С момента их открытия более 100 лет назад, статус glycosphingolipids (GSLs) довольно сильно изменился с биохимических характерных черт в нервной системе до ключевого липида плазматической мембраны, участвующего в инфекционных болезнях, патологиях, связанных с нарушением лизосомной деградации (или болезней хранения GSL), нейродегенеративных заболеваниях, множественном склерозе, раке и диабете (Ginzburg et al., 2004; Xu et al., 2010). Работы многих лаб. в последние 20 лет продемонстрировали, каковы химические свойства GSLs, лежащие в основе их активности в биологических мембранах (Sahl et al., 2010; Brown and Rose, 1992; Kenworthy and Edidin, 1998; Sharma et al., 2004; Douglass and Vale, 2005; Goswami et al., 2008; Eggeling et al., 2009). С тех пор, как была предложена жидкостная мозаичная модель Singer и Nicholson (Singer and Nicolson, 1972), согласно которой белки и липиды свободно распространяются внутри относительно гомогенного мембранного липидного бислоя, наши представления об организации мембран кардинально изменились (Kusumi et al., 2010; Simons and Ikonen, 1997; Anderson and Jacobson, 2002; Hakomori, 2002a,b; Mayor and Rao, 2004). В современных моделях разнообразие и биофизические свойства компонентов липидных мембран, включая glycerophospholipid, cholesterol и sphingolipid (ceramide, sphingomyelin, phosphoethanolamine ceramide и GSLs) молекулы, управляются образованием мозаичных липидных нанодоменов в 5-10 nm в диаметре (Fig. 1; Sahl et al., 2010; Sharma et al., 2004; Pinaud et al., 2009). Взаимодействия между этими липидами и ассоциированными с мембранами и внедренными в мембраны белками лежат в основе кортикальной актиновой сети, регулируют образование кластеров и тем самым подвижность нанодоменов в более крупных протеолипидных доменах (100-300 nm) (Douglass and Vale, 2005; Goswami et al., 2008) это, как полагают, обеспечивает стабильность сигнальных комплексов и контролирует их сигнальную эффективность (Ianoul et al., 2005; Gales et al., 2006; Pontier et al., 2008).

Figure 1. GSL and sphingomyelin nanodomains. Simplified model of the plasma membrane showing that cholesterol, glycerophospholipids, sphingomyelin, and GSLs form different types of ordered nanodomains within the external leaflet of the membrane. Transmembrane proteins (e.g., Receptor tyrosine kinases [RTK] or G-protein coupled receptors [GPCR]) and membrane-associated proteins (GPI-anchored proteins or Heterotrimeric G proteins) localize differentially depending on their relative affinity for the different ordered lipid environments. For instance, GPI-anchored proteins exhibit a high affinity for simple and complex GSL nanodomains (Pinaud et al., 2009). Considering the average size of nanodomains (5-20 nm), proteins are most likely present in only one or three or four copies per nanodomain. Dynamic rearrangement of these nanodomains upon, for example, ligand activation, can lead to the formation of larger proteolipidic platforms (100-300 nm) (Kusumi et al., 2010).

Поскольку важные молекулярные принципы влияния GSLs на архитектуру мембран и функция сигнальных молекул изучены лишь частично, то перенос этих знаний на уровень развивающихся и стареющих организмов остается затруднительным. Генетический анализ метаболических путей GSL у червей, мух или мышей это первая ступень в направлении исследования этих комплексов (Furukawa et al., 2004; Stolz et al., 2008; Marza et al., 2009; Pizette et al., 2009; Hamel et al., 2010).

SYNTHESIS AND BIOPHYSICAL PROPERTIES

Structure and Synthesis

GSLs обладают общим со всеми сфинголипидами sphingoid костяком, который является результатом конденсации serine с acyl цепью. Эта реакция составляет ограничивающую ступень синтеза сфинголипидов и находится под контролем сложных метаболических регуляций (Breslow and Weissman, 2010). Эти молекулы sphingosine далее ацетилируются в ER с помощью ceramide synthases, чтобы сгенерировать церамид (ceramide) (Acharya and Acharya, 2005; Pewzner-Jung et al., 2006). Церамиды могут затем быть модифицированы с помощью различных sphingomyelin синтаз (synthases, чтобы сгенерировать phosphocholine церамид (наз. также sphingomyelin) или phosphoethanolamine церамид (Acharya and Acharya, 2005; Ternes et al., 2009), превращаемый в молекулы galactosylceramide или транслоцируемый в цис-Гольджи аппарат, чтобы превратиться в glucosylceramide (Fig. 2) (Degroote et al., 2004; Xu et al.2010). Молекулы galactosyl- и glucosylceramide инициируют образование GSLs. Galactosylceramide впоследствии модифицируются в sulfatides, тогда как молекулы glucosylceramide дают все остальные типы GSLs, все они синтезируются в аппарате Гольджи (Fig. 2). Сложность олигосахаридных групп, добавляемых к glucosylceramide модулю существенно варьирует среди GSLs в пределах от двух молекул сахара (Lac-Cer или Mac-Cer) до сложных олигосахаридных цепочек, ковалентно связанных и молекулами neuraminic кислоты у млекопитающих или phosphoetanolamine группами у насекомых (Fig. 2) (Chen et al., 2007).

Figure 2. GSL synthetic pathways. The glycosyltransferases and GSLs discussed in this review are in blue and red, respectively.

У беспозвоночных идентифицирован единственный тип GSLs, а именно arthroserie (Chen et al., 2007), который характеризуется присутствием остатка маннозы на месте галактозной половинки, обнаруживаемой в LacCer модуле (Fig. 2). У млекопитающих может появляться несколько типов модификаций на уровне цепочек сахаров и соответственно были охарактеризованы разные серии GSLs: globo-, lacto/neolacto-, sulfo- или phosphoglycosphingolipids, а также серии GSLs, содержащие половинки из некоторых neuraminic кислот, а именно gangliosides (Fig. 2). Тщательная классификация различных типов сфинголипидов дана в работе Fahy et al. (2005).

The Glycosphingolipid Synthases

Glycosphingolipid синтазы эволюционно законсервированы от насекомых до млекопитающих (Schwientek et al., 2002; Griffitts et al., 2003, 2005; Wandall et al., 2003, 2005; Johswich et al., 2009). Они преимущественно локализуются в аппарате Гольджи в соответствии с цис-транс организацией (Wandall et al., 2005; Johswich et al., 2009), при этом энзимы, катализирующие первые реакции в биосинтетическом пути оказываются расположенными ближе к интерфейсу ER-Golgi, по сравнению с энзимами, катализирующими последующие и более сложные модификации (Maccioni et al., 2011). Кроме того, последовательные реакции, по-видимому, катализируются с помощью мультиэнзимных молекулярных комплексов (Giraudo et al., 2001). Также первая реакция, т.e., добавление глюкозы к церамиду, происходит на цитозольном листке мембраны Гольджи, тогда как все последующие добавления единиц сахаров катализируются со стороны просвета Гольджи (Maccioni et al., 2011). В результате, комплексы GSLs в основном асимметрично локализованы в наружном листке мембран. Поскольку основная масса нового синтеза GSL происходит в мембранах Гольджи, то присутствие glycosyl hydrolases и transferases в плазматической мембране указывает на то, что динамическая регуляция состава GSL может также осуществляться на клеточной поверхности (Sonnino et al., 2010).

Biophysical Properties and Phase Separation in Biological Membranes

По сравнению со средним количеством мембранных glycerophospholipids, церамидные acyl цепочки из 400 видов GSLs, обнаруженных у млекопитающих длиннее и сильно насыщены. Эти химические особенности ведут к более высокой температуре (Tm) перехода от высоко упорядоченной (Lo) до неупорядоченной (Ld) фазы (Sonnino and Prinetti, 2010; Prinetti et al., 2009). В то время как Tm для типичного ненасыщенного glycerophospholipid значительно ниже 0°C, для насыщенных липидов, таких как sphingomyelin или простой glucosylceramide, обнаруживается контраст Tm в 45° и 80°C, соотв. Поэтому GSL обнаруживают сильную тенденцию к приобретению гель-подобной упорядоченной структуры (Lo фаза) и латерально сегрегируют от липидов с низкой Tm, которые обладают дезорганизованной организацией. Кроме того, учитывая высокую Tm, длина и уровень насыщения GSL acyl цепей д. предопределять способность каждой молекулы GSL создавать локальные взаимные проникновения (interdigitations) на интерфейсе двух мембранных листков. Эти локальные взаимные проникновения делают жесткими соотв. регионы мембраны (Roux et al., 2005). В противоположность млекопитающим присутствующие у насекомых GSLs имеют более короткие acyl цепочки (C14 vs. C20) (Rietveld et al., 1999; Acharya and Acharya, 2005). Средняя Tm arthroserie GSLs у насекомых поэтом д. быть снижена, соотв. Эти различия в длине acyl цепочек и ассоциированной Tm между arthro-GSLs и GSLs позвоночных могут быть связаны с тем фактом, что беспозвоночные являются allotherm и обладают адаптацией жидкости их мембран к низким температурам.

Головки комплексов GSL увеличивают латеральный объем и количество водородных мостиков, формируемых с водой, окружающей мембраны, тем самым влияя на их Tm характеристики. Объёмистость и водородные мостики, как полагают, также управляют и стабилизируют фазу разделения и коррелируют с позитивным изгибом мембран (Westerlund and Slotte, 2009). Для сходных acyl цепочек липиды комплексов GSL упакованы более плотно, чем в sphingomyelin. Такая организация, как было установлено, ослабляет сродство комплексов GSLs к холестеролу, который может только смешиваться с комплексами GSLs в присутствии sphingomyelin или простых GSLs (Sonnino and Prinetti, 2010; Prinetti et al., 2009).

Специфические биофизические свойства определенных видов GSL могут влиять на организацию биологических мембран. Иллюстрацией этому являются GM1 и GM3 gangliosides, образующие независимые кластеры в биологических мембранах. Такие кластеры обладают дифференциальной чувствительностью к истощению холестерола или деполимеризации актина после фармакологических воздействий (Fujita et al., 2007, 2009). Т.о., GSLs вносят вклад в образование гетерогенных мозаичных нанодоменов в биологических мембранах.

Association of Membrane Proteins to GSL-Containing Nanodomains

Молекулярные основы, обеспечивающие локализацию специфических мембранных белков в окружении специфических упорядоченных нанодоменов, активно исследовались. Пост-трансляционные модификации с glycosylphosphoinosityl (GPI) или группами palmytic кислоты, как было установлено, обеспечивают предпочтительное распределение мембранных белков внутри нандоменовых платформ (Brown and Rose, 1992; Zacharias et al., 2002; Levental et al., 2010). GPI или palmitoyl группы содержат насыщенные углеводородные цепочки, обеспечивающие сродство к остову sphingolipid церамидов. Белки могут также взаимодействовать непосредственно со специфическими GSLs благодаря их гликозилированным головкам в мембране (Griffitts et al., 2005; Romer et al., 2007). Холерный токсин соединяется специфически с GM1 (Fishman, 1982),тогда как shiga-токсин и белок оболочки HIV gp120 связывают globoside trihexosylceramide (Gb3) (Mahfoud et al., 2002; Romer et al., 2007). Детальный структурно функциональный анализ, проведенный на HIV gp120 белке привел к идентификации пептидных мотивов со специфическими свойствами связывания GSL (Mahfoud et al., 2002). Такой GSL Binding Motifs (GBM) теперь был идентифицирован в различных белках эукариот, включая Prion protein (PrP) (Mahfoud et al., 2002), alzheimer-associated beta-amyloid (Mahfoud et al., 2002), Parkinson-associated ?-synuclein (Fantini and Yahi, 2011), члены семейства рецепторов TNF (Chakrabandhu et al., 2008), лигаднды для рецепторов Notch, Serrate и Delta (Hamel et al., 2010), и маркер стволовых клеток prominin/CD133 (Taieb et al., 2009). Интересно, что специфическое связывание α-synuclein с GM3 способствует его правильной укладке (Di Pasquale et al., 2010). Т.о., конформация белка может быть модулирована с помощью взаимодействия GSL с белком. Эта активность GSL, скорее всего, лежит в основе некоторых его ролей in vivo в регуляции сигнальных комплексов.

REGULATORY FUNCTIONS

Regulation of Protein Conformation and Activation

В то время как многие сообщения описывают роль нанодоменов в сигнальной трансдукции, лишь немногие исследования изучали механистическую роль GSLs (Yoon et al., 2006; Coskun et al., 2011). Недавняя работа Coskun и коллег о роли GM3 в регуляции Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) является характерным исключением, связанным с непосредственным влиянием GSLs на сигнальные белки (Coskun et al., 2011). При внедрении очищенной формы рецептора в протеолипосомы липидов определенной композиции. эти авторы чётко продемонстрировали, что молекулы GM3 ограничивают димеризацию рецептора и аутофосфорилирование. Это GM3-обусловленное ингибирование может быть преодолено с помощью EGF лиганда и базируется на прямом взаимодействии между GM3 группой neuraminic кислоты с внеклеточным лизином, расположенным проксимальнее трансмембранного домена EGFR. Мутации этого лизинового остатка устраняют ингибирование димеризации EGFR с помощью GM3 и приводят к его конституитивному аутофосфорилированию и активации. Эти результаты устанавливают прямую связь между EGFR/GSL взаимодействием и олигомеризацией и функцией рецептора. В биологических мембранах EGFR, как было установлено, обладает как низким (nM range), так и высоким (pM range) сродством сайтов связывания с его лигандом (Sigismund et al., 2005; Coskun et al., 2011), а протеолипосомы, использованные в этом исследовании восстанавливали только низкого сродства сайты связывания EGF. Тем не менее, эти данные подтвердили предыдущие результаты относительно роли GM3 в регуляции активности EGFR в мембранах (Yoon et al., 2006) и коррелируют с существованием EGF-индуцированного мономерно-димерного динамического перехода рецептора в мембранах живых клеток (Zhang et al., 2009).

Лизиновый остаток, причастный к GM3-обеспечиваемому ингибированию EGFR, по-видимому, законсервирован и в др. тирозин киназных рецепторах, таких как инсулиновый рецептор (Kabayama et al., 2007). Опять же взаимодействие между лизином и молекулами GM3, как полагают, ослабляет конституитивную активность рецептора (Kabayama et al., 2007). Интересно, что этот молекулярный сценарий целиком согласуется с наблюдением, что инсулиновый рецептор постоянно фосфорилируется у GM3-дефицитных мышей (Yamashita et al., 2003). Взаимодействие инсулинового рецептора с GM3, как полагают, конкурентно ограничивает присутствие рецептора в доменах кавеол, а , следовательно, и сигнальную трансдукцию (Kabayama et al., 2007). Регулирует ли GM3 активность и локализауию рецептора посредством индуцированных конформациями изменений подобно тому, что наблюдается в случае EGFR, предстоит определить.

Молекула GM1 также участвует в регуляции нескольких рецепторов, среди них PDGF и TRK рецепторы. Модуляция GM1 оказывает драматическое влияние на локализацию в мембране PDGF рецептора (Veracini et al., 2008) и , как полагают, регулирует функцию TRK рецептора за счет аутокринной стимуляции своего собственного лиганда, молекулы neurotrophin (Rabin et al., 2002; Mallei et al., 2004). Взаимодействует ли GM1 непосредственно с PDGF рецептором и/ или нейротрофином, чтобы модулировать их конформацию, как это установлено для GM3 и EGFR рецептора, неизвестно.

Regulation of Endocytosis

Биофизические свойства GSLs ограничивают их способность модулировать изгиб мембраны. Недавнее исследование интернализации токсина Shiga выявило, как связывание Gb3 с гомо-пентамерной субъединицей B токсина Shiga управляет образованием локальной Lo жидкой упорядоченной фазы (Windschiegl et al., 2009), внося вклад в изгиб мембраны (Sorre et al., 2009) и в образование мембранных тубул (Romer et al., 2007). Взаимодействие между GSLs и расположенным ниже кортикальным актином, по-видимому, необходимо для разделения тубул и пузырьков, актин управляет соотв. зависимыми от холестерола перестройками мембран с учетом разделения (scission) (Romer et al., 2007).

Поскольку эти данные подтверждают, что качественные особенности GSL могут контролировать динамику мембран, однако, действительное значение нанодоменов или GSLs в регуляции трафика белка экспериментально трудно установить (Sigismund et al., 2008). Частично трудности происходят от разнообразия молекулярных систем (machineries) поддержания событий интернализации, регулируемых холестеролом и независимых от clathrin (Mayor and Pagano, 2007). Поэтому мы ограничим наше обсуждение двумя примерами clathrin-независимой интернализации, которая, скорее всего, использует базирующиеся на GSL нанодомены, поскольку сигнальная активность интернализованных рецепторов, как известно, модулируется с помощью нанодоменовых платформ.

Первый пример связан с интернализацией EGFR. Поскольку взаимоотношения между EGFR и clathrin-независимой интернализацией известны многие годы (Chinkers et al., 1979), но то, как эта миграция модулирует функцию EGFR, стало ясно только в 2005, когда Sigismund et al. продемонстрировали, что clathrin-независимый механизм, скорее всего, участвует в ослаблении передачи сигналов EGFR (Fig. 3; Sigismund et al., 2005). Моно- или полимоноубиквитинирование EGFR, как было установлено, управляет его интернализацией посредством clathrin-независимого и epsin-зависимого механизма. Связывание epsin с ubiquitin частицей, по-видимому, ингибирует привлечение epsin с помощью белка clathrin и сегрегацию комплекса рецептор/ubiquitin/epsin прочь от покрытых клатрином ямок (Chen and De Camilli, 2005). Это событие происходит преимущественно при высоких концентрациях лиганда и приводит в результате к деградации EGFR (Sigismund et al., 2005, 2008; Huang et al., 2007). Напротив, clathrin-обусловленная интернализация происходит при низкой концентрации EGF (состояние высокого сродства связывания) и нуждается в купировании рецептора с его классическими сигнальными путями PI3K и/или MAPK (Goh et al., 2010; Sigismund et al., 2005, 2008).

Сходную модель можно приложить к TGF-? рецепторам, которые играют множество важных ролей во время развития, в частности, для поддержания стволовых клеток (Di Guglielmo et al., 2003). Члены сверхсемейства TGF-? передают сигналы посредством гетеродимерных комплексов Ser-Thr киназных рецепторов. Активированный TGF-? рецептор фосфорилирует белки Smad2 и Smad3, которые затем соединятся с эффектором Smad4, чтобы модулировать экспрессию генов. Smad7, негативный, в конечном итоге ассоциирует с рецептором и рекрутирует E3-ubiquitin лигазы Smurf-1 и Smurf-2, чтобы способствовать подавлению и деградации рецепторов. В важной работе, Di Guglielmo et al. (2003) показали, что эта дифференциальная связь рецептора с Smad2/Smad3 или Smad7/Smurf1/Smurf2 коррелирует с определенными маршрутами доставки. В частности, комплекс Smad2/Smad3 эндоцитозируется посредством clathrin-зависимого механизма, тогда как комплекс Smad7/Smurf-1/Smurf-2 доставляется посредством специфических нанодоменов, известных как кавеолы (Di Guglielmo et al., 2003).

Этот регуляторный механизм может быть важен для поддержания и дифференцировки стволовых клеток (Xia et al, 2010; Yamazaki et al., 2009). У Drosophila, Smurf 2 подавляет передачу сигналов TGF-? в дочерних клетках стволовых клеток зародышевой линии, которые подвергаются дифференцировке (Xia et al., 2011). Было бы интересно исследовать, использует ли функция Smurf2 у Drosophila нанодоменами обеспечиваемую ил клатрин-независимую интернализацию рецепторов. У мышей сходный регуляторный механизм, по-видимому, модулирует гематопоэз (Yamazaki et al., 2009). В этой связи ингибирование образования кластеров нанодоменами (которое может отражать способность нанодоменов интернализоваться динамически), как было установлено, зависит от активности TGF-? рецепторов и важно для поддержания стволовых клеток (Yamazaki et al., 2006). Также подавление передачи сигналов TGF-? в дифференцирующихся клетках коррелирует с их способностью образовывать кластеры нанодоменов de novo. Т.о., регуляция образования кластеров с помощью передачи сигналов TGF-? рецепторов, по-видимому, важна для ингибирования дифференцировки. Было бы интересно расшифровать молекулярные механизмы, лежащие в основе этой регуляции. Простой и захватывающей возможностью является то, что передача сигналов TGF-? рецепторов регулирует экспрессию генов, участвующих в биосинтетическом пути.

CONTROL OF GSL SYNTHESIS DURING DEVELOPMENT

Степень, с которой липидный состав мембран варьирует во время развития, коррелирует и/или управляет дифференцировкой, в основном неизвестна. Это может быть частично обусловлено отсутствием подходящего молекулярного инструмента для определения количественных и клеточно-специфичных изменений в развивающихся организмах. Тем не менее, изменения в экспрессии синтаз церамидов и GSL и присутствие их соотв. липидных продуктов было описано во время дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека (Liang et al., 2010; Park et al., 2010). Мультипотентные Oct4-позитивные стволовые клетки имеют в основном GSLs с globoserie сигнатурой, в то время как более дифференцированные клетки обнаруживают увеличение GM3 и GD2 gangliosides. Поскольку изменения в содержании GSL ранее наблюдались во время развития, а также при различных патологических процессах (Hakomori, 2002a,b; Xu et al., 2010), то это первое сообщение, указывающее на то что дифференцировка стволовых клеток коррелирует с изменениями в липидной композиции мембран. Важно узнать воздействуют ли и как эти изменения на дифференцировку.

Удивительно, некоторые из маркеров стволовых клеток, которые обычно используются для FACS очистки стволовых клеток, включая prominin/CD133, CD44, Sca-1, Thy, ?1- and ?4-integrin белки, являются bona fide белками, ассоциированными с нанодоменами. Эти белки высоко экспрессируются на поверхности стволовых клеток из крови, молочных желез, мышц, жирового тела, поджелудочной железы, кишечника и простаты (Liu et al.2011; Prestegarden and Enger, 2011; Wojakowski et al., 2011; Zeki et al., 2011; Pontier and Muller, 2009). Было бы интересно проверить, могут ли изменения в составе GSL коррелировать как с динамическим удалением этих маркеров стволовых клеток с поверхности во время дифференцировки и регуляции транскрипции энзима GSL синтазы (Liang et al.2010).

GENETIC ANALYSIS OF GSL FUNCTIONS

Genetic Studies in Model Organisms

GSLs важны для развития многоклеточных организмов. Мутации и/или замалчивание генов, кодирующих GlcT энзим, уникальный энзим, который регулирует продукцию glucosylceramide, является летальным у C. elegans, D. melanogaster и M. musculus (Yamashita et al., 1999; Marza et al., 2009; Kohyama-Koganeya et al., 2004) (Tables 1 and 2; Fig. 2). В частности, эмбрионы мышей подвергаются массивном апоптозу по ходу их гаструляции, возможно из-за накопления церамидов, которые, как полагают, появляются в отсутствие glucosyltransferase (Hannun and Obeid, 2008). Согласно этой идее, накопление молекул церамидов после мутации в гене neutral ceramidase, ведет к дегенерации фоторецепторов Drosophila (Acharya et al., 2008). Table 1. List of the Different Genetically Engineered Mice for GSL Synthases Table 2. Phenotypic Characteristics of GSL Synthase Mutants in Invertebrates

Генетический анализ последовательных энзимов пути синтеза GSL предоставляет интересную информацию о роли in vivo GSLs. Делеция генов, участвующих в синтезе MacCer у беспозвоночных (соответствует функционально LacCer позвоночных) (Wandall et al., 2005) совмещается с кажущейся нормальной жизнью у C. elegans (Katic et al., 2005), но не у Drosophila (Goode et al., 1992, 1996b) (Table 2). У мышей (Fig. 2 and Table 1) генетическое перекрывание и функциональная диверсификация могут осложнять этот вопрос. В самом деле, два энзима, по-видимому, регулируют продукцию LacCer. Кроме того, эти энзимы также участвуют в гликозилировании O- и N-белков (Yamashita et al., 1999). Поэтому трудно оценить специфическое влияние делеции LacCer в мембранах позвоночных. Простые модельные организмы поэтому составляют собой важный источник информации о роли молекул MacCer и LacCer в развитии. У Drosophila, MacCer синтезируется с помощью glycosyltransferase, известной как Egghead (Egh) (Fig. 2 and Table 2; Wandall et al., 2003). В то время как мутации в egh гене приводят к накоплению GlcCer липидов, мутации в гене, кодирующем энзим, отвечающий за гликозилирование MacCer в GlcNAcMacCer, известный как Brainiac (Brn) у мух (Fig. 2 and Table 2), ведет к накоплению как MacCer , так и GlcCer липидов (Wandall et al., 2005; Pizette et al., 2009). Интересно, что мутации egh и brn имеют очень сходные фенотипы, которые могут быть результатом или накопления GlcCer липидов (или любого продукта, стоящего выше GlcCer пути синтеза сфинголипидов) или истощением комплексов GSLs (т.e., любого продукта, стоящего ниже MacCer в пути синтеза GSL). В то время как индивиды, несущие сильные egh и brn аллели, погибают на стадии куколки при отсутствии видимых анатомических нарушений, гипоморфные мутантные мухи жизнеспособны, но самки стерильны. Генетический мозаицизм выявил, что синтез комплексов GSLs необходим для собственно оогенеза в зародышевой линии самок (Goode et al., 1992, 1996a, b). В частности, мутантные ооциты egh и brn неспособны индуцировать корректную пролиферацию и эпителиальный морфогенез дикого типа соматических фолликулярных клеток, которые окружают ооцит, приводя к дефектам, сходных с таковыми после снижения передачи сигналов Notch и/или EGFR (Goode et al.1992, 1996a, b; Pizette et al., 2009). Интересно, что гомологи egh и brn у червей также модулируют межклеточные коммуникации, обеспечиваемые с помощью Notch (Katic et al., 2005).

Молекулы LacCer могут быть модифицированы далее у мышей с помощью 4-х разных энзимов (Fig. 2 and Table 1), чтобы генерировать или GM3 (предшественник всех gangliosides), Gb3 (первый GSL из globoserie), GA2 (предшественник всех asialo-serie GSL) или GSLs из lacto/neolacto-serie. Интересно, что что эти 4 энзима регулируются в ходе онтогенеза (Xu et al., 2010). Отметим, что продукт Brn может рассматриваться или как нейтральный GSL, сходный с Gb3, или как кислый GSL, сходный с GM3, когда он ковалентно соединяется с молекулами phospho-ethanolamine (PE) (Chen et al., 2007). В то время как brn является важным геном у мух (но не у червей), ни один из 4-х энзимов строго необходим для эмбрионального развития мышей, по крайней мере, в отдельности (Table 1) (Togayachi et al.2010; Takamiya et al., 1996; Sheikh et al., 1999; Yamashita et al., 2003; Okuda et al., 2006; Yoshikawa et al., 2009). Это может указывать на то, что GM3/GA2, Gb3 и Lacto- GSLs являются до определенной степени взаимно заменяемыми во время периода развития, также как и после рождения (Tables 1 and 2). Мутантные мыши, однако, обнаруживают специфические пагубные фенотипы, указывая тем самым, что компенсация между разными GSL сериями неполная (Table 1). Интересно, что мутантные по GM3 synthase мыши обнаруживают специфическую дегенерацию органа Корти и, как полагают, становятся глухи вскоре после рождения (Yoshikawa et al., 2009).

Наконец, мы отметили, что потеря этих видов GSL может приводить к увеличению др. видов GSL из др. ветвей (Yamashita et al., 2005; Furukawa et al., 2008) В более общем смысле липидомные исследования на дрожжах и мухах показали, что компенсаторные изменения поддерживают клеточный гомеостаз в ответ на потерю специфических видов липидов (Guan et al., 2009; Carvalho et al., 2010). Т.о., выводя роль данного вида GSL только из исследований потери функции, можно ошибиться и обычно генетические данные лучше всего интерпретируются в контексте дополнительных молекулярных данных. Также будущие липидомные исследования GSL мутантов, оценивающие экспрессию разных энзимов, участвующих в метаболизме sphingolipid/GSL, и относительные количества их молекулярных продуктов, смогут предоставить важную информацию о гомеостазе in vivo sphingolipid.

GSLs in Neurological Diseases

Этот эффект потери GM3 на слух у мышей иллюстрирует важность ганглиозидов в развитии нервной системы. У мух egh и brn мутантные эмбрионы обладают слабой гиперплазией ЦНС и chordotonal нейронов в периферической нервной системе in the peripheral nervous system (Goode et al., 1996a; S.P. and F.S., unpublished results). Интересно, что хордотональные органы у мух нейроны Кортиева органа у млекопитающих специфицируются с помощью консервативного пронейрального транскрипционного фактора наз. Atonal у мух и Math1 у мышей (Ben-Arie et al., 2000; Wang et al., 2002). Клональная специфичность, обнаруживаемая у мух может предоставлять важное преимущество для определения характерных особенностей GSL-чувствительных факторов в Atonal/Math-производных нейронах у млекопитающих.

Нейродегенеративные фенотипы, отражающие важную роль комплексов GSLs и gangliosides в поддержании гомеостаза нейронов, наблюдались на разных GSL мутантных генетических фонах. Мыши с делецией GM2 и Gd3 или GM2 и GM3 синтаз развиваются нормально, но начинают обнаруживать слабость в задних конечностях, атаксию и глобальную нейродегенерацию между 3 и 12 неделями (Inoue et al., 2002; Yamashita et al., 2005; Ohmi et al., 2009). Нокаутные мыши по GM3 и GM2 синтазам, не образуют ганглиозидов и обладают более сильными фенотипическими отклонениями. В большинстве случаев мыши погибают спустя примерно 2 мес. с необычно высокими уровнями lactosylceramide и lactosylceramide sulfate (Yamashita et al., 2005).Интересно, что накопление MacCer продуктов, наблюдаемое у гипоморфных brn мух (Pizette et al., 2009, Wandall et al., 2005) сопровождается дефектами локомоции (Chen et al., 2007). Сходным образом, мутантные мухи по энзиму β4GalNAcTA, который катализирует продукцию более сложных GSLs (Fig. 2), дакже обнаруживают дефекты в передвижениях и аномальное развитие их нейромышечных соединений (Haines and Irvine, 2005; Chen et al., 2007; Haines and Stewart, 2007; Table 2). Обладают или нет эти разные мутанты нейродегенеративными признаками важно установить.

Во всяком случае эти исследования иллюстрируют, как животные модели могут улучшить наше понимание нейродегенеративных болезней, наблюдаемых при GSL Storage Disorders, а также при ряде нейродегенеративных болезней, таких как болезнь Паркинсона или Алцгеймера, при которых метаболизм GSL также нарушен. Роль GSLs при этих патологиях рассматривалась (Ginzburg et al., 2004; Xu et al., 2010) и мы отправляем читателям к этим обзорам. Здесь мы просто хотели бы подчеркнуть, что GSL генетические модели могут представлять собой возможные инструменты, чтобы (1) прояснить, может ли клеточная дегенерация затруднена путем снижения накопления GSL ; (2) определить предполагаемые генетические и/или фармакологические мишени, позволяющие компенсировать такое накопление и помочь нейронам возродить свой нормальный гомеостаз (Ginzburg et al., 2004); и (3) создать регенеративные стратегии. Эта последняя идея представлена улучшением регенерации слуховых нейронов у глухих кошек, наблюдаемое после добавления GM1 (Leake et al., 2007), которое, как полагают, увеличивает аутокринную экспрессию нейротрофных факторов и ведет к стимуляции TRK рецепторов (Rabin et al., 2002; Mallei et al., 2004).

DEVELOPMENTAL ROLES OF GSLS IN SIGNALING

Наше сегодняшнее понимание влияния GSLs на развитие очень ограничено и в основном базируется на исследованиях, проведенных на Drosophila. Они подтверждают, что GSLs влияют прежде всего на активность сигнальных лигандов. Мы поэтому обсудим, как изменения в синтезе GSL у мутантных мух могут влиять на диффузию, доставку и активность лигандов.

Complex GSLs Favor the Optimal Diffusion of the EGFR Ligand, Gurken

Во время оогенеза, образование дорсальных фолликулярных придатков нуждается в активации пути EGFR в соматических фолликулярных клетках. EGFR лиганд, Gurken, синтезируется и секретируется зародышевой линией и стимулирует активацию EGFR в фолликулярных клетках во время этого процесса (Pizette et al., 2009). Как описывалось выше, дефектный синтез GSL в зародышевой линии, но не в фолликулярных клетках влияет как на пролиферацию клеток, так и организацию эпителия в соматических фолликулярных клетках, окружающих яйцо. GSL мутантные клоны зародышевой линии также ассоциируют с дефектами морфогенеза дорсальных фолликулярных придатков, напоминающими EGFR мутантные фенотипы. Поэтому было предположено, что egh, brn и ?4GalNacTB регулируют функцию Gurken (Goode et al., 1992, 1996a, b; Chen et al., 2007; Pizette et al., 2009) , не нарушая функцию его рецептора. Важно, что brn мутанты, как было установлено, затрагивают собственно внеклеточную диффузию Gurken лиганда на интерфейсе между зародышевыми и фолликулярными клетками (Pizette et al., 2009). Соединение Gurken с GSLs на поверхности ооцита, как полагают, способствует присущей ему диффузии и его доступности для взаимодействия с EGFR на противоположной мембране фолликулярных клеток. Взаимодействуют ли GSLs в мембране ооцита непосредственно с Gurken и влияет ли его конформация, как полагают, для др. GSL-взаимодействующих белков (Fantini and Yahi, 2011), ещё предстоит выяснить.

Итак, данные in vitro демонстрируют влияние GSLs на конформацию и активность самого EGFR (Coskun et al., 2011) в резком контрасте с влиянием egh или brn мутаций на функцию EGFR лиганда Gurken, которое наблюдается во время оогенеза мух (Pizette et al., 2009). Кроме того, мы отметили, что гомологи egh и brn червей функционально связаны с Notch, но не с EGFR у C. elegans. Эти различия могут быть интерпретированы, как подтверждающие, что in vivo GSLs действуют в зависимости от контекста и/или видо-специфичным образом. В соответствии с этой интерпретацией, GM3 синтаза мутантных мышей обнаруживает повышенное фосфорилирование инсулинового рецептора в клетках скелетных мышц, но не в адипоцитах (Yamashita et al., 2003). Будущие исследования, характеризующие молекулярную передачу сигналов, влияющую на GSL in vivo д. иметь целью понимание молекулярных основ подлежащей контекст-зависимой специфичности GSL, которая определенно поможет существующий разрыв между результатами in vitro и in vivo.

GSLs Modulate the Activity of Notch Ligands

Notch рецепторы активируются с помощью трансмембранных лигандов семейств Delta (Dl) и Serrate (Ser)/Jagged. У эмбрионов мух одной из функций Notch является ограничение количества нейроэпителиальных клеток, которые становятся клетками нейральных предшественников; у Notch мутантных эмбрионов нервная система формируется за счёт эпидермиса. Интересно, что сходный фенотип был описан после потери комплекса GSLs у эмбрионов, полученных из egh и brn клонов зародышевой линии (Goode et al., 1996a). Во время оогенеза передача сигналов Notch необходима частично на ст. 6, в клетках фолликулярного эпителия, чтобы с точностью регулировать их переход от митотического клеточного цикла к эндоциклу (Deng et al., 2001). В этом контексте сигналы Dl от ооцита активируют Notch в фолликулярных клетках, окружающих ооцит. Пониженная активация Notch в фолликулярных клетках вызывает дефекты, сходные с теми, что наблюдались в отсутствие Egh или Brn в зародышевой линии (Goode et al., 1996a; Rubsam et al., 1998), указывая тем самым, что GSLs могут позитивно регулировать активность Dl в ооцитах.

Соединение Dl (или Ser) с Notch, по-видимому, недостаточно для активации рецептора. В самом деле, убиквитинирование лигандов с помощью E3 ubiquitin лигаз Mindbomb или Neuralized является важным для активации рецептора (Le Borgne et al., 2005a). Одна из современных моделей предполагает, что убиквитинированные лиганды подвергаются эндоцитозу и "активируются" с помощью epsin-зависимого механизма прежде чем подвергнуться повторному использованию в плазматической мембране (Fig. 4) (Wang and Struhl, 2004, 2005). Др. модель предполагает, что эндоцитоз убиквитинированных лигандов более непосредственно влияет на активацию Notch рецептора, т.к. эндоцитоз генерирует механические силы, притягивающиеся к Notch, который в результате будет экспозировать сайт расщепления во внеклеточной части рецептора (Le Borgne et al., 2005a; Banks et al., 2010). На ст. 6 оогенеза эндоцитоз Dl с помощью epsin- и dynamin-зависимого (но не clathrin-независимого) механизма необходим ооциту для индукции активности Notch рецептора в фолликулярных клетках (Windler and Bilder, 2010). Эта сигнальная активность Dl может, однако, быть не нужной в последующем повторном использовании, т.к. активность rab11 и auxillin, двух белков, участвующих в рециклинге мембран, не нужна для активации Notch рецептора в фолликулярных клетках (Banks et al., 2010; Windler and Bilder, 2010). Итак, эти данные могут подтвердить, что комплексы GSLs облегчают Dl-обеспечиваемое притягивание Notch рецепторов , следовательно, их активацию за счет модулирования липидного окружения мембран из Dl.3

Figure 3. EGF-induced EGFR trafficking. Models of EGF-induced EGFR trafficking as proposed by Sigismund et al. (2005, 2008) and Chen et al. (2005). In the absence of EGF (1 in A and B), EGFR, Src, and H-Ras localize putatively into distinct nanodomains. In the presence of a low EGF concentration (A; pM range), EGFR in a high-affinity state engage signaling molecules such as Src and H-Ras (2) and cluster into clathrin-coated pits (3). These events are associated with the EGFR-mediated activation of MAPK (via Ras) and PI3K (via Src). At a higher concentration of EGF (B; nM range), the E3 ubiquitin ligase Cbl is recruited and induces the mono- or polymonoubiquitination of the EGFR (2). These ubiquitin moieties recruit Eps15 to the receptor, thereby inhibiting the recruitment of EGFR into clathrin-coated pits (Chen and De Camilli, 2005). Ubiquitinated-EGFR/Eps15 complexes are then endocytosed in a clathrin-independent manner (3). This endocytosis is sensitive to the levels of membrane cholesterol, possibly because of its role in the clustering of the GM3-rich nanodomains that contain EGFR. It will be important in the future to precisely determine how GSL composition and levels modulate clathrin-dependent (A) versus clathrin-independent (B) endocytosis.

Figure 4. Endocytosis of the Notch ligands. Model illustrating two possible modes of internalization of Serrate (and Delta). Ubiquitination by the E3 ubiquitin ligases, Mib and Neur, is required for the endocytosis and signaling activity of Serrate (and Delta). Ubiquitinated ligands can be internalized in a clathrin-, epsin-, and auxillin-dependent manner (1). Clathrin-independent endocytosis (Windler and Bilder, 2010) of ubiquitinated ligands may involve complex GSL, possibly through the direct interaction of Serrate (and Delta) to complex GSL via their GBM motif (Hamel et al., 2010) (2). Whether nanodomains enriched in sphingomyelin/simple GSL and ceramides that are present in MultiVesicular Bodies mediate the sorting and recycling of Serrate (and Delta) is not known.

Данные, полученные недавно на крыловых имагинальных дисках Drosophila согласуются с такой моделью. Избыточная экспрессия ?4GalNAcT1, GSL синтазы, действующей после ступени ?4GalNAcTA/TB (Table 2) и приводящей к формированию комплексов arthroGSLs, как было установлено, компенсирует дефект активации Notch, наблюдаемый вследствие замалчивания mindbomb (Hamel et al., 2010). Накопление Ser лиганда в плазматической мембране, наблюдаемое после молчания mindbomb (Le Borgne et al., 2005b) может быть также преодолено с помощью избыточной экспрессии ?4GalNAcT1 (Hamel et al., 2010). Отражают ли эти эффекты роль комплексов GSLs в Ser эндоцитозе и/или рециклинге или в непосредственных событиях Ser/Notch связывания и притяжения (binding/pulling) остается открытым вопросом.

Интересно, что воздействие организации мембран на активность Notch лиганда может быть законсервированным в ходе эволюции, т.к. мутации гомолога brn у червей редуцируют лиганд-зависимую активность активированной формы Notch рецептора (Katic et al., 2005). Кроме того, модуляции содержания холестерола в мембране клеток млекопитающих, как полагают, влияет на функции Notch лиганда (Heuss et al., 2008). Присутствие эволюционно законесервированных GSL-связывающих мотивов во внеклеточных доменах Dl и Ser подтверждает, что эти лиганды могут непосредственно взаимодействовать со специфическими GSLs на плазматической мембране (Hamel et al., 2010). Эти GSL-связывающие мотивы сходны с теми, что были найдены в PrP и HIV gp120 (Mahfoud et al., 2002). белки PrP и HIV gp120 , как было установлено, влияют как на организацию мембран, так и, по-видимому, способны к нападению (hijacking) на аппарат мембранного трафика, так что один участвует в формировании мембранных нанотрубок или cytoneme (Sowinski et al., 2008; Gousset et al., 2009). Было бы очень интересно в будущем протестировать, может ли непосредственное связывание Dl и Ser с мембранными GSLs влиять на их способность управлять своим собственным трафиком и локализацией в мембранных доменах, участвующих в передаче сигналов.

Наконец, мы отметили, что исследования на Drosophila и в культивируемых клетках подтверждают роль GSLs в модуляции активности базирующегося на epsin/ubiquitin clathrin-независимого эндоцитоза Dl (Goode et al., 1996a; Banks et al., 2010; Windler and Bilder, 2010; Hamel et al., 2010) и EGFR (Chen and De Camilli, 2005; Sigismund et al., 2005, 2008). Будущие исследования д. быть адресованы действительно ли и как базирующиеся на GSL нандомены регулируют epsin/ubiquitin аппарат.

PERSPECTIVES

The data reviewed here suggest that GSLs have at least two essential functions in development, a first one in the global sphingolipid homeostasis (Hannun and Obeid, 2008) and a second one in the regulation of key signaling pathways essential to development. Two important future goals are to first understand how perturbations in the synthesis of GSLs affect sphingolipid metabolism and, second, to mechanistically link the biological activities of specific GSLs with their particular biophysical properties. There are at least 400 species of GSLs in mammals. Characterizing the biophysical properties of these various GSLs and understanding the functional significance of this diversity is thus a challenging task. In line with this idea, a better understanding of the physical influence on the membrane organization of specific GSLs will certainly allow us to understand more clearly how these lipids affect the membrane properties of stem cells, differentiated cells, and/or aging cells. To reach these goals, the community will need to expand the molecular probes (such as antibodies or GSL-binding peptides) to detect specific GSLs in their native cellular environments using photonic live microscopy and gain access to their ultrastructure organization using electron or atomic force microscopy. Future collaborative work between geneticists, cell biologists, and physicists should unveil new exciting facets of the role of membrane components in differentiation and aging.

Glycosphingolipids in signaling and development: From liposomes to model organisms Stephanie M. Pontier, Francois Schweisguth Developmental Dynamics Special Issue: Special Issue on Drosophila Volume 241, Issue 1, pages 92–106, January 2012

Glycosphingolipids in signaling and development: From liposomes to model organisms
Stephanie M. Pontier, Francois Schweisguth
Developmental Dynamics Special Issue: Special Issue on Drosophila Volume 241, Issue 1, pages 92–106, January 2012