Гепарансульфат (HS) - это древняя молекула гликокаликса, возникшая на ранних этапах эволюции метазоа [1,2]. В течение 500 миллионов лет она приобрела огромное молекулярное разнообразие [3], что позволило ей выполнять функции молекулярного распознавания, хранения и передачи информации, а также развила интерактивные и обучающие свойства, способные модулировать разнообразное клеточное поведение и физиологические процессы [4]. Молекулярное разнообразие HS является свойством его гликокода, т.е. информации, закодированной в структуре его гликозаминогликановых (GAG) цепей, которая способствует высокоспецифичному взаимодействию с широким спектром растворимых и структурных белков. Массивы гликанов на основе клеток и глико-геномное профилирование в настоящее время используются для определения структурных детерминант, действующих в глико-белковых взаимодействиях в живых клетках, чтобы лучше понять разнообразные функциональные свойства, передаваемые HS [5]. Сохранение HS на протяжении тысячелетий служит убедительным доказательством его критической роли во многих важных физиологических жизненных процессах, особенно когда для производства HS требуются значительные генетические инвестиции в ферменты биосинтеза HS. На самом простом структурном уровне HS состоит из повторяющегося дисахарида GlcNAc-GlcA, однако некоторые из этих остатков также подвергаются модификации путем сульфатирования, ацетилирования/деацетилирования в различных положениях вдоль цепи GAG HS и эпимеризации некоторых остатков GlcA в IdoA, что привносит значительный уровень структурной сложности, зарядовой гетерогенности и интерактивной способности (Рисунок 1a-c). HS является самым гетерогенным GAG и, после гепарина, самым высокозаряженным [6]. Как и гепарин, HS содержит переменные области высокого сульфатирования (S-домены), высокого ацетилирования (A-домены), но также имеет менее модифицированные деацетилированные области вдоль цепи HS [6] (рис. 1a). Ацетилированные области в гепарине менее обширны и встречаются в виде отдельных остатков, а не в виде ацетилированных блоков, однако в целом гепарин более обширно модифицирован, чем HS. Встречаются также низкосульфатированные формы HS. Анализ распределения биосинтетических ферментов HS в тканях коррелирует с разнообразием форм HS, обнаруженных в процессе развития и созревания тканей (рис. 2a). Сульфатация других GAG, таких как dermatan sulfate (DS) и keratan sulfate (KS), также неравномерна по цепи GAG, что также связано с интерактивной способностью этих GAG (рис. 2б). Разработка нескольких моноклональных антител (mAbs) к нативному хондроитинсульфату (CS), HS и кератансульфату (KS) с высоким и низким мотивом сульфатации также выявила специфическую локализацию мотивов сульфатации вдоль цепей CS, HS и KS. Специфическая иммунолокализация этих CS-мотивов в ряде тканей показывает, что они играют роль в морфогенезе тканей и связаны с популяциями стволовых клеток-предшественников и развитием тканей, а также с процессами восстановления тканей [7-15]. Сульфатные группы также являются заметными интерактивными характеристиками молекулы HS и располагаются на цепи HS в различных местах (рис. 1b,c). Сборка HS требует скоординированной деятельности более 20 биосинтетических ферментов [16]. Инвестиции клеток в такой сложный генетический биосинтетический механизм с сопутствующими метаболическими энергетическими потребностями показывают функциональную важность, передаваемую HS в основных жизненных процессах. Списки интерактома HS показывают, что HS связывает более 400 биологически активных белков [17]. В мышином исследовании острого заболевания поджелудочной железы было выявлено 786 HS-связывающих белков, что еще больше расширило интерактом HS [18,19,20]. Такие HS-связывающие белки включают разнообразные факторы роста, нейротрофины, цитокины, морфогены, хемокины, структурные белки внеклеточного матрикса (ECM), молекулы клеточной адгезии, протеазы и ингибиторы протеаз [21]. Справочное руководство Essentials of Glycobiology (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK579918/ accessed on 18 November 2022) является обширным справочным материалом для изучения гликобиологии.



Figure 1. The multiple steps in the biosynthesis of putative heparin and HS chains (a), and the multiple enzymes that sulfate specific regions (b) and identification of specific HS sequences and sulfate presentations that provide FGF-2 and AT binding sites in a putative HS chain (c). Figure reprinted/adapted from Suflita M et al. [22] with the permission of Springer publishers. The GAG symbols used in this figure are those recommended by the symbol nomenclature for glycans (SNFG) discussion group [23].



Figure 2. Variation in HS sulfation in a number of biological tissues and in GAG side chain structure. (a) Heatmap depicting the expression of twenty GAG biosynthetic enzymes demonstrating transcript expression levels for HS in 37 human tissues based on RNA sequencing (normalized transcripts per million, nTPM). Hierarchical clustering is shown based on the Pearson correlation. Data were obtained using the Genotype-Tissue Expression (GTEx) Program based on The Human Protein Atlas version 21.0 and Ensembl version 103.38. Figure modified from [24]. (b-e) Areas of high and low sulfation regions in putative GAG chains and specific regions in CS chains identified by a range of mAbs to CS sulfation motifs used in the assembly of CS chains. Figure 2a modified from Basu et al. [24] Reproduced under the Creative Commons Attribution CC-BY 4.0. with permission of The American Physiological Society.

Хотя производство специфических структур HS является важным моментом в предоставлении обучающей информации, регулирующей развитие тканей, другой момент заключается в том, что биосинтез HS является стохастическим процессом. Таким образом, хотя были определены отдельные функциональные мотивы HS, биосинтетические реакции HS обладают врожденной способностью производить различные структурные формы HS, которые имеют общие интерактивные свойства благодаря ионным взаимодействиям с участием их отрицательно заряженных сульфатных и карбоксилатных групп. Таким образом, хотя некоторые белок-лигандные взаимодействия могут включать строго определенные структуры HS, другие взаимодействия также происходят без видимого требования к различным сахаридным последовательностям для таких взаимодействий. Это поднимает вопрос о том, насколько существенным является контроль за производством этих специфических сульфатирующих мотивов, когда происходят и более распространенные взаимодействия HS [25]. Сродство и специфичность связывания определяются распределением заряда сульфатных и карбоксилатных групп и тем, как они представлены в плоской ориентации [26]. Сульфатные группы являются громоздкими образованиями, и правильное трехмерное пространственное представление в некоторых случаях может быть важным требованием для эффективного взаимодействия с рецептором. Эпимеризация GlcA в IdoA привносит большую гибкость в основу HS, что может позволить более обширное пространственное исследование сульфатных групп в различных ориентациях с интерактивными партнерами. Однако некоторые взаимодействия HS могут быть неспецифическими и ионными по своей природе. Таким образом, плотность заряда в тканях и высокоспецифичные взаимодействия с участием редких структур HS должны учитываться при контроле развития тканей.

Разнообразие боковых цепей GAG, прикрепленных к основным белкам PG на клеточной поверхности, обуславливает их клеточно-инструктивные и интерактивные свойства в ECM, позволяя взаимодействовать с факторами роста, хемокинами, морфогенами, протеазами и ингибирующими протеазы белками, а также облегчая реакцию клеток на сигналы, доставляемые ECM [24,27]. Сигнальный путь Wnt играет важную роль в развитии эмбриональных тканей и гомеостазе тканей взрослого организма. Белки Wnt - это секретируемые, модифицированные липидами гликопротеины, которые формируют градиенты морфогенов, направляющие клеточное поведение для получения этих эффектов [28]. Однако белки Wnt гидрофобны и плохо растворимы в водной среде, гепарансульфатные протеогликаны (HS-PGs) необходимы для надлежащей активности белков Wnt, поддерживая их растворимость, они также транспортируют белки Wnt, помогая формировать градиенты Wnt в тканях, которые определяют процессы развития [29]. Wnt связывается с доменом LDLR II perlecan, и это действует как средство доставки Wnt в процессе развития тканей [29,30]. HS-PGs также являются компонентами перицеллюлярных и базальных мембран ECM и играют роль в стабилизации синапсов в нейронных тканях, что важно для синаптической пластичности и взаимодействия нейронов в нейронных сетях центральной и периферической нервной системы (ЦНС и ПНС, соответственно) [24,27]. HS-PGs регулируют развитие тканей [31-33] и регулируют физиологические процессы в зрелых тканях [34,35]. Разнообразие структуры боковых цепей GAG в HS-PG придает клеткам и органам специфические функциональные свойства, а временные и пространственные изменения в структуре HS регулируют развитие тканей, опухолевый генез [36] и воспаление [37]. Разработка паттерн-специфических антител к HS [12,38] позволила продемонстрировать клеточное и тканевое распределение HS-PGs во время развития тканей и специфические мотивы сульфатации GAG. Секвенирование следующего поколения и самые современные аналитические инструменты теперь позволяют детально профилировать пространственно-временной характер экспрессии GAG и ферментов биосинтеза GAG в тканях [39,40]. На рисунке 2 тепловая карта, изображающая тканеспецифическую экспрессию генов ферментов биосинтеза HS в 37 тканях человека, полученных из Атласа белков человека [41,42], демонстрирует широкое распространение HS-PGs в этих тканях со специфическими модификациями HS в определенных тканях. На рисунке 2 также показана значительная вариабельность модификаций, происходящих в HS в этих тканях.

По оценкам, гены, кодирующие белки ECM, составляют 1,3-1,5% генома млекопитающих (http://www.pantherdb.org/genes/ accessed 3 December 2022) [43]. Транскриптомная идентификация белков ECM, основанная на вычислительном скрининге более 60 000 полноразмерных кДНК мыши на наличие секретируемых белков с последующим функциональным анализом in vitro, недавно выявила несколько ранее не идентифицированных HS-PG. Семь из них оказались PGs, ассоциированными с базальной мембраной [43]. Исследование сайтов специфического гликозилирования всех известных PGs с помощью масс-спектрометрической (MS) и гликопротеомной методологии также выявило несколько новых CS- и HS-PGs [44]. Из 300-400 генов ECM, которые, по оценкам, присутствуют в геномах млекопитающих, почти треть из них еще не идентифицирована [43]. Таким образом, в будущем ожидается дальнейшее увеличение сложности функциональных PGs. Pikachurin и Eyes shut - два примера HS-PGs, которые были идентифицированы относительно недавно, а характеристика их свойств еще больше иллюстрирует сложность клеточных регуляторных свойств, передаваемых HS-PGs в конкретных тканевых контекстах.

Как уже говорилось, GAG обладают молекулярным распознаванием и клеточно-инструктивными свойствами, участвующими в развитии тканей, ремоделировании соединительной ткани и восстановлении тканей [45,46]. Гликаны и GAGs играют ключевую роль в функционировании и судьбе нейронных клеток [47]. KS обладает нейрорегуляторными свойствами [7,15,48], KS также обладает клеточно-директивными свойствами в миграции клеток нервного гребня и развитии хорды, нервной трубки и нейронных сетей [49], но обычно ему приписывают несущие свойства как компоненту аггрекана - основного KS-PGs в тканях [50,51]. CS и родственный ему GAG дерматансульфат (DS) также обладают клеточно-инструктивными свойствами [52-55]. Эти GAG дополняют биоразнообразные свойства HS.

CS и HS GAGs взаимодействуют со стволовыми клетками в их среде ниш, способствуя их выходу из покоящихся рециркулирующих популяций и позволяя им достичь плюрипотентности и приобрести фенотип мигрирующих клеток предшественников, которые могут участвовать в процессах развития и восстановления тканей [52-59]. HS-PG perlecan является важным компонентом ниш стволовых клеток, его HS-цепи способствуют дифференцировке стволовых клеток и миграции линий предшественников стволовых клеток, которые участвуют в развитии ряда тканей [60-63]. В суставном хряще поверхностная зона ткани содержит популяцию стволовых клеток и клеток предшественников, которые стимулируют и поддерживают рост ткани [64-68]. Субпопуляции клеток в этой зоне ассоциированы с уникальными эпитопами мотивов сульфатации CS [69] и новыми внеклеточными сульфатазами, Sulf-1 и Sulf-2 [70], которые могут служить для регулирования их статуса дифференцировки через взаимодействие с матричными факторами роста (например, TGF-β), поддерживая тем самым рост расположенной рядом ткани [71].

Высоко сульфатированная гликоформа HS необходима для перехода мезенхимных эмбриональных стволовых клеток (mESCs) в специфическое терминально дифференцированное состояние, которое направляет их развитие в определенную клеточную линию [72,73]. При достижении плюрипотентности mESCs сначала синтезируют низкосульфатную гликоформу HS, которая управляет процессом дифференцировки [59,74], а затем в этом процессе участвует высокосульфатная HS [70,71]. В этом процессе участвуют N-сульфотрансферазы на ранних стадиях и 6-O и 3-O-сульфотрансферазы на более поздних, в результате чего образуются мотивы сульфатации HS, которые тонко регулируют переход к определенной клеточной линии [74]. HS-PGs регулируют стволовые клетки в нишах в развивающихся тканях, связывая факторы роста и поддерживая жизнеспособность стволовых клеток [60-63,75].

Мотивы сульфатации CS 3B3[-], 7D4 и 4C3 экспрессируются стволовыми клетками-предшественниками, участвующими в развитии суставного хряща, и являются маркерами морфогенеза ткани [60-63]. Цепи HS перлекана играют важную роль в секвестрации факторов роста в нишах стволовых клеток, регулируя таким образом пролиферацию и жизнеспособность стволовых клеток и достижение плюрипотентности, т.е. образование мигрирующих популяций стволовых клеток, которые стимулируют развитие тканей и способствуют их восстановлению [30,76,77]. Перлекан является гибридным CS/HS-PG во многих тканях, а в фетальных тканях человека было показано, что он несет мотив сульфатации CS 7D4, который также был обнаружен в тканях, подвергающихся морфогенетической трансформации [78].

Многочисленные исследования продемонстрировали неравномерное распределение сульфатных групп вдоль цепей GAG, как показано на рисунке 1. Сульфатные группы также неравномерно распределены по всем GAG, кроме НА, который является единственным несульфатированным GAG (рис. 2). Разработка ряда mAbs к специфическим сульфатным мотивам CS облегчила картирование этих мотивов вдоль цепей CS и DS [13,79-81]. Картирование доменов CS/DS GAG также позволило структурно охарактеризовать PGs [81-83]. Исследование HS Interactome выявило большое количество интерактивных лигандов HS [17]. В тканях происходит широкий спектр модификаций HS (рис. 2a). Характер сульфатации CS и HS изменяется при раке (рис. 3a) и объясняется мутациями в ферментах, модифицирующих HS и CS, при ряде заболеваний опорно-двигательного аппарата (рис. 3b).



Figure 3. Variation in the sulfation patterns of CS and HS in cancer (a) and mutations in HS sulfation enzymes associated with several musculoskeletal disorders (b). Data modified from Basu et al. [24] Reproduced under the Creative Commons Attribution CC-BY 4.0. with permission of The American Physiological Society.

HS имеет линейную спиралевидную форму с уникальными небольшими "перегибами", где D-глюкуроновая кислота эпимеризуется в L-идуроновую кислоту благодаря большей гибкости гликозидных связей вокруг остатков IdoA, что обеспечивает фокальные области в цепи HS, которые могут принимать более компактную конформацию, содержащую мотивы сульфатации 3-O [84]. Сульфатирование 3-O в цепях HS в целом встречается редко, однако в тканях присутствует множество изоформ HS3ST с различной субстратной специфичностью, что делает эту функциональную структурную модификацию HS загадочной. HS является хранилищем самых разнообразных "кодов сульфатации" среди всех GAG [84]. Это дает HS возможность избирательно распознавать и взаимодействовать с определенными белками [85-87]. Разнообразие белков, с которыми может взаимодействовать HS, отражено в белках, перечисленных в базах данных HS и GAG Interactome. Код сульфатации HS не биосинтезируется классическим образом, а возникает в результате действия контролируемой тканевым контекстом пространственно-временной экспрессии суперсемейства N- или O-сульфотрансфераз [88,89]. Семь изоформ 3-O-сульфотрансфераз (HS3ST-1, -2, -3A, -3B, 4, -5 и -6) вводят мотивы сульфатирования 3-O в цепи HS на заключительном этапе биосинтеза HS и, как правило, редко встречаются в большинстве тканей [90]. Однако это не всегда так, поскольку HS фолликулярной жидкости человека содержит большое количество 3-O-сульфатирующих мотивов [91]. Фолликулярная жидкость играет важную роль в оплодотворении яйцеклетки и ее питании в раннем эмбриональном развитии. Семь изоформ H3ST демонстрируют значительные различия в субстратной специфичности. HS3ST-1 преимущественно генерирует АТ-связывающую последовательность HS, тогда как HS3ST-3B генерирует мотивы связывания для гликопротеина D HSV-1 [90]. Другие изоформы HS3ST демонстрируют совпадение в генерации АТ или гликопротеина D-связывающих мотивов, однако были выявлены четкие различия в специфичности между семью изоформами HS3ST [92-94]. Был идентифицирован ряд белков, которые преимущественно связываются с 3-O-сульфатными мотивами в HS, включая AT [95], FGFR [96], гликопротеин D [97], циклофилин B [98], нейропилин-1 [99], HC II [62,63], гликопротеин tau [87] и гликопротеин шипа SARS-CoV-2 [68]. Последовательности сульфатации HS, фланкирующие область сульфатации 3-O, обеспечивают специфичность для этих интерактивных последовательностей 3-O HS. Таким образом, мотивы 3-O, 2-O и 6-O сульфатации в HS оснащают его разнообразной динамической системой распознавания для точной идентификации биологически активных молекул клеточного регулирования с помощью " кода сульфации" [100,101]. Это отражается в ко-рецепторных функциях HS-PGs на поверхности клеток [68] и разнообразных ролях HS-PGs в стабилизации и функциональных свойствах глазных тканей [102] и нейронной активности в ЦНС/ПНС [103]. Взаимодействие HS-PG с гликопротеинами прикрепления к поверхности нервных клеток обеспечивает синаптическую стабилизацию [104-106] и сигнальные свойства нейронных сетей [106]. Специфический вклад синаптических HS-PG нейрексина в стабилизацию и функционирование нейронов [104]. also show the important tissue organizational functional properties that HS-PGs convey to specific tissues [24,44].

Огромное структурное разнообразие замещения гликанов в белках создает значительные технические проблемы, которые затрудняют выяснение конкретных функциональных ролей этих разнообразных гликозилированных паттернов [112]. Справочное руководство Essentials of Glycobiology является чрезвычайно полезным справочным источником, помогающим в решении любых технических вопросов (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK579918/ accessed 8 November 2022). Значительные достижения в области количественной транскриптомики, протеомики и редактирования генов на основе нуклеаз открыли новые возможности для анализа функциональной роли гликозилирования путем направленного воздействия на экспрессию биосинтетических ферментов, ответственных за эти модификации белков. Кроме того, разработка передового программного обеспечения для in silico анализа взаимодействий гликан-белок улучшает наше понимание функциональных сложностей гликопротеома [113]. Гликановые микрочипы также оказались чрезвычайно полезными инструментами в расшифровке гликан-белковых взаимодействий [114-116]. Методы искусственного интеллекта (ИИ) также в настоящее время используются в исследованиях структуры-функции гликанов и в разработке лекарств и хорошо подходят для анализа больших массивов данных [117-120]. Для помощи в таких исследованиях существует ряд баз данных и инструментов по гликомике [118-122]. MatrixDB - особенно полезная база данных, хорошо снабженная текущей информацией и услугами по гликомике [118,119]. Киотская энциклопедия генов и геномов (KEGG) [123-125] охватывает биоинформатику и анализ данных в области геномики, метагеномики, метаболомики и омических исследований, связанных с молекулярным моделированием, имитационной системной биологией и трансляционными исследованиями в области дизайна лекарств и разработки приложений. KEGG предоставляет графические инструменты Java для просмотра геномов и сравнения геномных карт, а также вычислительного анализа последовательности и графических данных. KEGG обновляется ежедневно и доступна на сайте GLYCAN (http://www.genome.jp/kegg/glycan/ accessed 9 November 2022). База данных углеводных структур также была добавлена к KEGG [126]. Она включает информацию о путях, связанных с гликанами, и карту составных структур, иллюстрирующую вариации углеводных структур в организмах.

Ресурс Gene Ontology (GO), предоставляемый Gene Ontology Consortium, является самым обширным в мире источником информации о функции генов и продуктов генов (http://geneontology.org accessed 18 November 2022) [127,128].