Посещений:
ГЕПАРАН СУЛЬФАТ ПРОТЕОГЛИКАНЫ



В развитии позвоночных

Heparan sulfate proteoglycans: a sugar code for vertebrate development?
Fabienne E. Poulain, H. Joseph Yost
Development 2015 142: 3456-3467; doi: 10.1242/dev.098178

Heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) have long been implicated in a wide range of cell-cell signaling and cell-matrix interactions, both in vitro and in vivo in invertebrate models. Although many of the genes that encode HSPG core proteins and the biosynthetic enzymes that generate and modify HSPG sugar chains have not yet been analyzed by genetics in vertebrates, recent studies have shown that HSPGs do indeed mediate a wide range of functions in early vertebrate development, for example during left-right patterning and in cardiovascular and neural development. Here, we provide a comprehensive overview of the various roles of HSPGs in these systems and explore the concept of an instructive heparan sulfate sugar code for modulating vertebrate development.


Рисунки к статье

Развитие позвоночных - это сложный процесс, управляемый многими сигнальными путями. Генерация различных типов клеток и органов из одиночной клетки достигается посредством последовательных онтогенетических программ, необходимых для пространственной и временной координации онтогенетических сигнальных молекул, включая морфогены и ростовые факторы. Большинство, если не все эти онтогенетические факторы регулируются с помощью heparan sulfate proteoglycans (HSPGs).
HSPGs представлены стержневым белком, к которому ковалентно прикреплены длинные линейный цепочки гликозаминогликана heparan sulfate (HS) . Syndecans (Sdc) и glypicans (Gpc), которые находятся среди основных классов стержневых белков, закреплены на клеточной поверхности с помощью трансмембранного домена или glycosylphosphatidylinositol якоря, соотв., и могут быть высвобождены во внеклеточное пространство после расщепления с помощью разных энзимов (Fig. 1). Др. HSPGs, включая agrin, collagen XVIII и perlecan, непосредственно секретируются во внеклеточный матрикс (ECM). Стержневые белки имеют специфические количества сайтов для добавления HS цепочек, а некоторые также и обладают chondroitin sulfate (CS) др. типом гликозаминогликанов (Table S1). Цепочки HS синтезируются в аппарате Гольджи с помощью многоступенчатого процесса, использующего несколько энзимов (Fig. 2; Table S2). Энзимы Exostosin (Ext) удлиняют цепочки HS путем добавления чередующихся глюкуроновых кислот и N-acetylglucosamine остатков, тогда как энзимы N-deacetylase/N-sulfotransferase (Ndst), C5 epimerase и 2-O-, 3-O- and 6-O-sulfotransferases модифицируют их, катализируя деацетилирование, эпимеризацию и сульфатирование в разных позициях (о номенклатуре, см. Lawrence et al., 2008). Эти модификации не появляются униформно вдоль цепочек HS, но вместо этого концентрируются на разных субрегионах, создавая домены с разными модифицированными дисахаридами, которые взаимодействуют с др. белками определенным образом.

Fig. 1. Examples of key cell surface and extracellular HSPGs.

Fig. 2. The synthesis of heparan sulfate chains.

Принимая во внимание из разные HS цепочки и локализацию (тe. на клеточной поверхности или на), HSPGs, как полагают, регулируют сигнальные пути многими разными способами (Fig. 3). Они могут действовать клеточно автономно как рецепторы или ко-рецепторы [напр., во время передачи сигналов Wnt или fibroblast growth factor (FGF)], как 'вербовщики' липидных платформ (увеличивая тем самым концентрацию лигандов или рецепторов на клеточной поверхности), путем регуляции переноса рецепторов через мембрану (во время эндоцитоза) или путем контроля секреции лиганда. Они могут также действовать клеточно не автономно как непосредственные сигналы или путем контроля распределения градиентов сигналов, а также состава ECM. Помимо сложности их сигнальных функций, HSPGs могут взаимодействовать с белками посредством разных механизмов (rev. Lindahl and Li, 2009; Xu and Esko, 2014). Соединение с белками обычно обеспечивается HS цепочками, но некоторые факторы, такие как Hedgehog (Hh), как было установлено, непосредственно взаимодействуют со стержневыми белками (Capurro et al., 2008). В то время как некоторые взаимодействия нуждаются в специфических структурных мотивах вместе с HS цепочками (Thunberg et al., 1982; de Paz et al., 2007), др. оказываются неизбирательными в терминах мотивов, но нуждаются в определенном типе сульфатирования (напр., 2-O-сульфатирование существенно для соединения с Fgf2; Ashikari-Hada et al., 2004) или определенной плотности негативного заряда. Интересно, что было продемонстрировано, что определенные органы и ткани продуцируют HS с уникальным составом, и что экспрессия HS эпитопов изменяется во время эмбрионального развития ткане-специфическим способом (Allen and Rapraeger, 2003; Ledin et al., 2004). Это наблюдение вместе с огромной вариабельностью HS цепочек, которые могут быть сгенерированы с помощью HS-модифицирующих энзимов, привели к гипотезе о сложном 'сахарном коде' (Holt and Dickson, 2005), согласно которой специфические модификации HS присутствуют в виде регион-специфических структур у эмбриона и могут контролировать онтогенетические программы путем взаимодействия с и модулирования определенных сигнальных путей. Этот сахарный код д. зависеть от пространственной и временной регуляции HS-модифицирующих энзимов и вообще от разных членов одного и того же семейства HS-модифицирующих энзимов, имеющих слегка отличающиеся активности или особенности действия. Напр., некоторые члены семейства 3-O-sulfotransferase могут обладать большей или меньшей склонностью продуцировать модификации по соседству с др. метками сульфатирования, изменяя как конфигурацию меток сульфатирования, так и плотность заряда в определенных регионах HS цепи. Сахарный код может быть динамичным, поскольку HS цепочки могут деградировать или модифицироваться на клеточной поверхности с помощью энзимов heparanase и sulfatase, соотв.

Fig. 3. The regulation of cell signaling pathways by HSPGs.

Хотя исследования на Caenorhabditis elegans строго подтверждают гипотезу сахарного кода (B?low et al., 2008; Tecle et al., 2013; D?az-Balzac et al., 2014), доказательства специфических ролей для HS модификаций и стержневых белков у позвоночных только начинают появляться. Несмотря на это, накапливаются данные, четко указывающие, что HSPGs обладают определенными инструктивными ролями во время развития позвоночных. Напр., исследования показали, что многие органы, включая гематопоэтическую и скелетно-мышечную системы, печеньо, легкие и почки собственно не формируются, если HSPGs отсутствуют или модифицированы (Tables S1, S2; for reviews, see Thompson et al., 2010; Huegel et al., 2013; Nigam and Bush, 2014). Такие исследования были проведены на разных модельных организмах, включая мышей, рыбок данио и Xenopus, однако, необходимо отметить, что имеет место некоторое расхождение в результатах , вообще-то благодаря техническим затруднениям по оценке функции HSPG in vivo (see Box 1).

Box 1. Analyzing HSPG functions in development: approaches and challenges The functions of HSPGs in development have been assessed using various approaches, including targeted mutants in mice, genetic mutants in zebrafish and morpholino (MO) knockdowns in zebrafish and Xenopus. However, a growing challenge in the field is to reconcile the disparity among the phenotypes generated by these different methods (Tables S1, S2). In the absence of genetic mutants, the roles of HSPGs in zebrafish have mostly been assessed based on MO phenotypes, and these studies have provided some interesting insights into the specific roles of HSPG core proteins and biosynthetic enzymes in embryonic morphogenesis. There are, however, increasing concerns about potential MO artifacts and the possibility that mutants can be functionally compensated by other family members or other regulatory events (Kok et al., 2015;Stainier et al., 2015). As such, conclusions from MO-based studies await confirmation by engineered mutants in zebrafish. It is also somewhat surprising that mutants for some of the core protein genes, such as sdc2 or gpc5, have not yet been reported in mice, and that mutations in the same gene (for instance gpc4) cause drastically different phenotypes in mice versus zebrafish orXenopus. It is thus likely that a fuller understanding of HSPG functions will require the combination of multiple mutants, transgenic and other techniques to test lineage-specific roles of HSPG core proteins and biosynthetic pathways in vertebrate development.


Roles for HSPGs in early development


Первой стадией развития после оплодотворения яйца (включая дробление клеток, гаструляцию и формирование паттерна) является становление разных осей тела и общей архитектуры эмбриона. Исследования мутантов с дефектами по генам, кодирующим HSPG биосинтетические энзимы, продвинуло наше знание, что сахарные цепочки HS регулируют многие ступени в ходе этих ранних онтогенетических процессов (Fig. 4A). Полимеризация HS цепочек, как было установлено, является критической для формирования паттерна и ранних онтогенетических функций. Гомозиготные нокаутные (KO) мутанты по Ext1 или Ext2 у мышей являются эмбриональными леталями, обнаруживающими дефекты гаструляции (Lin et al., 2000; Mitchell et al., 2001; Stickens et al., 2005; Shimokawa et al., 2011). У рыбок данио ext2 (dackel) или extl3 (boxer) мутанты осуществляют нормальную гаструляцию благодаря материнскому вкладу обоих энзимов, но имеют дефекты позднего развития хрящей и конечностей и обнаружение нарушений в передаче сигналов FGF, Wnt и Shh (Grandel et al., 2000; Norton et al., 2005; Cl?ment et al., 2008; Holmborn et al., 2012). Модификации HS цепочек также, по-видимому, важны, т.к. отсутствие Ndst1 и Ndst2, кодирующих энзимы, катализирующие деацетилирование HS и N-сульфатирование, являются эмбриональными леталями у мышей (Grobe et al., 2002), а epiboly нарушена у эмбрионов рыбок данио, которым инъецировали morpholinos (MOs) против hs2st, который кодирует sulfotransferase, которая добавляет сульфаты в C2 позиции остатков hexuronic кислоты вдоль HS цепи (Cadwalader et al., 2012). Интересно, что др. описанные мутанты по HS-модифицирующим энзимам обнаруживают только поздние дефекты развития (Table S2), подтверждая функциональное перекрывание между членами многих семейств генов, которые могут вносить вклад в специфические биохимические ступени синтеза HSPG. Анализируя комбинации мутантов можно будет установить ранние онтогенетические функции HSPGs.

Fig. 4. Functions of HSPGs in early development.

Изучение мутаций, вызывающих дефекты в индивидуальных стержневых белках также предоставляет доказательства роли в раннем развитии HSPGs. У рыбок данио gpc4 (knypek) мутанты обнаруживают дефекты в Wnt11-зависимых клеточных движениях, ведущих к конвергенции и удлинению во время гаструляции, подтверждая, что усиление передачи сигналов Wnt11 зависит от функции HSPG (Topczewski et al., 2001). Дефекты гаструляции и задней элонгации наблюдаются также у эмбрионов Xenopus, лишенных или избыточно экспрессирующих gpc4 (Ohkawara et al., 2003). Напротив, Gpc4 KO мутанты у мышей развиваются нормально и обнаруживают лишь поздние дефекты в формировании синапсов нейронов (Allen et al., 2012). Др. описанные мутанты стержневых белков обнаруживают дефекты с поздним началом в развитии (Table S1), включая широкий диапазон специфических дефектов развития нервов, которые часто приводят к перинатальной гибели.

Roles for HSPGs in left-right patterning


Kupffer's vesicle (KV) - это реснитчатый орган, который контролирует формирование лево-правостороннего паттерна (LR) у эмбрионов рыбок данио. Во время нормального развития клетки KV мигрируют и подвергаются мезодермально-эпителиальному переходу, чтобы сформировать пузырек. Как только пузырек раздувается, то каждая клетка KV отращивает специализированную апикальную ресничку, которая подвижна и перемещает асимметрично жидкость в KV, устанавливая тем самым формирование LR паттерна всего эмбриона. Ряд исследований продемонстрировал роль HSPGs во время этого процесса (Fig. 4B).
Клон-специфическое воздействие sdc2 на KV клетки рыбок данио с помощью MOs приводило к нарушению морфогенеза KV и укорочению ресничек, приводя к изменению формирования LR паттерна во всем эмбрионе (Arrington et al., 2013). Нокдаун sdc2 у целых эмбрионов также вызывает поздние дефекты васкулогенеза (Chen et al., 2004). Роли HSPGs в LR формировании паттерна также была оценена у эмбрионов Xenopus, которые обладали способностью идентифицировать и воздействовать целенаправленно на клеточные клоны более точно с помощью микроинъекций. Напр., клон-специфичная экспрессия доминантно-негативной мутантной изоформы Sdc2 с помощью целенаправленной инъекции мРНК в индивидуальные клетки Xenopus приводило к дефектам формирования LR паттерна (Kramer and Yost, 2002). Поразительно, доминантно-негативные изоформы Sdc2, включая phosphomimetic и phosphodeficient формы, имеющие измененные сайты фосфорилирования в цитоплазматическом домене стержневого белка, показали, что нормальное формирование паттерна LR нуждается в нефосфорилированном Sdc2 слева и в protein kinase C gamma (PKCγ)-зависимом фосфорилировании Sdc2 на правой стороне эмбриона (Kramer et al., 2002). Это указывает на на роль в развитии асимметричного фосфорилирования Sdc2 для формирования паттерна LR. Однако, возможно, что обе доминантно-негативные конструкции и MOs затрагивают больше, чем только Sdc2; доминантно-негативный Sdc2 может, напр., разрушать комплекс, образуемый с помощью Sdc2 и Sdc4. Поэтому важно подтвердить эти наблюдения, используя комбинации мутаций семейства Sdc.
Модификации HS цепочек, катализируемые с помощью 3-O-sulfotransferases (кодируемых генами Hs3st) также участвуют в формировании паттерна LR. Базирующийся на MO клон-специфический таргетинг hs3st1l2 (известен также как ashs3st5) и hs3st3l (известен также как hs3st6) в KV рыбок данио приводило к нормальному морфогенезу KV, но вызывало дефекты формирования LR паттерна, возникающих из-за определенных пертурбаций в длине ресничек в KV и их подвижности (Neugebauer et al., 2013). Эти исследования также показали участие модификаций с помощью 3-O-sulfotransferase в регуляции Fgf8 и др. клеточных сигнальных путей. Немногие др. мутанты были описаны для семейства Hs3st, хотя необходимо отметить, что нокауты Hs3st1 у мышей обнаруживали незначительную задержку внутриутробного роста в зависимости от фона (Shworak et al., 2002; HajMohammadi et al., 2003).

HSPG functions in cardiovascular development


Установлена и роль стержневых белков, как и модификаций HS в развитии сердечно-сосудистой системы. Во время раннего органогенеза, мезодермальный клон, который дает сердце и мезодерма кишки присутсвуют на латеральных краях эмбрионов позвоночных и мигрируют в направлении срединной линии эмбриона, сливаясь, чтобы сформировать кардиальную и кишечную трубки, соотв. MO-обусловленный клон-специфический нокдаун sdc2 рыбок данио выявил роль HSPG стержневого белка в клеточно не автономной регуляции образования ECM, который необходим для миграции кардиальной и кишечной мезодермы. В частности, разрушение функции sdc2 в клетках эмбрионального желтка приводит к нарушениям образования ECM по всему эмбриону и затрудняет миграцию кардиальных и кишечных клеток предшественников, приводя к cardia bifida (двум отдельным сердечным трубкам) и расщеплению кишечной трубки (Arrington and Yost, 2009). Среди др. стержневых белков, только Gpc3 и Perlecan (Hspg2 - Zebrafish Information Network) обнаруживают подобное участие в развитии сердца. ВПС, включая дефекты межжелудочковой перегородки или двойной выход из правого желудочка, были описаны у мышей, лишенных Gpc3 и, как полагают, возникали из-за нарушений передачи сигналов Shh в сердце (Ng et al., 2009). Perlecan-дефицитные мыши обнаруживали др. фенотип, характеризующийся уродствами кардиального тракта оттока (Costell et al., 2002).
Важная информация о роли HS цепей в сердечно-сосудистом развитии получена при анализе Ndst1 KO мышей, которые обнаруживали некоторые дефекты сердца, напоминающие те, что наблюдались при отсутствии Gpc3 (Pan et al., 2014). Передача сигналов FGF также сильно снижена у Ndst1 KO мышей, и нарушенная функция Fgf8, по-видимому, вносит вклад в их фенотип. Кондиционная делеция Ndst1 в клетках нервного гребня на системном Ndst2-дефицитном фоне также подтвердила важность функции HS в клоне клеток нервного гребня, которые мигрируют в развивающуюся сердечную трубку во время нормального развития сердца, и подтвердило, по крайней мере, частично компенсаторную роль у членов семейства Ndst. Функции др. модификаций HS цепочек в сердечно-сосудистом развитии трудно определимы. Мыши, лишенные C5-epimerase или Hs2st, погибают перед рождением и обнаруживают тяжелые дефекты развития (Table S2). Более того, описаны различные фенотипические отклонения у мышей, лишенных Hs6st1 (Pratt et al., 2006; Habuchi et al., 2007; Izvolsky et al., 2008), тогда как двойные Hs6st1 и Hs6st2 мутанты имели более тяжелые фенотипы и эмбриональную гибель (Conway et al., 2011b), указывая на определенный уровень функционального перекрывания между членами семейства 6-O-sulfotransferase. Эмбрионы рыбок данио, которым инъецировали MOs против 3-O-sulfotransferase hs3st7 (hs3st1l1) обнаруживали нормальное формирование паттерна LR и раннего развития, но обнаруживали дефекты в сократимости желудочков сердца. Дефекты сократимости миокарда могут быть устранены с помощью экспрессии трансгена hs3st7 в ткани эндокарда, который выстилает кардиальную трубку, но не в миокарде, указывая, что регуляция сокращений миокарда с помощью hs3st7 является не клеточно автономной, а зависит от межклеточных сигналов. Поразительно, генетическое снижение передачи сигналов bone morphogenetic protein (BMP) в сердце также восстанавливает сокращения inhs3st7 морфантов (Samson et al., 2013). Итак, эти результаты подтверждают, что разные члены семейства Hs3st контролируют разные ступени и вообще отличаются путями передачи сигналов в клетках во время развития сердца.

Roles for HSPGs during nervous system development


Развитие нервной системы проходит через несколько ступеней, регулируемых большим разнообразием средовых факторов, таких как морфогены, сигналы наведения, ростовые факторы, адгезивные молекулы и компоненты ECM, распределение и/или функция которых по большей части контролируется с помощью HSPGs (Fig. 3). Хотя критическая роль синтеза HS в формировании нервной системы продемонстрирована ещё 10 лет тому назад, открыты новые функции модификаций HS , а также стержневых белков, подтверждая, что разнообразие этих молекул может составлять основу 'кода', регулирующего каждый аспект развития нервной системы инструктивным способом (Fig. 5).

Fig. 5. Functions of HSPGs in nervous system development.

Nervous system patterning


Во время своего раннего развития нервная трубка становится регионализованной на самостоятельные домены, которые дают основные структуры ЦНС. Критическая роль HSPGs в формировании паттерна головного мозга впервые была продемонстрирована у Nestin-cre; Ext1 кондиционно нокаутных (cKO) мышей (Nestin-cre; Ext1flox/flox), у которых синтез HS устранен в нейральных стволовых клетках (NSCs) и поэтому в трех клонах, происходящих з них: нейронах, астроцитах и олигодендроцитах (Inatani et al., 2003). Такие мыши погибали при рождении и обнаруживали тяжелые дефекты формирования паттерна, включая отсутствие мозжечка и отсутствие обонятельных луковиц. Интересно, что сходные фенотипы наблюдались у гипоморфных Fgf8 мутантов (Meyers et al., 1998) и у качающихся мышей с рецессивной мутацией в Wnt1 (Thomas et al., 1991). Анализ иммунореактивности Fgf8 и доменов экспрессии генов, стоящих ниже FGF, у Nestin-cre; Ext1flox/flox мышей показал расширение распределения и активности Fgf8 в отсутствие HS, подтверждая, что HSPGs регулируют формирование паттерна среднего и заднего мозга путем контроля уровней Fgf8 в окружении. Подтверждением этой гипотезы стало недавнее исследование, показавшее, что образование задне-переднего градиента FGF вдоль среднего мозга нарушается после воздействия heparitinase или heparin (Chen et al., 2009).
Дальнейшие исследования подтвердили, что модификации HS, по-видимому, существенны для формирования паттерна головного мозга. Мыши, лишенные N-deacetylase/N-sulfotransferase Ndst1, обнаруживают дефекты переднего мозга, включая гипоплазию головного мозга и отсутствие обонятельных луковиц (Grobe et al., 2005). Регулируемое удаление 6-O фрагмента из HS цепочки на клеточной поверхности также, по-видимому, важно, т.к. мыши, лишенные endosulfatase Sulf2 обнаруживают аномалии головного мозга, включая дефекты закрытия нервной трубки, увеличение вентрикулярной системы и гидроцефалия (хотя и с частичной пенетрантностью) (Kalus et al., 2009).
Недавно идентифицированы специфические стрежневые белки, участвующие в формировании паттерна нервной системы. Напр., мыши, лишенные Gpc1 не формируют большей части передних долей головного мозга, дефект возможно связан с агенезом мозжечка, наблюдаемым у Nestin-cre; Ext1 cKO мышей (Jen et al., 2009). Нокдаун gpc4 у Xenopus приводит к разным фенотипам, характеризующимися дефектами дорсальных частей переднего головного мозга и отсутствием закрытия передней части нервной трубки из-за нарушений передачи сигналов FGF (Galli et al., 2003). Дефекты закрытия нервно трубки наблюдаются также у Xenopus sdc4 морфантов, а генетические исследования взаимодействий подтвердили, что sdc4 и vangl2 действуют на пути Wnt/PCP , чтобы регулировать этот процесс (Mu?oz and Larra?n, 2006; Escobedo et al., 2013). Sdc4, как было установлено, также активирует передачу сигналов FGF/ERK и PKC , чтобы запускать нейральную индукцию (Kuriyama and Mayor, 2009).

Neurogenesis


Нейрогенез - это генерация и дифференцировка нейронов из NSCs - происходит преимущественно во время развития, но также продолжается в специфических регионах у взрослых, таких как обонятельные луковицы, ростральный миграторный поток, субгранулярная зона в dentate gyrus гиппокампа, или субвентрикулярная зона (SVZ), выстилающая желудочки. Нейрогенез регулируется с помощью нескольких морфогенов и ростовых факторов, включая Fgf2, который играет доминирующую роль (Guillemot and Zimmer, 2011) и нуждается в HS для своей активности. Соотв., пролиферация культивируемых кортикальных предшественников от Nestin-cre; Ext1 cKO мышей в ответ на Fgf2 драматически снижена по сравнению с предшественниками от мышей дикого типа (Inatani et al., 2003). Соотв. эти мутанты обнаруживают нарушения нейрогенеза, ведущие к уменьшению переднего головного мозга и сильному уменьшению толщины коры. Интересно, что сходный фенотип наблюдается в отсутствие Hs2st, подтверждая важную роль 2-O-сульфатирования в пролиферации NSC (McLaughlin et al., 2003; Pratt et al., 2006).
Специфические стержневые белки также играют существенную роль в нейрогенезе. Экспрессия perlecan увеличивается в ответ на Fgf2 (Mashayekhi et al., 2011), а мыши, лишенные perlecan (Hspg2 - Mouse Genome Informatics), обнаруживают снижение клеточной пролиферации, приводящее к микроцефалии с истонченными стенками головного мозга (Gir?s et al., 2007). Perlecan также необходим для поддержания NSCs, как размера популяции NSC, так и степени нейрогенеза, которые сильно снижаются в SVZ взрослых мышей, лишенных perlecan (Kerever et al., 2014). Среди ассоциированных с мембранами HSPGs, Gpc1, по-видимому, вносит вклад в регуляцию нейрогенеза. Мыши, лишенные Gpc1, обнаруживают уменьшение размеров головного мозга в результате снижения пролиферации (на 20%) на день эмбриогенеза (E) 8.5 - E9.5 (Jen et al., 2009). Это умеренный, но достоверный эффект, по-видимому, обусловлен редукцией передачи сигналов Fgf17 и может быть частично компенсирован с помощью Gpc4. Анализ компаундных мутантов (Gpc1 и gene-trap allele of Gpc4) в самом деле подтвердил, что Gpc1 и Gpc4 могут иметь перекрывающиеся функции в регуляции размера головного мозга (Jen et al., 2009). Gpc4 строго экспрессируется в вентрикулярной зоне телэнцефалона, а также в нейрогенных регионах взрослых мышей. Его способность соединяться с Fgf2 toq больше подтверждает возможную роль Gpc4 как модулятора передачи сигналов FGF во время нейрогенеза (Hagihara et al., 2000). Необходимы дополнительные исследования, чтобы протестировать вклад Gpc4, в качестве gene-trap аллеля Gpc4, как полагают, не полностью нулевого. Наконец, недавнее исследование подчеркнуло новую функцию для Sdc1 в нейрогенезе (Wang et al., 2012). Sdc1 экспрессируется на высоком уровне в предшественниках вентрикулярной зоны и в SVZ во время развития. Ингибирование его экспрессии с помощью электропортации коротких шпилечных РНК в матку снижает пролиферацию NPCs в ответ на Wnt и приводит к преждевременной дифференцировке. Интересно, что Sdc1 модулирует канонический Wnt путь, но, по-видимому, не регулирует FGF эффектор Erk1/2 (Mapk3/Mapk1) (Wang et al., 2012). Это находится в резком контрасте со способом действия используемым Gpc1 (Jen et al., 2009), подтверждая гипотезу, что разнообразие HSPGs может тонко контролировать регуляцию разных путей, контролирующих развитие нервной системы.

Neuronal migration


После нейрогенеза и приобретения качественных особенностей нейронами, индивидуальные пост-митотические нейроны мигрируют к месту своего финального функционального предназначения. Происходит несколько типов миграции в виде разных волн. Некоторые используют перемещение нейронов вдоль волокон радиальной глии, как напр., радиальная миграция новорожденных нейронов из вентрикулярной зоны, чтобы сформировать разные слои коры (Nadarajah and Parnavelas, 2002). Др. (напр., миграция нейронов в обонятельные луковицы) нейроны не используют глию в качестве каркаса и вместо этого мигрируют 'в цепочках' (Lois et al., 1996). HSPGs, по-видимому, используются для регуляции обоих типов миграции. Sdc3 в частности, по-видимому, играет важную роль в миграции нейронов у млекопитающих (Hienola et al., 2006; Bespalov et al., 2011). Мыши, лишенные Sdc3 имеют дезорганизованную ламинарную структуру своего кортекса благодаря нарушениям радиальной миграции вдоль глии. Миграция 'цепочкой' вдоль рострального миграторного тракта в направлении обонятельных лукоиц также нарушена. Оба дефекта, по-видимому, возникают из-за дефектной реакции нервных клеток на факторы, способствующие миграции, pleiotrophin и epidermal growth factor (EGF). Соотв. было показано, что эктодомен Sdc3 соединяется с pleiotrophin и рецептором EGF (EGFR), и что клетки переднего мозга, выделенные от Sdc3 KO мышей, обнаруживают снижение миграции в ответ на EGF и pleiotrophin in vitro (Hienola et al., 2006). Нуждается ли Sdc3 в своих HS цепочках, чтобы обеспечивать передачу сигналов pleiotrophin и EGF, предстоит определить. Недавно Sdc3 был идентифицирован как новый рецептор для glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) (Bespalov et al., 2011). GDNF соединяется с Sdc3 зависимым от HS образом и нуждается в Sdc3, чтобы обеспечивать миграцию кортикальных нейронов in vitro. Это наблюдение пересено in vivo : кортикальные GABAergic нейроны, как известно, мигрируют вдоль градиента GDNF из медиального ганглиолярного возвышения в направлении коры (Pozas and Ibanez, 2005) и не мигрируют у собственно мышей, лишенных Sdc3 (Bespalov et al., 2011).
Неожиданно, хотя ингибирование глобального синтеза HS у C. elegans с помощью RNAi против rib-1 ли rib-2 (гомологов Ext генов млекопитающих) нарушает миграцию нейронов (Pedersen et al., 2013), отсутствуют очевидные дефекты паттерна ламинирования коры или локализации популяций специфических нейронов [calbindin 2 (известен также как calretinin)-позитивных и Pou3f1 (известен также как Tst-1 и SCIP)-позитивных нейронов] у Nestin-cre; Ext1 cKO мышей (Inatani et al., 2003). Это подтверждает, что эффекты HSPGs на миграцию нейронов могут быть видо-специфическими или существуют компенсаторные механизмы у мышей.

Axon growth and guidance


Одновременно или последовательно к миграции нейроны испускают аксональные отростки в направлении своих будущих синаптических партнеров. Во время своей навигации аксоны наводятся на мишень с помощью многочисленных привлекающих и отталкивающих сигналов, которые действуют посредством непосредственных контактов или на расстоянии в окружении. Критическая роль HS во время нахождения аксонами пути известна давно. Основные наводящие сигналы, такие как Netrins, Slits и Ephrins, как было установлено, соединяются с HS с высоким сросдтвом (Serafini et al., 1994; Bennett et al., 1997; Hussain et al., 2006; Irie et al., 2008). Более того, добавление HS к развивающемуся ретинотектальному пути Xenopus или удаление HS с помощью heparitinase не позволяет ретинальным аксонам вступать в свою мишень в головном мозге, в тектум (Walz et al., 1997; Irie et al., 2002). Неудивительно, Nestin-cre; Ext1 cKO мыши, лишенные HS в нервной системе обнаруживают в основном дефекты наведения аксонов, включая отсутствие комиссуральных трактов и ошибки от ретинальных аксонов (Inatani et al., 2003). Сходным образом, ретинальные аксоны ошибочно проецируются в передний мозг, задний мозг и противоположный глаз у ext2; extl3 мутантов рыбок данио, которые также обнаруживают пониженные уровни HS (Lee et al., 2004). Неправильная сортировка ретинальных аксонов вдоль зрительного тракта также наблюдается у этих мутантов и выявляется важная функция HS в онтогенетической дегенерации аксонов (Poulain and Chien, 2013). В самом деле топографическая организация ретинальных аксонов вдоль тракта достигается посредством избирательной дегенерации неправильно отсортированных аксонов у животных дикого типа. Этот механизм коррекции требует присутствия HS в окружении и нарушен у ext2 мутантов.
Первое наблюдение, что разные HS-модифицирующие энзимы регулируют разные аспекты навигации аксонов получены на C. elegans которые составили основу гипотезы 'сахарного кода' (B?low and Hobert, 2004; B?low et al., 2008). C. elegans имеют по единственному ортологу разных HS-модифицирующих энзимов, это облегчает генетические манипуляции и анализ возникающих фенотипов: деацетилирование и N-сульфатирование катализируются с помощью HST-1, эпимеризация обеспечивается с помощью HSE-5, а 2-O, 3-O и 6-O сульфатирование осуществляются с помощью HST-2, HST-3.1 и HST-3.2 и HST-6. Интересно, что разные классы нейронов требуют активности HSE-5, HST-2 и HST-6 в разных комбинациях для корректнрого наведения своих аксонов. HST-3.1 и HST-3.2 регулируют более утонченные ступени морфогенеза, контролируя ветвление контекст-зависимым способом (Tecle et al., 2013; Gysi et al., 2013). У млекопитающих, однако, вклад специфических HS мотивов в наведение аксонов только в начале выявления. Подобно мышам Nestin-cre; Ext1 cKO, мутантные мыши с отсутствием Ndst1 обнаруживают отсутствие или гипоплазию передней и hippocampal комиссур (Grobe et al., 2005). Подтверждением гипотезы сахарного кода, является ретинальные аксоны мышей, лишенных Hs2st или Hs6st1, которые делают определенные ошибки в перекресте в результате нарушения реакций на Slit1 и Slit2 (Pratt et al., 2006; Conway et al., 2011a; Conway et al., 2011b). Сходным образом, навигация callosal аксонов в срединной линии по-разному нарушается в отсутствие Hs2st или Hs6st1 (Conway et al., 2011a; Conway et al., 2011b; Clegg et al., 2014). Интересно, что экспрессия Fgf8 увеличивается и приводит к строгой активации ERK в телэнцефалоне Hs6st1 KO мышей, но не у Hs2st мутантов. Кроме того, супрессия компонентов пути Fgf8/Erk улучшает фенотип мышей, лишенных Hs6st1, подтверждая, что Hs2st и Hs6st1 могут регулировать ведение callosal аксонов отличающимся молекулярно способом.
Хотя обнаруживаемые фенотипы в отсутствие HS строго подтверждают роль HSPGs в нахождении пути аксонами, очень мало известно о роли HSPG стержневых белков. Предпринято много исследований функции специфических стрежневых белков в наведении аксонов у Drosophila и C. elegans, в которых один Sdc и два Gpc гена были идентифицированы. Напр., было показано, что мутации в Sdc вызывают дефекты в ведении аксонов черех срединную линию благодаря нарушению передачи сигналов Slit/Robo (Johnson et al., 2004; Steigemann et al., 2004; Rhiner et al., 2005; Smart et al., 2011). Как Sdc, так и Gpc Dally-like необходимы для собственно нахождения аксонами пути и в функции в зрительной системе у Drosophila (Rawson et al., 2005). Наконец, Gpc lon-2 регулируют ведение двигательных аксонов у C. elegans (B?low et al., 2008). У позвоночных только одно недавнее исследование продемонстировало роль Gpc1 в обеспечении реакции отталкивания postcrossing аксонов на Shh в донной пластинке нервной трубки у эмбрионов кур (Wilson and Stoeckli, 2013).

Dendritogenesis


По мере роста аксонов нейроны образуют разветвленные дендритное древо, которое ответственно на получение интегрирующих и передаваемых сигналов от др. нейронов. Возникающая в результате морфология дендритов уникальна для каждого специфического класса нейронов и, как полагают, детерминируется средовыми и присущими клеткам факторами. Sdc2, как было установлено, регулирует образование дендритов в нейронах гиппокампа в культуре за счет взаимодействия с мультидоменовой адапторной молекулой Sarm1 и активирования пути JNK/MKK4 (Chen et al., 2011). Было бы интересно создать Sdc2 KO мышей и протестировать действительно ли Sdc2 обладает сходной ролью in vivo. Мало известно о роли др. HSPG стержневых белках или энзимах, синтезирующих HS в дендритогенезе.

Synaptogenesis


Синапсы являются специализированными адгезивными соединениями, способными к передаче информации между нейронами (в ЦНС) или между нейронами и мышцами (в neuromuscular junctions, NMJs). Нейротрансмиттеры высвобождаемые окончаниями пресинаптических аксонов в щель и связываемые их рецепторами на постсинаптических мембранах дендритов или мышечных волокон. В ЦНС пост-синаптические мембраны организуются у дендритов в небольшие выпячивания, называемые шипами. Эти шипы возникают из богатых актином тонких филоподиальных выпячиваний и развиваются в грибообразные или похожие на обрубки формы во время своего образования и созревания.
Роль HSPGs в синаптогенезе впервые продемонстрирована в NMJ почти 20 лет тому назад. показано, что HSPG agrin, назван благодаря своей способности индуцировать агрегацию nicotinic acetylcholine receptors (AChRs) на развивающихся скелетно-мышечных волокнах в культуре (Godfrey et al., 1984), секретируется из терминальных окончаний моторных аксонов и инициирует образование нейромышечных синапсов путем связывания и активирования рецепторной тирозин киназы Musk на мышечной поверхности (Glass et al., 1996). Мыши, лишенные agrin не формируют NMJs и погибают in utero (Gautam et al., 1996). Сходным образом, гомозиготные миссенс мутации в гене аргина были идентифицированы в случае синдрома врожденной миастении у людей, при которой аномалии нейромышечной передачи приводят к мышечной слабости, усиливающейся при упражнениях (Huz? et al., 2009). Кроме того, высокий уровень экспрессии в двигательных нейронах аргина определяется в ЦНС и было показано, что блокирование функции agrin в культивируемых нейронах гиппокампа приводит к аномальному образованию синапсов (Ferreira, 1999; Bose et al., 2000). Потеря синапсов также недавно была описана в коре трансгенных взрослых мышей, лишенных экспрессии agrin, повсюду кроме моторных нейронов, подтверждая роль agrin в формировании и/или поддержании синапсов в головном мозге (Ksiazek et al., 2007).
Исследование культивируемых нейронов гиппокампа также выявило роль Sdc2 в формировании дендритных шипов. Такая роль была подтверждена высокими уровнями экспрессии Sdc2 во время синаптогенеза в нервной системе, а идентификация синаптического белка Cask (calcium/CaM-dependent serine protein kinase) в качестве партнера, взаимодействующего с Sdc2 (Cohen et al., 1998;Hsueh et al., 1998). Избыточная экспрессия Sdc2 в нейронах гиппокампа крыс ускоряет развитие шипов, тогда как ингибирование его экспрессии предупреждает развитие дендритных выпячиваний (Ethell and Yamaguchi, 1999; Lin et al., 2007). Способность Sdc2 помогать формированию филоподий и синаптогенезу нуждается в разных доменах в его внутриклеточном регионе (Fig. 1). C1 домоен взаимодействует с neurofibromin, активирует PKA и способствует активности ENA/VASP , лежащей в основе образования филоподий (Lin et al., 2007). Фосфорилирование C1 домена с помощью EphB2 рецепторной тирозин киназы также необходимо для собирания в кластеры Sdc2 на дендритах и индукции дендритных шипов (Ethell et al., 2001). Регион C2, который содержит type II PDZ-связывающий мотив (остатки EFYA), который обеспечивает взаимодействия с несколькими адаптерными белками, такими как syntenin (Sdcbp), Cask, synbindin (Trappc4) и synectin (Gipc1), также необходим для функции Sdc2 в шипах. Однако, вклад HS цепочек в функционирование Sdc2, также ка и роль Sdc2 in vivo остаются неизвестны.
Помимо Sdc2, некоторые Gpcs, как было установлено, также участвуют в регуляции синаптогенеза. Два независимых исследования на грызунах и in vitro идентифицировали Gpcs (скорее всего, Gpc4) в качестве пресинаптических партнеров leucine-rich repeat transmembrane нейронального белка Lrrtm4, который располагается на постсинаптической мембране (de Wit et al., 2013; Siddiqui et al., 2013). Такое транс-синаптическое взаимодействие использует HS-зависимое связывание Gpc4 с пре-синаптической рецепторной protein tyrosine phosphatase PTPδ (Ko et al., 2015) и это необходимо для Lrrtm4, чтобы способствовать развитию возбуждающих синапсов. Кроме того, Gpc4 и Gpc6, как было установлено, секретируются астроцитами и способствуют образованию возбуждающих синапсов в клетках ретинальных ганглиев посредством образования кластеров glutamate рецепторов (Allen et al., 2012). Генерация и анализ мутантов для разных Gpc генов представляет большой интерес для оценки этих поразительных результатов in vivo.
Хотя функции различных стержневых белков обнаруживаются во время синаптогенеза, по крайней мере, in vitro роль модификаций HS цепочек плохо охарактеризована. HS обогащены в синапсах нейронов взрослых, а cKO мыши, лишенные Ext1 в пост-митотических нейронах обнаруживают изменение передачи в glutamatergic синапсах и обнаруживают многочисленные аутизм-подобные поведенческие дефекты (Irie et al., 2012). Ментальные нарушения и аутизм обнаруживают сходство у описанных пациентов с делеционными мутациями в EXT1 (Li et al., 2002), демонстрируя роль HS в синаптической и когнитивной функции. Интересно, что недавний скрининг, осуществленный у Drosophila обнаруживает разные эффекты Sulf1 и Hs6st на формирование синапсов и функцию NMJ (Dani et al., 2012): мутанты, лишенные Sulf1 или Hs6st обнаруживают повышенное количество синаптических бутонов, но обнаруживают поразительные противоположные отличия в силе нейротрансмиссии. Sulf1 и Hs6st, по-видимому, обладают сходной функцией в морфогенезе синапсов, но выполняют противоположные роли в синаптической функциональной дифференцировке. Кроме того, экспрессия на клеточной поверхности Gpc Dlp снижена в синапсах, лишенных Hs6st, тогда как Sdc и Dlp увеличиваются в отсутствие Sulf1. Эти изменения коррелируют с различиями в передаче через синапсы сигналов антероградных Wnt и ретроградных BMP, которые ответственны за пре- и постсинаптические дефекты молекулярной дифференцировки, наблюдаемые у мутантов. Отсутствие Sulf1 у млекопитающих также, по-видимому, нарушает синаптогенез (Kalus et al., 2009), т.к. нейроны гиппокампа, лишенные Sulf1 обладают пониженной плотностью дендритных шипов и измененной структурой синапсов с пониженными количествами синаптических пузырьков. Эти дефекты приводят к нарушению синаптической пластичности у взрослых Sulf1 KO мышей.

Future directions and implications for the sugar code hypothesis


HSPGs, как было установлено, в исследованиях клеточных культур регулируют широкий диапазон клеточных сигнальных путей, межклеточных взаимодействий, формирования ВКМ и клеточного поведения, влияющих на механизмы развития. Недавние исследования подтвердили, что HSPGs в самом деле играют главную роль, особенно в развитии in vivo.
Хотя анализ мутантов некоторых генов представил захватывающие результаты, большинство генов (включая главным образом семейство Hs3st) ещё не было протестировано (Tables S1, S2). Генетический функциональный анализ довольно сложен из-за частичного перекрывания функций, напр., внутри одного и того же семейства биосинтетических энзимов, между некоторыми членами семейства белков и вообще между разными стержневыми семействами. Хотя очевидно, что некоторые стержневые белки обладают разными функциями (Table S1), эти функции могут быть независимы от прикрепления HS к стержневым белкам. Напротив, можно предположить, что Sdc стержневой белок и Gpc стержневой белок могут быть способны осуществлять некоторые из одних и тех же функций до тех пор, пока они могут приобретать одни и те же модифицированные цепочки сахаров (сахарный код) и поставлять эту информацию на клеточную поверхность в определенных клеточных клонах во время развития. Сходным образом, вполне возможно множественные члены одного и того же семейства биосинтетических генов, напр., 7 или 8 членов составляют код в определенном клоне клеток. Т.о., может быть необходимо сгенерировать двойные мутанты и далее, как это было проделано для немногих генов биосинтетических энзимов (Table S2).
Необходимо отметить, что гипотеза сахарного кода существует, но противоречива. Ряд ключевых находок подтверждает гипотезу: разные клетки генерируют уникальную композицию HS; разные структурные мотивы HS ассоциируют с определенными онтогенетическими событиями, особенно у беспозвоночных; некоторые взаимодействия HS-белков обнаруживают специфичность и избирательность. Особенно интересно, что энзимы для 3-O-сульфатирования вносят вклад на очень незначительном уровне в модификации HS и пока представляют самое большое семейство на этом пути (Thacker et al., 2014), подтверждая, что индивидуальные члены влияют на разветвления во время эволюции, чтобы осуществлять слегка различающиеся функции. Мнение, что семейство энзимов обладает различающимися функциями по генерации сахарного кода подтверждается с помощью биохимических доказательств на примере различий в предпочтении субстратов в одном и том же семействе энзимов (Moon et al., 2012). Однако, ряд аргументов противоречит сахарному коду. Напр., генетическое отсутствие определенных индивидуальных энзимов или стержневых белков не вызывает крупных дефектов, вообще-то благодаря функциональному перекрыванию или компенсаторным механизмам, как это видно при сравнении одиночных и двойных мутантов, или вообще-то потеря одного энзима может также индуцировать глобальные изменения в содержании HS цепочек, что может приводить к некоторой функциональной компенсации. Было также отмечено in vitro что некоторые взаимодействия HS-белок довольно не избирательны до тех пор, пока не происходит специфический тип сульфатирования (Ashikari-Hada et al., 2004) или пока не обеспечивается общая плотность негативных зарядов с помощью HS.
Если принимать во внимание генетический функциональный анализ индивидуальных членов семейства энзимов, то необходимо также отметить, что фенотип д. возникать не потому, что др. энзимы в том же самом семействе не могут компенсировать функцию, а потому, что эти энзимы не экспрессируются в затрагиваемой ткани. Одним из важных затруднений является то, что в противоположность синтезу РНК, синтез HS не управляется матрицей. Т.о., если существует сахарный код, то построение его зависит от прирожденных свойств биосинтетических энзимов и их комплексов, это вообще-то зависит от тонкой специфичности субстрата, т.к он решает, будут ли добавлены модификации к HS цепочкам в контексте др. модификаций этих цепочек.
Наконец, хотя разработаны мощные методы для изучения взаимодействий HS-белок in vitro (Powell et al., 2004; Shipp and Hsieh-Wilson, 2007), при этом новые технологии быстро развиваются, определение структуры HS при биохимическом и функциональном анализе в контексте развития in vivo, остается реальной задачей. По аналогии с успехи в профилировании экспрессии РНК, было бы идеально получить способность анализировать 'последствия' модификаций HS, с одного конца индивидуальной петли лро др., и в этом случае определять очень гетерогенную смесь HS цепочек, происходящую от одиночной клетки, получаемой из развивающихся организмов. Supplementary information available online at http://dev.biologists.org/lookup/suppl/doi:10.1242/dev.098178/-/DC1