Посещений: 
GLI3
Экспрессия в черепно-лицевых структурах и внутренних органах
|
|
Cis-regulatory underpinnings of human GLI3 expression in embryonic craniofacial structures and internal organs Amir A. Abbasi, Rashid Minhas, Ansgar Schmidt, Sabine Koch, Karl-Heinz Grzeschik  Development, Growth & Differentiation
Volume 55, Issue 8, pages 699–709, October 2013 |
The zinc finger transcription factor Gli3 is an important mediator of Sonic hedgehog (Shh) signaling. During early embryonic development Gli3 participates in patterning and growth of the central nervous system, face, skeleton, limb, tooth and gut. Precise regulation of the temporal and spatial expression of Gli3 is crucial for the proper specification of these structures in mammals and other vertebrates. Previously we reported a set of human intronic cis-regulators controlling almost the entire known repertoire of endogenous Gli3 expression in mouse neural tube and limbs. However, the genetic underpinning of GLI3 expression in other embryonic domains such as craniofacial structures and internal organs remain elusive. Here we demonstrate in a transgenic mice assay the potential of a subset of human/fish conserved non-coding sequences (CNEs) residing within GLI3 intronic intervals to induce reporter gene expression at known regions of endogenous Gli3 transcription in embryonic domains other than central nervous system (CNS) and limbs. Highly specific reporter expression was observed in craniofacial structures, eye, gut, and genitourinary system. Moreover, the comparison of expression patterns directed by these intronic cis-acting regulatory elements in mouse and zebrafish embryos suggests that in accordance with sequence conservation, the target site specificity of a subset of these elements remains preserved among these two lineages. Taken together with our recent investigations, it is proposed here that during vertebrate evolution the Gli3 expression control acquired multiple, independently acting, intronic enhancers for spatiotemporal patterning of CNS, limbs, craniofacial structures and internal organs.
Рисунки к статье
|
Формирование раннего эмбрионального паттерна регулируется за счет взаимодействия сложных сигнальных сетей. Функциональные соединения между сигнальными молекулами определенного пути передачи сигналов осуществляется на многих уровнях, включая взаимодействие внеклеточных сигнальных молекул с их рецепторами, важные сигналы от рецепторов в ядро или интерпретация сигналов за счет активации или репрессии генов мишеней с помощью транскрипционных факторов. У человека нарушения этих взаимодействий на любом уровне могут приводить к болезням, включая врожденные дефекты и рак. Путь передачи сигналов Hedgehog (HH) впервые выявлен у Drosophila, он играет жизненно важную роль в органогенезе и дифференцировке во многих различных структурах позвоночных, включая нервную систему, конечности, скелет, легкие, кишечник и мочеполовую систему (Anderson et al. 2012). У позвоночных секретируемые гликопротеины sonic hedgehog (SHH), Indian hedgehog (IHH) и desert hedgehog (DHH), кодируются генами паралогами, действуют как морфогены, запускающие вереницу реакций в клетках мишенях, приводя в результате к активации или репрессии нижестоящих генов мишеней, преимущественно с помощью семейства GLI транскрипционных факторов (GLI1, GLI2 и GLI3) (Abbasi et al. 2009).
Транскрипционный фактор цинковые пальчики GLI3, подобно своим паралогам GLI1 и GLI2, действует как первичных трансдуктор передачи сигналов SHH в контексте, зависимом от комбинаторного режима (Ruiz i Altaba et al. 2003). GLI3 и GLI2 могут служить в качестве транскрипционных активаторов или репрессоров, тогда как GLI1, чья экспрессия транскрипционно регулируется с помощью GLI2 и GLI3, по-видимому, играет вторичную роль в усилении SHH реакции (Ding et al. 1998; Motoyama et al. 1998; Bai & Joyner 2001; Bai et al. 2002).
Мутации в гене GLI3 вызывают разнообразные доминантные онтогенетические дефекты, синдромы, обозначаемые термином "GLI3 морфопатии" (Radhakrishna et al. 1999), включая Greig cephalopolysyndactyly syndrome (GCPS) (Vortkamp et al. 1991; Wild et al. 1997; Kalff-Suske et al. 1999), Pallister-Hall syndrome (PHS) (Kang et al. 1997b), postaxial polydactyly type A (PAPA) (Radhakrishna et al. 1997), и preaxial polydactyly type IV (PPD-IV) (Radhakrishna et al. 1999). Мутации, затрагивающие Gli3 мыши, такие как extra toes (Xt), anterior digit deformity (add), и polydactyly Nagoya (Pdn), служат в качестве моделей GLI3 морфопатий (Pohl et al. 1990; Schimmang et al. 1992, 1994; Hui & Joyner 1993). Все GLI3 морфопатии обнаруживают пороки развития в аутоподе, т.e. полидактилии или синдактилии. Кроме того, черепно-лицевые аномалии ассоциированные с GCPS, и при большинстве тяжелых форм PHS, появляются и др. пороки развития, такие как гипоталамическая hamartoma, висцеральные аномалии, атрезия ануса, дефекты надгортанника и гортани (Biesecker & Ondrey 1998). Эмбрионы мыши с гомозиготными делециями Gli3 обнаруживают плейотропные и летальные врожденные аномалии с четкими преаксиальными полидактилиями конечностей (Schimmang et al. 1992; Hui & Joyner 1993).
Масса исследований на мышах и д. модельных организмах подтвердили, что GLI-код, взаимодействие GLI белков, экспрессируемых в виде количественного и временного тонко настроенного паттерна в соседних доменах, представляют собой основной морфогенетический инструмент, который используется беспрестанно в эмбриональном развитии. Это применима к формированию паттерна вдоль передне-задней оси (Brewster et al. 2000), индукции склеротома (Buttitta et al. 2003), морфогенезу нервной трубки (Persson et al. 2002; Wijgerde et al. 2002; Ruiz i Altaba et al. 2003), прозэнцефалона (Rallu et al. 2002) и мозжечка (Corrales et al. 2004), для формирования передне-заднего паттерна конечностей (Robert & Lallemand 2006), дифференцировки хондроциов (Koziel et al. 2005), формирования скелетных мышц (McDermott et al. 2005) и развития простаты (Pu et al. 2004). Эти множественные цели требуют тонкого временного и пространственного контроля экспрессии генов Gli.
Ранее мы идентифицировали ряд древних регуляторных элементов генов, контролирующих экспрессию гена GLI3 человека. Одиннадцать интронных Fugu-human conserved noncoding elements (CNEs) из интронов GLI3 действуют во временно трансфицированных культивируемых клетках в клетках дикого типа с зависимости от способа как активаторы или репрессоры экспрессии репортерных генов (Abbasi et al. 2007, 2010; Paparidis et al. 2007). Путе экспрессии репортерных генов под контролем человеческих GLI3-CNEs у эмбрионов рыбок данио, мы продемонстрировали, что потенциал активации или репрессии CNEs, наблюдаемый в культуре клеток человека, сохраняется in vivo в костистых рыб. В значительно большей степени индуцировалась экспрессия репортеров с помощью этих элементов по сравнению с эндогенной экспрессией gli3 рыбок данио (Abbasi et al. 2007). Кроме того, мы использовали трансгенный подход, чтобы показать, что GLI3 интронные CNEs, которые способны активировать транскрипцию в клеточных культурах и у рыбок данио, могут индуцировать активацию гена репортера в местах эндогенной экспрессии Gli3 также у кур и мышей (Abbasi 2010). Для подхода с трансгенными мышами мы описали intra-GLI3 CNEs, вызывающие экспрессию трансгена во многих известных регионах транскрипции эндогенного Gli3 в зачатках конечностей, а также вдоль передне-задней и дорсо-вентральной осей развивающейся нервной трубки мышей (Paparidis et al. 2007; Abbasi 2010). Важно отметить, что помимо критической роли в развитии конечностей и нервной трубки мышиный Gli3, как известно, участвует во многих др. паттерн формирующих механизмах и сходным образом паттерн его экспрессии чрезвычайно сложен и хорошо определим, с вовлечением ряда клеток и типов тканей (иных, чем конечности и нервная трубка). Однако, цис-действующие последовательности элементов, регулирующие экспрессию GLI3 в эмбриональных тканях, иных, чем нервная трубка и конечности,ока не описаны (Abbasi et al. 2007, 2010; Paparidis et al. 2007; Alvarez-Medina et al. 2008; Abbasi 2011; Coy et al. 2011). Здесь мы использовали трансгенных мышей для тестирования ранее установленных GLI3 интронных CNEs в отношении их способности воздействовать на экспрессию репортерных генов в сайтах эндогенной экспрессии Gli3 в тканевых доменах иных, чем нервная трубка и конечности. Наши данные показали, что паттерны экспрессии репортерных генов, индуцируемые с помощью субнабора этих элементов воспроизводили в точности описанную эндогенную экспрессию Gli3 в черепно-лицевых структурах, глазах и в ряде внутренних органов. Сравнение паттерна экспрессии у мышей с данными по экспрессии у рыбок данио, полученных с теми же самыми CNEs (Abbasi et al. 2007) продемонстрировало, что помимо консервации последовательностей, специфичность сайтов мишеней, по крайней мере, некоторых из этих элементов сохраняется в течение 450 миллионов лет, когда костистые рыбы дивергировали от клона, ведущего к современным млекопитающим.
GLI3 expression pattern and functions during embryogenesis are highly complex and well defined
Мышиный Gli3 участвует в многочисленных паттерн-формирующих механизмах во время раннего эмбрионального развития и поэтому его паттерн экспрессии сложен и хорошо определен. Gli3 строго экспрессируется в дорсальной части всего региона головного мозга и также в клеточных популяциях в вентральных аспектах головного мозга и, как известно, играет ключевую роль не только в формировании дорсо-вентрального паттерна, но и также передне-заднего паттерна телэнцефалона, диэнцефалона, среднего мозга и заднего мозга (Matise et al. 1998; Aoto et al. 2002; Kuschel et al. 2003; Tyurina et al. 2005). В спинном мозге Gli3 функции необходимы для дифференцировки нормальных MN (motor neurons),для корректного формирования пространственного паттерна V0-V2 промежуточных нейронов (intermediate spinal cord) и для развития клеток вентральной пластинки нервной трубки и V3 промежуточных нейронов (ventral spinal cord) (Bai et al. 2004). Интересно, что хотя Gli3 экстенсивно экспрессируется в дорсальной части спинного мозга, не наблюдается ожидаемого фенотипа у Gli3 мутантов (Bai et al. 2004). Мышиный Gli3 экстенсивно экспрессируется в развивающейся лицевой мезенхиме и играет критическую функцию в максиллярных отростках, в развитии нёба и зубов (Mo et al. 1997; Hardcastle et al. 1998; Aoto et al. 2002). Более того, Gli3 функции необходимы также для нормального развития ушей (Hui & Joyner 1993). Gli3-/- эмбрионы обнаруживают разнообразные аномалии глаз от микрофталмии до отсутствия глазных тканей (Johnson 1967; Franz & Besecke 1991; Tyurina et al. 2005; Furimsky & Wallace 2006). Белок, экспрессируется в регионе стебля (stalk) зрительного поля, в нейральной сетчатке, пигментном эпителии сетчатки, хрусталике и поверхностной эктодерме (Aoto et al. 2002; Zaki et al. 2006). Внутри сомитов, экспрессия Gli3 первоначально широко распространена и быстро ограничивается дорсальной медиальной губой дермамиотома (DML, клетки предшественники для epaxial мускулатуры) и вентральной латеральной губой дермамиотома (VLL, клетки предшественники для hypaxial мышц), (McDermott et al. 2005). Gli2/Gli3 двойные мутанты обнаруживают разнообразные дефекты передней кишки от атрезии пищевода, трахео-пищеводных фистул, тяжелых нарушений легких, меньших, чем в норме печеночного и панкреатического зачатка до полного отсутствия лёгких, трахей и пищевода (Motoyama et al. 1998). В согласии с этими генетическими исследованиями у мышей у некоторых пациентов с синдромом Pallister-Hall, встречаются уродства передней кишки, включая дефекты образования долек лёгких, стеноз трахей и трахейно-пищеводные фистулы (Verloes et al. 1995; Kang et al. 1997a). Более того, Gli3 участвует также в нормальном развитии желудка (Kim et al. 2005), др. производного передней кишки. Эти данные подтверждают ключевую роль Gli3 в нормальном развитии в некоторых производных переденей кишки. Человеческий GLI3, как было установлено, также играет роль в нормальном развитии гипофиза(Kang et al. 1997a). Gli3 мутации, как было установлено, вызывают дисплазию и аплазию почек у людей и мышей (Kang et al. 1997a; Bose et al. 2002), и сходным образом её мРНК выявляется в эмбриональных урогенитальных структурах (Hu et al. 2006). Мышиный Gli3 , как было установлено, также играет критическую роль в развитии наружных гениталий и широко экспрессируется в них (Haraguchi et al. 2001). Генетические нарушения на мышах выявили важность функции Gli3 в нормальном развитии сосковой линии и сосковых плакод (Veltmaat et al. 2006), а с помощью иммуногистохимии белок Gli3 был локализован во всех зачатках молочных желез (Hatsell & Cowin 2006). GLI3 ассоциирует с доминантным генетическим нарушением Greig cephalopolysyndactyly syndrome (GCPS) м мышиным mutant extra-toes (Xt), демонстрируя критическую роль этого гена в развитии конечностей (Vortkamp et al. 1991; Hui & Joyner 1993). Последующие исследования на мышах выявили множественные функции Gli3 в формировании паттерна и морфогенезе конечностей.
Отражением этих сложных ролей Gli3 в раннем эмбриогенезе мышей являются и эволюционно законсервированные роли GLI3, ассоциированные с цис-регуляторным контролем у человека почти весь известный репертуар эндогенной экспрессии Gli3 в нервной трубке и конечностях (Abbasi et al. 2007, 2010; Paparidis et al. 2007; Alvarez-Medina et al. 2008; Coy et al. 2011). Однако, генетические механизмы, контролирующие экспрессию GLI3 в тканях иных, чем головной мозг и конечности, таких черепно-лицевые структуры и внутренние органы, неизвестны и были исследованы в данной работе.
Cis-regulatory underpinnings for GLI3 expression in craniofacial structures
В соответствии с ролью Gli3 в нормальном развитии черепно-лицевых структур и с его распространенной экспрессией здесь, CNE1, как было установлено, управляет экспрессией в ряде лицевых доменов, включая носовые отростки, производные материала бранхиальных дуг, включая максиллярный и мандибулярный компоненты челюстей и хрящ Meckel's. Более того, в ротовой полости CNE1 воспроизводит функцию Gli3 в развитии нёба и зубов.
Помимо конечностей, CNE6 управляет экспрессией трансгена на ранних стадиях развития (вплоть до ст. E10.5) внутри ростро-вентрального домена телэнцефалона. На ст. E11.5 строгая lacZ активность наблюдалась в лицевой области в предхрящевых зачатках носовой перегородки. Этот пространственный сдвиг в экспрессии трансгена в ранней ростро-вентральной части телэнцефалона в лицевую область согласуется с наблюдением, что мезенхимные клетки в последней области происходят из мигрирующих клеток нервного гребня из переднего мозга (Noden 1983; Couly et al. 1998). Даже с помощью как CNE1, так и CNE6 управляемой экспрессии репортера в носовой системе, интересно, что гистологический анализ выявил разделение их сайтов мишеней, т.е., CNE1 индуцированная активность репортера специфична для носовой капсулы, тогда как CNE6 активен внутри носовой перегородки (compare reporter expression in Fig. 2E,L).
Cis-regulatory control of GLI3 expression in several internal organs, mammary placodes, eye and external genitalia
В соответствии с функциями Gli3 в развитии передней кишки (Motoyama et al. 1998), CNE10 цис-регион, как было установлено, управляет экспрессией трансгена в некоторых производных передней кишки, влючая глотку, пищевод, трахейные каналы, печень желчный пузырь, зачаток панкреатической железы, а также вдоль стенки желудка и в просвете двенадцатиперстной кишки (Fig. 4). Активность CNE10 также совпадает с функцией Gli3 и его экспрессией внутри эмбриональных урогенитальных структур (Schimmang et al. 1992). Gli3, как было установлено, экспрессируется внутри нескольких структур глаза (Aoto et al. 2002; Zaki et al. 2006), в соответствии с этим на ст. E11.5 CNE10 управляет экспрессией lacZ в сенсорном слое сетчатки, на ст. E12.5 экспрессия внутри глаз становится более распространенной. Этот элемент также обнаруживает активность внутри презумптивного региона, форматирующего гипофиз (Rathke's pouch). В соответствие с этой локализацией мышиная Gli3 мРНК экспрессируется во всех зачатках молочных желез и в наружных гениталиях (Hatsell & Cowin 2006), CNE10 строго индуцирует экспрессию репортера в этих тканях.
Cis-region reside within intron-13 of GLI3 regulates a subset of its known expression in developing somites
Внутри сомитов экспрессия Gli3 широко распространена и, как известно, играет жизненно важную роль в формировании epaxial и hypaxial миотомов (McDermott et al. 2005). В соответствии с известными ролями имеется цис-регуляторная область внутри интрона-13 в GLI3 повышающая активность экспрессии репортера специфически внутри вентрально-латеральной губы дермомиотома (Fig. 5C). Остальные аспекты эндогенной экспрессии Gli3 в сомитах не воспроизводятся с помощью этого энхансера, указывая тем самым, что на важность нормального геномного контекста в определении полного репертуара функции энхансера или альтернативно др. неизвестные цис-регионы могут работать сочетанно с CNE9, чтобы обеспечить полный набор функций Gli3 в развивающихся сомитах.
Intra-GLI3 enhancers depicts the preservation and divergence of target site specificity during the course of vertebrate evolution
Ранее мы проанализировали 10 независимых CNEs у эмбрионов рыбок данио (Abbasi et al. 2007). 7 из этих intra-GLI3 CNEs, включая CNE1, 2, 9, 10 не только воспроизводили весь известный репертуар gli3 у рыбок данио, но и также обнаруживали значительное функциональное перекрывание в отношении места экспрессии (Abbasi et al. 2007). Напротив, сходный субнабор CNEs (CNE1, 2, 9, 6, 11 10) от мышей показал, что множественные независимы энхансеры контролируют экспрессию Gli3 в самостоятельных онтогенетических доменах, в основном не перекрывающимся способом. Кроме того,сравнительные данные по мышам и рыбкам показали, что некоторые из этих родоначальных энхансеров дивергировали в отношении эмбриональных доменов мишеней, в которых они контролируют экспрессию у каждого из этих животных, тогда как др. сохраняют специфичность своего действия, по крайней мере, частично. Напр., у рыбок данио CNE1 и CNE9 управляют экспрессией репортера преимущественно в субпопуляциях нейронов головного мозга и спинного мозга, и сходным образом эти элементы были высоко активны в нервной трубке мышей (Abbasi et al. 2007, 2010). Специфичная для переднего мозга регуляторная функция ultra-conserved элемента, CNE2, по-видимому, исключительно законсервирована у ветви рыб и тетрапод (Paparidis et al. 2007).
Наиболее характерным местом активности CNE10 у рыбок данио были различные подразделы глаз. Кроме того, он также индуцировал экспрессию репортера в зачатке нижней челюсти (Abbasi et al. 2007). У мышей функции того же самого элемента, по-видимому, законсервированы в отношении глаз (Fig. 4); однако, CNE10 оказался неспособны обнаруживать активность в области мандибулярной дуги эмбрионов мыши. Более того, CNE10 управляет экспрессией репортера в некоторых производных передней кишки и мочеполовых структурах развивающихся эмбрионов мышей, но экспрессии репортера не наблюдалось в соотв. структурах эмбрионов рыбок данио (Abbasi et al. 2007).
Эти находки демонстрируют, что даже если Gli3 у рыб и млекопитающих обладает эволюционно законсервированными множественными элементами из некодирующих последовательностей, действующими как цис-регуляторы, функции этого древнего "gene regulatory catalogue" могут дивергировать на двух уровнях: у млекопитающих эти цис-регуляторы достигают наивысшего уровня функционального модульного принципа построения за счет устранения потенциала для контроля перекрывающейся экспрессии: во-вторых, чтобы справиться с различными онтогенетическими и анатомическими нуждами у рыб и млекопитающих специфичность к сайтам мишеням некоторых из этих элементов дивергирует значительно в двух этих ветвях. Такого типа функциональная дифференцировка может быть достигнута или путем изменений в общей протяженности энхансеров или путем введения оборота мест связывания транскрипционных факторов.
Conclusions
Taken together with our previous reports, we defined a complex cis-regulatory landscape for GLI3, an important downstream effector of Hh signaling cascade. Cis-regulatory repertoire of GLI3 seems to be docked largely inside the intronic intervals of this gene and this arrangement remained preserved since the divergence of tetrapod and teleost lineages 450 million years ago. We showed that this ancient catalogue of cis-acting sites controlling GLI3 expression at almost all known sites of its endogenous activity, that is, neural tube, limbs, craniofacial structures, eyes, internal organs, mammary buds and in the external genitalia. Considerable functional redundancy was observed among the activity of these elements in zebrafish, whereas in mice, higher level of functional modularity was seen; multiple elements controlling expression independently in multiple tissues largely in a non-redundant fashion. This higher modularity signals the reduced pleiotropic effects of mutational events and thus implicates cis-acting sites crucial for developmental and morphological evolution. In addition these cis-regulatory elements will help in understanding the genetic basis of those potential GLI3 associated human birth defects, which cannot be attributed to a mutation in coding sequence of this gene. In such cases these enhancers can be searched for those mutations that can potentially affect the space and time availability of GLI3 transcript during embryogenesis.
|