках животных, взаимодействуют fibrillarin. Одним из примеров является вирус гриппа A подтипа H3N2, который вызывает грипп. В этом вирусе многофункциональный белок (non-structural protein, NS1) ингибирует процессинг пре-мРНК в клетке хозяине и противодействует антивирусной реакции клетки. Белок NS1 вируса человека H3N2 взаимодействует с fibrillarin и nucleolin посредством своего C-терминальног сигнала локализации в ядре 2 и сигнала локализации в ядрышке. Конфокальная микроскопия показала, что белок NS1 локализуется совместно с nucleolin в нуклеоплазме и ядрышке и с B23 и fibrillarin в ядрышке инфицированных вирусом гриппа A/Udorn/72 virus клетках A549. Поскольку некоторые вирусные белки содержат сигналы локализации в ядрышке, то очевидно, что вирусы вмешиваются в специфические функции ядрышка (Melen et al., 2012).Др. вирус, который использует fibrillarin, - это HIV. Белок HIV Tat, как было установлено, взаимодействует с fibrillarin и U3 комплексом. Белок Tat влияет на созревание рибосомальной рРНК и общее количество 80S рибосом (Ponti et al., 2008). Нарушение созревания пре-рРНК в результате взаимодействия с Tat с fibrillarin-U3 snoRNA комплексом может участвовать в модуляции реакции хозяина, внося тем самым вклад в апоптоз и выключение белка в инфицированных HIV клетках. Др. вирусы, подобные arterivirus свиней во время своего инфекционного цикла обладают нуклеокапсидным белком, расположенным сосвместно и взаимодействующим с fibrillarin (Yoo et al., 2003). Необходимо проанализировать больше вирусов с ядерной фазой для выяснения возможного взаимодействия с fibrillarin (Hiscox, 2002). Более того, остается неизвестной функциональная роль взаимодействия между fibrillarin и вирусными белками.

Fibrillarin as an oncogene

Ядрышко участвует вбиогенезе аппарата, необходимого для общей трансляции белков и в конечном счете для клеточного роста и хода клеточного цикла (Tsai and Pederson, 2014). Специфические альтерации во многих NOPs могут приводить к нарушениям ростового поведения или изменению жизнеспособности клеток. Fibrillarin не является исключением и было показано, что fibrillarin избыточно экспрессируется во внутриэпителиальных неоплазиях простаты мышей и человека, которые могут перерожадаться в рак простаты (Koh et al., 2011).В аденоканциноме человека количество fibrillarin коррелирует in vivo с количеством белка MYC, хорошо известным онкогеном, который, как было установлено, взаимодействует также с fibrillarin (Koh et al., 2011; Miller et al., 2012). Данные GeneAtlas U133A показывают тканеспецифический паттернэкспрессии мРНК fibrillarin в некоторых тканях и более чем двухкратную экспрессию в др. типах клеток лейкемии и лимфомы по сравнению с нормальными клетками. Обнаруживается также высокая экспрессия fibrillarin в клетках, подобных лимфобластам и в клетках, экспрессирующих белки, такие как cd34, bdca и cd19, которые необходимы в больших количествах для непрерывной репликации. Более того, p53 снижает экспрессию и уровень белка fibrillarin путем взаимодействия с последовательностью интрона 1 fibrillarin, которая содержит регуляторный сайт для p53 (Marcel et al., 2013). В клетках рака груди отсутствие регуляции fibrillarin, вызываемое с помощью снижения уровня p53 приводит к повышению уровня fibrillarin и к более высокому уровню аберрантных метилирований рРНК , это приводит к изменению активности рибосом, включая нарушения точности трансляции и увеличение мест проникновения в рибосомы ключевых раковых генов (Marcel et al., 2013).

Ключевыми генами, контролирующими рост и деление раковых клеток, являются early growth response 1 (EGR1), p53 и phosphatase and tensin homolog (PTEN), которые образуют сеть регуляции (Zwang et al., 2011). PTEN контролирует уровни phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate в клетках с помощью дефосфорилирования phosphoinositide в phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Взаимодействие PIP2 с fibrillarin приводит к конформационным изменениям fibrillarin и влияет на его связь с РНК (Sobol et al., 2013; Yildirim et al., 2013).

EGR1 часто подавляется в линиях клеток человека и раковых тканях, которые теряют контроль над ходом клеточного цикла. Обычно уровни рибосомальных белков повышены с опухолевых клетках и этот процесс необходим для прогрессирования опухолей (Liu et al., 1996; Ponti et al., 2014). Следовательно, многие агрессивные раковые опухоли обнаруживают изменения в морфологии ядрышек, которые могут быть вызваны повышением количества fibrillarin в этих клетках.

Fibrillarin также избыточно экспрессируется в клетках рака груди мыши и человека, а также в клетках рака простаты Лечение с помощью противораковых лекарств, таких как ascorbate (vitamin C) и menadione (vitamin K3), известных как Apatone, как было установлено, убивают раковые клетки с помощью autoschizis в соотношении 100:1. Поскольку autoschizis влечет за собой последующую реактивацию DNase I и DNase II, и поскольку перераспределение fibrillarin, после воздействия DNase I и Apatone идентично, то очевидно, что изменения ядрышек и fibrillarin характеризуют autoschizis (Jamison et al., 2010). Fibrillarin, как было установлено, присутствует в небольших количествах в FCs и в нуклеоплазме после лечения вновь синтезированым противоопухлевым комплексом [RuLCl2]H?4H2O (RAP). RAP обладает теми же самыми противоопухлевыми эффектами, что и cisplatin, который поперечно связывет ДНК и запускает апоптоз (Alderden et al., 2006). Низкий уровень fibrillarin после таких воздействий вызывает снижение экспрессии белка и хода клеточного цикла в обработанных клетках. Комбинированное воздействие с помощью ascorbate и menadione вызывает синергичную противоопухолевую активность и преимущественно гибель опухолевых клеток за счет autoschizis. Fibrillarin двигается с FCs и соседних регионов в более гомогенное окрашивание всего ядрышка.Эта находка согласуется с % autoschizic клеток, выявляетмых с помощью проточной цитометрии (Jamison et al., 2010). Это указывает на специфичное снижение количества fibrillarin, необходимого для контроля некоторых типов рака, а его перераспределение может маркировать определенные типы гибели клеток.

Fibrillarin and interacting partners

Tollervey в 1993 получил чувствительные к температуре мутации для NOP1 и показал, что некоторые ключевые мутации затрагивают сборку рибосом и зависят от NOP1. Мутации в этом белке или вызывают подавление синтеза суьъединиц 18S и 25S или ингибируют метилирование в ядрышке субъединицы 35S; затрагиывая в конечном итоге субъединицу 60S за счет неизвестного механизма (Tollervey et al., 1993). Более важно. что эти эксперименты показали, что NOP1 или fibrillarin важны для выживания клеток. Интересно, что исследуемые м утации локализовались в разных местах белковых доменов и обнаруживали разные эффекты на биогенез рибосом. Это указывает на то, что участвуют разные субнаборы взаимодействующих партнеров. Следовательно, показано, что fibrillarin является многофункциональным белком, участвующим в нескольких процессах биогенеза рибосом у дрожжей. Спустя 20 лет многие кандидаты, взаимодействующие с fibrillarin, были идентифицированы. Поскольку большая часть fibrillarin располагается в ядрышках и CB во время интерфазы, после же конденсации хромосом и разрыва ядрышка fibrillarin перемещается в околохромосомный компартмент вместе с др. молекулами. которые могут взаимодействовать с fibrillarin зависимым от клеточного цикала способом. Более того, fibrillarin в низких количествах может быть также расположен в др. частях ядра и взаимодействия также могут зависеть от условий роста клеток или стадии развития клеток. Результаты в градиентах сахарозы и глицерола обнаруживают разные пики седиментации fibrillarin, указывающие на то, что fibrillarin обнаруживается в более чем одном копмплексе в клетках (Dragon et al., 2002; Sasano et al., 2008).

Действие fibrillarin на продукцию рибосом показано на Figure 3, где все известные рибосомальные белки взаимодействуют с fibrillarin на каждой из стадий его действия. Процесс начинается с метилирования гистона H2A, которое дает метку, распознаваемую с помощью FACT. Затем, FACT ремоделирует функциональный хооматин так, что RNA pol I может начать транскрипцию. Эта модификация обнаруживается только на активных последовательностях рДНК. У дрожжей RNA pol I субъединица RPA49, несущественная субъединица RNA pol I, взаимодействует в двугибридной системе с fibrillarin (Krogan et al., 2006). Остается протестировать, взаимодействует ли человеческий гомолог PAF53 также с fibrillarin и каково функциональное значение этого взаимодействия. Однако это может указывать на прямую связь взаимодействия между транскрипцией рРНК и аппаратом её преобразования. Обычно партнерами по взаимодействию с fibrillarin являются Nop56/Nop58, 15.5K и snoRNA. Они образуют snoRNP,который участвует в метилировании рРНК (Lechertier et al., 2009). Комплекс имет массу 400 kDa, он д. содержать тетрамер fibrillarin, который изменяет конформацию, чтобы позволить метилирование разных регионов рРНК. Nop56/58 играет важную роль в позиционировании каталитической субъединицы на мишени РНК за счет одновременного контакта, сводящего РНК и fibrillarin. snoRNA работает как проводник и направляет метилирование в точное место. Этот механизм был описан в деталях, исходя из рентгеновских кристаллических данных, полученных на aFIB (Lapinaite et al., 2013). Очевидно, необходимо проанализировать поведение fibrillarins эукариот тем же способом и определить, как они участвуют в более, чем 100 модификациях рРНК, которые имеют место в нормальных рибосомах (Maden et al., 1995).

Figure 3. Fibrillarin interacting proteins involved at different stages of ribosomal processing/ Epigenetic marks of RNA pol I promoter by directly methylating H2A histone at position 105 directs the start of action of fibrillarin. Transcription initiation with the interaction of the subunit of RNA pol I (RPA49) and its action in rRNA processing of methylation and further processing of the 45 S pre-rRNA into 20 S and 32 S pre-rRNA. Finally, it can interact with proteins involved in the translation process.

Эпигенетические метки промотора RNA pol I за счёт прямого метилирования гистона H2A в позиции 105 управляет началом действия fibrillarin. Инициация транскрипции за счет взаимодействия субъединицы RNA pol I (RPA49) и её воздействие на процессинг метилирования рРНКr и дальнейший процессинг 45 S pre-rRNA в 20 S и 32 S pre-rRNA. Наконец. он может взаимодействовать с белками, участвующими в процессе трансляции.

Среди др. взаимодействующих белков, p32 и Nop52 взаимодействуют с fibrillarin в разное время, но возможно в одном и том же связывающем регионе. Фактор сплайсинга ASF/SF2 связывает p32, чтобы регулировать сплайсинг мРНК посредством ингибирования как фосфорилирования, так и связывания ASF/SF2 с pre-mRNA (Petersen-Mahrt et al., 1999). Nop52 является человеческим гомологом дрожжевого Rrp1p. Он ассоциирует с несколькими отличающимися 66S предрибосомальными частицами и участвует вболее поздних событиях, связанных с продукцией 60S рибосомальной субъединицы. Однако Nop52 взаимодействие с p32 конкурирует со связыванием fibrillarin. Следовательно, возможно, что на разных стадиях биогенеза рибосом взаимодействие fibrillarin с каждым из этих белков необходимо. Мы можем предполжить, что p32 ассоциирует с пре-рибосомальными 90S частицами за счет модифицирования с помощью fibrillarin созревания рибосом. В свою очередь Nop52 замещает fibrillarin и взаимодействует с p32, инициируя образование рибосомальных частиц 60S и 28S в гранулированный компонент (Yoshikawa et al., 2011). В CBs, fibrillarin может взаимодействовать с SMN белком. SMN является белком, кодируемым геном болезни spinal muscular atrophy. Белок SMN обнаруживается в цитоплазме и ядре, где он концентрируется в gems, часто ассоциированные с CB. Взаимодействие между SMN и fibrillarin было продемонстрировано с использованием дрожжевой двугибридной системы (Pellizzoni et al., 2001). Разрушенный SMN и его некоторые мутанты показывают, что fibrillarin и GAR1 рибонуклеопротеин нуждаются в консервативном Y/G box, который обнаруживается у некоторых пациентов со спинальной мышечной атрофией (Pellizzoni et al., 2001).

Удвоение гена fibrillarin у растений может приводить к специализированным функциям. Fibrillarin 2 от A. thaliana, как было установлено, является частью комплекса посредника для транскрипции RNA pol II, нечто может быть уникальным для группы растений. Также fibrillarin может взаимодействовать с базовыми транскрипционными факторами RNA pol II, такими как транскрипционный фактор IIB (Backstrom et al., 2007).

Многие др. белки были установлены, как взаимодействующие с fibrillarin (Krogan et al., 2006; Chatr-Aryamontri et al., 2013). Figure 4 показывает некоторые из возможных процессов, в которых участвуют партнеры fibrillarin. Функциональные роли были выделены для предварительного выбора, но белки могут иметь и дополнительные функциональные роли внутри клетки. Дополнительная Table 2 представляет полный список известных взаимодействующих партнеров и процессов, в которых они участвуют. Не удивительно, большинство белков участвует в биогенеза рРНК и процессах созревания рРНК. Ранее известные чувствительные к температуре мутанты fibrillarin могут оказывать влияние на взаимодействие с некоторыми из этих белков и тем самым могут объяснять ранние фенотипы нестабильности рибосом , когда NOP1 мутантен по аминокислотам E198G и A245V. Более того, др. функциональное взаимодействие может быть специфическим только в определенных клеточных условиях, напр., токсические металлы, такие как ртуть и алюминий, приводят к смещению fibrillarin в разных клетках и могут участвовать в аутоиммунном заболевании склеродермии, возможно за счет воздействия на деградацию с помощью 26S протеосом (Pollard et al., 1997; Chen et al., 2002; Jiang et al., 2014).

Figure 4. Schematic drawing of fibrillarin involved in cellular processes/ We show the cellular processes in which fibrillarin interacting proteins could be involved. Depending on the interacting protein and status of the cell some interactions may favour cell growth or growth inhibition. Fibrillarin interactions with proteins involved in these processes can be varied in nature, from stable structural complex formation to substrates for its enzymatic methylation activity in specific cells or environments. Мы показали клеточные процессы, в которых взаимодействующие с fibrillarin белки, могут участвовать. В зависимости от взаимодействующего белка и статуса взаимодействий некоторых клеток они могут способствовать клеточному росту или ингибированию роста. Взаимодействия fibrillarin с белками, участвующими в этих процессах, могут варьировать в природе от образования стабильных структурных комплексов с субстратами до активности ферментативного метилирования в специфических клетках или условиях.

Помимо белковых взаимодействий роль др. молекул д. быть изучена, чтобы понять функцию fibrillarin. Мы показали, что fibrillarin может соединяться с PIP2 для взаимодействия на стыках внутри ядрышка и klkz ассоциации с запрождающейся рРНК для дальнейшего метилирования и процессинга (Yildirim et al., 2013). Кроме того, совместная локализация fibrillarin и PIP2 в активно транскрипбирующихся клетках выявлена в DFC регионе (Sobol et al., 2013).

Conclusion

There is very limited evidence that fibrillarin is functionally involved outside the realms of rRNA processing. However, experiments carried out with the antibodies against fibrillarin at the different steps of mitosis resulted in RNA polymerase I transcription reduction. This study showed the nuclear morphological changes in 40% of the cells with alterations in chromatin condensation. Also, these cells do not progress to G1 phase (Fomproix et al., 1998). One possibility is the genomic instability caused by the absence of fibrillarin due to the formation of R loops, in which the nascent pre-rRNA anneals to the rDNA template strand. This mechanism of genomic instability has been described with knockouts of the SR protein splicing factor ASF/SF2. The factor promotes recruitment of U1 snRNP to 5? splicing sites but its absence can cause R loops due to the hybridisation of nascent RNA with the single-stranded DNA strand bubble after RNA pol II passing (Li and Manley, 2005). Interestingly, fibrillarin also interacts with ASF/SF2 and it is unknown if the absence of fibrillarin can affect ASF/SF2 leading to genomic instability by this factor and the nuclear aberrations that have been reported (Fomproix et al., 1998). This is also in agreement with the data obtained in HeLa cells, where fibrillarin was silenced by RNAi up to 70%. This led to an aberrant formation of the nuclei in 30-45% of the cells before 72 h. The fibrillarin silencing reduced also the cellular growth. The authors proposed that fibrillarin is an important factor in the maintenance of the nuclear envelope and in the cellular growth in HeLa cells (Amin et al., 2007). Although recent experiments were not successful in obtaining the same effect (Tessarz et al., 2014), it is not clear if the observed differences result from the depletion time or the level of depletion. In plants, RNAi experiments on fibrillarin showed that plants with lower than 90% protein level in fibrillarin had extensive necrosis and dwarf phenotype, while 50% reduction had no significant effect on the tobacco plants (Kim et al.,2007). Fibrillarin is a very dynamic protein that can be involved in different processes inside the nucleus. The methylation activity of rRNA and H2A cannot explain all the processes in which the fibrillarin could be involved. Particularly, interesting is the observation that a group of interacting partners is related to the cell stress mechanism, in particular DNA damage, where little has been investigated. A more dotted pattern of fibrillarin staining was seen in irradiated U2OS human cell line as compared to the control (Foltankova et al., 2013). Upon DNA damage, other molecules such as check point kinase 1 kinase also migrate to the nucleolus and colocalise with fibrillarin (Peddibhotla et al., 2011). Moreover, therapeutic drugs such as RAP can relocate fibrillarin due to the DNA damage, which can indicate some additional roles of fibrillarin during DNA repair and apoptosis. Furthermore, fibrillarin, coilin and SMN can also be located at centromeres of human cells when infected by HSV-1 and in cells in which centromeres are damaged (Morency et al., 2007; Sabra et al., 2013). Fibrillarin has been shown to interact with proteins in several processes as shown in Figure 4 (for a complete list, see Supplementary Table 2). However, we should also consider the possibility that many of the interactions do not translate into a stable functional complex formation. It can rather imply that fibrillarin uses these proteins as a substrate for methylation, for example the H2A, or it is itself a substrate for others such as PRMT1. This case scenario could explain the abundance of methylated ribosomal proteins that interact with fibrillarin and at the same time the lack of significant signal of fibrillarin in any particular ribosomal complex outside the nucleoli.

Fibrillarin from Archaea to human Ulises Rodriguez-Corona, Margarita Sobol, Luis Carlos Rodriguez-Zapata, Pavel Hozak and Enrique Castano Biology of the Cell Volume 107, Issue 6, pages 159-174, June 2015

Fibrillarin from Archaea to human
Ulises Rodriguez-Corona, Margarita Sobol, Luis Carlos Rodriguez-Zapata, Pavel Hozak and Enrique Castano
Biology of the Cell Volume 107, Issue 6, pages 159-174, June 2015