В лаборатории Рубина разработан мощный метод, который использовал дрожжевую систему рекомбинации FRT/FLP для эффективного создания соматических мозаик у дрозофилы. Система FRT/FLP, которая включает рекомбинацию ДНК между двумя последовательностями FRT, катализируемую рекомбиназой FLP, была впервые введена в дрозофилу Кентом Голиком (Golic, 1991; Golic and Lindquist, 1989). Но лаборатория Рубина систематически внедряла эту систему для создания мозаичных генетических паттернов для поиска генов, контролирующих развитие взрослых эпителиальных структур, таких как глаза, крылья и ноги (Xu and Rubin, 1993) (рис. 1A). Преимуществом скрининга на основе мозаики является то, что мутантные фенотипы можно быстро оценить в потомстве F1 мутагенизированных мух, по сравнению с потомством F3 в традиционных генетических скринингах, которые основаны на изучении гомозиготных мутантных животных. Даже мутации с плейотропным эффектом на более ранних стадиях развития могут быть извлечены из таких мозаичных паттернов. С помощью этого подхода в моей пост-докторской работе были открыты cAMP-зависимая протеинкиназа (PKA) как медиатор передачи сигналов Hedgehog (Pan and Rubin, 1995) и Kuzbanian (ADAM10) как трансмембранная металлопротеаза, ответственная за протеолитическое расщепление и активацию клеточно-поверхностного рецептора Notch (Pan and Rubin, 1997).



Fig. 1. FLP/FRT-based mosaic screen for growth regulators in Drosophila. (A) From a heterozygous genetic background for a given mutation (+/-, light grey circle), a single progenitor cell that is homozygous for this mutation (-/-, white circle), as well as a wildtype sibling cell (+/+, grey circle) carrying two copies of control chromosome, can be generated by FLP/FRT-mediated recombination. The control chromosome is often labeled by a ubiquitous marker so that the -/-, +/+, and ± cells can be distinguished based on the expression levels of the marker. These progenitor cells proliferate to produce two clones of cells (-/- clone, white oval; +/+ clone, grey oval), which can be scored in adult flies. Mutations of positive or negative growth regulators are expected to generate undergrown or overgrown homozygous mutant clones that are smaller or larger than their wildtype sibling clones, respectively. So far FLP/FRT screens have focused on negative growth regulators since tissue overgrowth is a much more specific phenotype than tissue undergrowth. (B) Scanning electron micrographs of mosaic Drosophila compound eyes carrying homozygous Tsc1 -/- (left) or hpo -/- (right) tissues. Left: Tsc1 mutant tissue occupied the upper half of the eye (above the dotted line) and displayed enlarged ommatidia size (Gao and Pan, 2001). Right: hpo mutant tissue was highly folded due to massive overgrowth (Wu et al., 2003). (C) Extensive genetic screens in Drosophila implicate mTOR and Hippo as two major pathways controlling organ size. The two pathways integrate two types of cues to growth control: the mTOR pathway mainly responds to tissue-extrinsic cues such as nutrients and growth factors, while the Hippo pathway integrates tissue-intrinsic cues such as adherens junction, cell polarity and mechanical force to growth control.

После создания независимой лаборатории в UT Southwestern я продолжил использовать мозаичные скрининги для выделения мутаций с интересными фенотипами развития, но вместо этого сосредоточился на мутациях, вызывающих избыточный рост тканей. По сравнению с формированием паттерна, контроль роста был менее понятен. Это состояние знаний было прекрасно отражено во влиятельном в то время обзоре (Conlon and Raff, 1999). Оглядываясь назад, можно предположить, что это объясняется, по крайней мере частично, тем, что эмбрионы дрозофилы не растут в размерах, и, следовательно, пути контроля размеров могли бы избежать чрезвычайно успешных эмбриональных паттернов Вихауса/Нуссляйн-Вольхарда и их современников. Таким образом, паттерны на основе мозаики предоставили беспрецедентную возможность систематически исследовать эти пути. Хотя несколько лабораторий проводили подобные мозаичные скрининги генов контроля роста, поле было широко открыто для генетических исследований.

Когда мы приступили к скринингу, геном дрозофилы не был секвенирован, и мутации с транспозонной меткой для большинства генов были недоступны. Молекулярное клонирование интересующей мутации часто включало генетическое картирование мутации в приблизительном хромосомном регионе, а затем зондирование переваренной ферментами рестрикции геномной ДНК мутантных мух для выявления аномального размера/шаблона фрагментов ДНК методом Саузерн-блоттинга. Первоначально мы использовали рентгеновское облучение в качестве мутагена из-за его склонности к образованию делеций, инверсий и транслокаций, которые легче обнаружить с помощью Саузерн-блоттинга, но в итоге перешли на химический мутагенез после того, как в 2000 году стала доступна последовательность генома мухи (Adams et al., 2000).

Скрининг на основе мозаики, проведенный нами и другими лабораториями, в конечном итоге выявил два различных класса мутантов с фенотипами автономного роста клеток: мутанты, связанные с увеличением размера клеток (гипертрофия) и мутанты с увеличением числа клеток (гиперплазия) (рис. 1B). Первоначально мы сосредоточились на мутантах с гипертрофией. Примерно в это время начался шквал работ, в которых говорилось о пути, включающем рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGFR), субстрат рецептора инсулина (IRS), фосфоинозитид-3-киназу (PI3K), Akt, mTOR и S6K в качестве положительного, автономного регулятора размера клеток у дрозофилы (обзор в Kozma and Thomas, 2002; Oldham et al., 2000). Поэтому несложно было предположить, что мутации гипертрофии, вероятно, кодируют негативные регуляторы пути IGFR-IRS-PI3K-Akt-mTOR-S6K. Несколько лабораторий, включая нашу, обнаружили такие мутанты гипертрофии, которые, в частности, включали PTEN (Gao et al., 2000; Goberdhan et al., 1999; Huang et al., 1999), Tsc1 и Tsc2 (Gao and Pan, 2001; Ito and Rubin, 1999; Potter et al., 2001; Tapon et al., 2001). В то время как биохимический механизм опухолевого супрессора PTEN был установлен у млекопитающих, механистические исследования Tsc1 и Tsc2 у дрозофилы сыграли важную роль в установлении того, что эти опухолевые супрессоры являются негативными регуляторами mTOR (Gao et al., 2002; Radimerski et al., 2002), действуя как GTPase activating protein (GAP) для малой GTPase Rheb (Saucedo et al., 2003; Stocker et al., 2003; Zhang et al., 2003). Помимо генетического анализа, в моей лаборатории в исследовании регуляции mTOR с помощью Tsc1-Tsc2 и Rheb очень помогло использование культивируемых клеток дрозофилы S2 в качестве рабочей лошадки для биохимического изучения этого пути. Этот брак между генетическим эпистазом in vivo и биохимическим анализом в культивируемых клетках дрозофилы подготовил нас к последующему изучению сигнального пути Hippo с использованием аналогичного подхода.

Хотя разгадка молекулярной функции Tsc1-Tsc2 была достойным вкладом в изучение mTOR-сигнализации, концепция mTOR как центрального регулятора клеточного роста уже была установлена (обзор в Schmelzle and Hall, 2000). Продолжение этого пути становилось все менее привлекательным, поэтому мы вернулись к классу гиперпластических мутантов избыточного роста, которые были гораздо более многочисленными, чем мутанты гипертрофии. Наши первые хиты гиперпластических мутантов включали "классические" супрессоры опухолей, такие как жировой (Bryant et al., 1988) и расширенный (Boedigheimer and Laughon, 1993), впервые выделенные десятилетия назад на основе перерастянутых тканей личинок у гомозиготных животных; бородавки, более недавно выделенный супрессор опухолей с помощью мозаичных экранов (Justice et al., 1995; Xu et al., 1995); а также несколько новых групп комплементации. Эти мутанты гиперплазии, однако, сильно различались по тяжести фенотипов перерастания. Таким образом, не сразу было очевидно, что они попадут на общий путь. Это, в сочетании с четкими фенотипами размера клеток, связанными с мутантами пути mTOR, заставило нас первоначально сосредоточиться на мутантах гипертрофии. Как показали последующие исследования, почти все мутанты клеточно-автономной гиперплазии соответствуют компонентам пути Hippo, причем наиболее тяжелые мутанты гиперплазии поражают его основной киназный каскад, а более легкие мутанты гиперплазии - его регуляторы, расположенные выше по течению. В отличие от регулятора клеточного роста mTOR, путь Hippo регулирует размер органа посредством клеточной пролиферации и апоптоза. В то время как путь mTOR объединяет различные внешние для ткани сигналы, такие как питательные вещества и факторы роста, путь Hippo соединяет внутренние для ткани сигналы, такие как адгерентные (слипчивы) соединения, клеточная полярность и механическая сила, для контроля роста (рис. 1С). Вместе mTOR и Hippo представляют собой два основных пути, предназначенных для контроля размера, что было выявлено в результате исчерпывающих генетических исследований у дрозофилы.

Основной киназный каскад пути Hippo включает четыре опухолевых супрессора, которые были выделены в результате мозаичных скринингов мутантов гиперплазии рядом лабораторий, включая нашу. К ним относятся warts (wts), который кодирует протеинкиназу семейства Nuclear Dbf-2-related (NDR) (Justice et al., 1995; Xu et al., 1995); salvador (sav), который кодирует WW домен-содержащий белок (Kango-Singh et al., 2002; Tapon et al., 2002); hippo (hpo), кодирующий протеинкиназу семейства Ste-20 (Harvey et al., 2003; Jia et al., 2003; Pantalacci et al., 2003; Udan et al., 2003; Wu et al., 2003); и mob as tumor suppressor (mats), адаптерный белок семейства Mob1 (Lai et al., 2005). Эти гены выделялись среди мутантов гиперплазии благодаря их наиболее впечатляющему фенотипу чрезмерного роста во многих взрослых тканях, таких как крылья, ноги и глаза, который может быть связан как с чрезмерной клеточной пролиферацией, так и с неспособностью пройти запрограммированную развитием клеточную смерть. У меня буквально мурашки побежали по коже, когда я впервые увидел эти опухолевые разрастания у мух!

Хотя выявление нескольких генов с похожими мутантными фенотипами может указывать на их участие в общем биологическом процессе с генетической точки зрения, оно мало что говорит о молекулярных отношениях между этими опухолевыми супрессорами. Анализ генетического эпистаза, который был успешно использован для изучения организации других сигнальных путей, таких как путь рецептора Toll (Anderson et al., 1985), требует объединения мутаций с противоположными фенотипами. Очевидно, что в данном случае эта стратегия была невыполнима из-за сходных фенотипов опухолевых супрессоров. Поэтому мы попытались решить этот важный вопрос с помощью биохимических анализов. К счастью, моя лаборатория, которая много работала над фосфорилированием белков при анализе регуляции mTOR с помощью Tsc1-Tsc2 и Rheb (Gao et al., 2002; Zhang et al., 2003), располагала необходимым опытом для решения этого вопроса. С помощью анализов in vitro и клеточных культур мы показали, что эти белки-супрессоры опухолей образуют киназный каскад, в котором Hpo фосфорилирует и активирует Wts, а Sav потенцирует эту реакцию фосфорилирования, образуя белковый комплекс с Hpo (Wu et al., 2003). Обнаружение киназного каскада важно, поскольку оно не только впервые определило биохимический путь, связывающий эти генетически изолированные опухолевые супрессоры, но и предложило молекулярную основу для включения в будущие исследования дополнительных нижележащих эффекторов и вышележащих регуляторов.

Несмотря на генетическую идентификацию четырех основных опухолевых супрессоров и демонстрацию нами киназного каскада к этому моменту, в данной области существовали ключевые расхождения относительно того, как эти опухолевые супрессоры связаны друг с другом и как они регулируют рост тканей. В то время как наша работа показала, что эти белки образуют киназный каскад, который в конечном итоге ингибирует транскрипцию генов клеточного цикла и выживания клеток, таких как cycE и diap1 (Wu et al., 2003), другие исследователи связывали эти опухолевые супрессоры с фосфорилированием белка Diap1 и его деградацией. Достоверность модели каскада киназ Hippo и то, влияет ли он на транскрипцию генов, еще предстоит выяснить. Эти вопросы были решены благодаря идентификации Yorkie (Yki) как субстрата Wts и недостающего звена между Hippo киназным каскадом и транскрипцией генов-мишеней.

Молекулярное раскрытие киназного каскада Hippo сфокусировало внимание моей лаборатории на Wts, киназе, расположенной ниже по течению в киназном каскаде Hippo. Поскольку Wts кодирует протеинкиназу, мы предположили, что Wts регулирует транскрипцию генов-мишеней косвенно, фосфорилируя неизвестный фактор транскрипции. Затем мы попытались идентифицировать этот фактор путем поиска Wts-связывающих белков с помощью дрожжевой двугибридной стратегии (Y2H). Вместо более часто используемой транскрипционной системы Y2H, которая была склонна к ложноположительным результатам, Цзяньбин Хуан в моей лаборатории освоил не-транскрипционную систему, основанную на восстановлении SOS-RAS сигнализации в дрожжах (Aronheim et al., 1997), которая в наших руках была намного чище, чем транскрипционные паттерны. Используя некаталитическую часть белка Wts в качестве приманки, он выделил 3 независимых клона, содержащих перекрывающиеся последовательности ранее не охарактеризованного гена дрозофилы, аннотированного как CG4005 (Huang et al., 2005). Эврика наступила, когда Цзяньбин избыточно экспрессировал CG4005 в глазу и увидел резкое увеличение размера глаза. Это был единственный Y2H-хит, который он когда-либо тестировал.

Как и ожидалось от субстрата Wts, белок CG4005 действительно фосфорилировался и инактивировался с помощью Wts, а его избыточная экспрессия полностью фенокопировала потерю любого опухолевого супрессора каскада киназ Hippo, от транскрипции целевых генов до разрастания тканей. И наоборот, потеря функции CG4005 снижала транскрипцию целевых генов и вызывала атрофию тканей, а анализ эпистаза помещал его вниз по течению каскада киназ Hippo. Следуя обычаю называть ген дрозофилы по фенотипу потери функции, мы назвали CG4005 "yorkie" - сокращенное название йоркширского терьера, породы домашних собак, известной своими миниатюрными размерами. Мое образование в области транскрипционных факторов пригодилось нам при описании Yki. Ключевым экспериментом было показать, что каскад киназ Hippo может регулировать транскрипционную активность Yki. Для этого мы исследовали активность слитого белка между Yki и ДНК-связывающим доменом Gal4 с помощью клеточного анализа репортера.

Открытие Yki объединило эту область, подтвердив модель киназного каскада и определив регуляцию транскрипции как важнейший результат пути Hippo. Сведя путь Hippo к одному эффектору, теперь можно было использовать фосфорилирование Yki, транскрипционную активность Yki и, в конечном итоге, субклеточную локализацию Yki в качестве удобного индикатора активности пути. Этому способствовала разработка фосфо-специфических антител против ключевого сайта фосфорилирования Wts в Yki (Dong et al., 2007). В настоящее время эти инструменты регулярно используются для характеристики пути Hippo.

Yki не содержит ДНК-связывающего домена, а скорее функционирует как коактиватор. Для поиска его ДНК-связывающего партнера мы использовали два параллельных подхода: выявление Yki-связывающих белков и описание мотива последовательности в минимальном Hippo-response element (HRE) в транскрипционном гене-мишени diap1. Оба подхода сошлись на Scalloped (Sd), известном ДНК-связывающем транскрипционном факторе, в качестве партнера по связыванию Yki (Wu et al., 2008). Идентификация Sd как партнера Yki была неожиданной, поскольку Sd хорошо известен своей ролью в определении судьбы клеток крылового кармана как партнер для Vestigial (Vg), другого транскрипционного коактиватора (действительно, Sd и Vg были названы в честь их сходных фенотипов потери пластинки крыла) (Halder et al., 1998). Однако связывание Sd и Yki было настолько специфичным, что мы даже выделили миссенс-аллель потери функции эндогенного yki, который специфически нарушал связывание Yki-Sd, так что мы решили продолжить изучение этого вопроса. В подтверждение важности комплекса Sd-Yki, потеря Sd полностью спасала все фенотипы избыточности функции Yki, которые мы анализировали, от транскрипции целевых генов до роста тканей (Wu et al., 2008). Однако оставалась одна загадка: в отличие от Yki, потеря Sd не влияет на нормальный рост большинства тканей дрозофилы за пределами крыла (Wu et al., 2008). Если Sd и Yki являются партнерами в опосредовании транскрипционного выхода пути Hippo, почему они не дают идентичных фенотипов у мутантов? Эта генетическая загадка заставила некоторых исследователей предположить, что Yki задействует дополнительные ДНК-связывающие транскрипционные факторы, помимо Sd, для нормального контроля роста.

Может ли эта загадка объясняться чем-то более простым? Альтернативное и более простое объяснение несопоставимого фенотипа мутантов yki и sd включает концепцию репрессии по умолчанию. Согласно этой модели, Sd может функционировать по умолчанию как транскрипционный репрессор в отсутствие Yki. Yki, в свою очередь, регулирует нормальный рост тканей, противодействуя репрессорной функции Sd's, путем "relief-of-repression" (Koontz et al., 2013). В отсутствие Yki гены-мишени пути Hippo активно выключаются репрессором по умолчанию Sd, что приводит к дефектному росту тканей в клетках yki-мутантов. Напротив, в отсутствие Sd те же гены-мишени больше не подавляются, что объясняет гораздо более мягкие фенотипы sd-мутантов. Ключевое предсказание этой модели заключается в том, что потеря Sd должна спасать фенотипы, вызванные потерей yki. Действительно, мы наблюдали полное спасение фенотипов yki-мутанта у двойных мутантов sd; yki. Далее мы идентифицировали Tgi (Koontz et al., 2013) и Nerfin-1 (Guo et al., 2019) как Sd-связывающие ко-репрессоры.

Помимо пути Hippo, другие транскрипционные пути развития, такие как Notch и Wnt, также полагаются на репрессию по умолчанию для обеспечения точного контроля транскрипционного переключателя: целевые гены активно репрессируются специфическими для пути ДНК-связывающими транскрипционными факторами в отсутствие специфических для пути ко-активаторов, а целевые гены включаются только в присутствии специфических для пути активаторов (Affolter et al., 2008; Barolo and Posakony, 2002). Этот общий принцип сигнализации развития может лежать в основе надежности и точности транскрипционных переключателей в процессах роста, формирования и дифференцировки.

Идентификация киназного каскада Hippo и его ядерных эффекторов у дрозофилы заложила основу для изучения Hippo-сигнализации у млекопитающих. Вскоре после этого мы и сотрудники лаборатории Кун-Лян Гуана показали, что в культивируемых клетках млекопитающих аналоги компонентов пути Hippo - Mst1/2 для Hpo, Sav1 для Sav, Lats1/2 для Wts и Mob1A/B для Mats, образуют аналогичный киназный каскад, который сходится на фосфорилировании Yki, аналога YAP (Yes-associated protein) и TAZ (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, также называемый WW domain containing transcription regulator 1 или WWTR1) (Dong et al. , 2007; Zhao et al., 2007).

Следующий важный вопрос заключался в том, играет ли этот путь аналогичную роль в контроле роста у млекопитающих. Печень всегда восхищала меня своей впечатляющей способностью поддерживать и восстанавливать постоянный размер, даже после хирургического удаления 2/3 печени. Поэтому мы решили проверить эту возможность на печени, создав трансгенную модель мыши с YAP, индуцируемым тетрациклином. Хотя в то время YAP был плохо изученным геном у млекопитающих, мы предположили, что избыточная экспрессия YAP может вызывать у млекопитающих такой же избыточный рост тканей, как Yki у дрозофилы. К нашему большому удивлению, мы обнаружили, что избыточная экспрессия YAP в печени взрослого человека вызывает быстрое увеличение размеров печени до пяти раз от нормы, а избыточная экспрессия YAP в печени новорожденных приводит к распространенной гепатоцеллюлярной карциноме (рис. 2) (Dong et al., 2007). С тех пор аналогичная гепатомегалия и генез опухолей были зарегистрированы в печени, специфически нокаутированной для опухолевых супрессоров, расположенных выше YAP (Lee et al., 2010; Lu et al., 2010; Nishio et al., 2016; Song et al., 2010; Zhang et al., 2010; Zhou et al., 2009). Как биологу, изучающему развитие дрозофилы, мне было особенно приятно, что знания, полученные на дрозофиле, помогли нам разработать простой и проницательный эксперимент для раскрытия консервативной функции Hippo в контроле роста и неуловимой онкогенной функции YAP у млекопитающих.

Fig. 2. Liver-specific YAP overexpression induces hepatomegaly and hepatocellular carcinoma in mice (Dong et al., 2007). (A) A normal mouse liver. (B) Hepatomegaly induced by 4 weeks of YAP overexpression in adult mice. (C) Hepatocellular carcinoma induced by 3 months of YAP overexpression starting at birth. Исследование трансгенной печени YAP ознаменовало начало нового направления в нашей лаборатории, которая в прошлом была сосредоточена на дрозофиле, по изучению пути Hippo в физиологии и болезнях млекопитающих. В совокупности эти исследования раскрыли критическую роль Hippo-сигнализации в росте тканей, опухолевом генезе и регенерации (Cai et al., 2010; Dong et al., 2007), выяснили, как нарушение регуляция Hippo-пути способствует развитию таких заболеваний, как нейрофиброматоз (Yin et al., 2013; Zhang et al., 2010) и поликистоз почек (Cai et al., 2018), а также выявили первый химический ингибитор онкопротеина YAP (Liu-Chittenden et al., 2012).

Сегодня Hippo-YAP/TAZ-путь признан одним из основных онкогенных сигнальных путей при раке человека (Sanchez-Vega et al., 2018). Сообщается о многих механизмах дисрегуляции активности YAP/TAZ в опухолевых клетках, таких как амплификация гена YAP (Overholtzer et al., 2006; Zender et al., 2006), слияние генов YAP/TAZ (Antonescu et al., 2013; Tanas et al., 2011) или инактивация вышележащих опухолевых супрессоров (Murakami et al., 2011; Rouleau et al., 1993; Sekido, 2011). Помимо стимулирования роста опухолевых клеток, активация YAP/TAZ также способствует устойчивости к химио- и иммунотерапии (Janse van Rensburg et al., 2018; Ni et al., 2018; Zhao and Yang, 2015). Многие фармацевтические и биотехнологические компании активно ищут ингибиторы YAP/TAZ в качестве терапии рака. И наоборот, активация YAP/TAZ изучается как потенциальный подход для улучшения восстановления и регенерации тканей (Fan et al., 2016; Leach et al., 2017). Помимо рака и регенерации, путь Hippo также изучается для других патологических состояний, таких как фиброз (Wang et al., 2016), гипертония (Bertero et al., 2016) и поликистоз почек (Cai et al., 2018). Учитывая все возрастающее влияние передачи сигналов Hippo на здоровье и болезни человека, трудно представить, что всего 20 лет назад ни основной механизм Hippo-пути, ни мощная онкогенная активность Yki/YAP/TAZ не были известны даже у дрозофилы.

После идентификации основного киназного каскада и транскрипционного механизма пути Hippo началось изучение его вышестоящих импульсов. Как биолог, специализирующийся на развитии, я привык к простым линейным путям, таким как Wnt, Hedgehog и Notch, которые имеют специфические лиганды, рецепторы и внутриклеточные компоненты. Соответственно, мутации в вышележащих компонентах этих путей, таких как лиганды и рецепторы, часто показывают идентичные фенотипы, что и мутации во внутриклеточных компонентах. Мы надеялись, что если мы будем продолжать поиск новых мутантов пере-избыточного роста, то: 1) в конечном итоге попадем на эти компоненты, расположенные выше по течению; и 2) эти компоненты, расположенные выше по течению, должны показать схожие фенотипы мутантов, как и компоненты основного киназного каскада. Этот линейный взгляд оказался слишком упрощенным. Скорее, теперь известно, что каскад киназ Hippo совместно регулируется сложным набором восходящих компонентов аддитивным/комбинаторным образом. (Fig. 3).



Fig. 3. A comparison between the Hippo pathway and the Wnt pathway. Both pathways engage intracellular kinases to control the activity of a pathway-specific transcriptional coactivator, Yki for Hippo and ?-catenin for Wnt, respectively. However, they differ in the regulation of intracellular kinases by upstream components/signals. Unlike activation of the Wnt pathway by the Wnt family of ligands, Hippo signaling is regulated by a complex array of upstream signals.

Первый взгляд на эту сложность был сделан в лаборатории Georg Halder's, который выявил Merlin (Mer) и Expanded (Ex), два ассоциированных с апикальной мембраной белка, как положительные регуляторы передачи сигналов Hippo (Hamaratoglu et al., 2006). В отличие от опухолевых супрессоров, составляющих каскад киназ Hippo, мутации в mer или ex вызывают очень слабый рост тканей. Поэтому на первый взгляд было не совсем очевидно поместить их в путь Hippo. Лаборатория Халдера сделала проницательное наблюдение, что двойные мутации mer и ex вызывают сильный рост, более похожий на мутации с потерей функции в каскаде киназ Hippo, что указывает на функциональную избыточность этих регуляторов. Это было важным открытием, поскольку оно побудило людей в этой области внимательнее присмотреться к слабым мутантам гиперплазии, выделенным в результате мозаичных скринингов. С тех пор с путем Hippo были связаны дополнительные ассоциированные с апикальной мембраной белки, такие как Fat (Bennett and Harvey, 2006; Cho et al., 2006; Silva et al., 2006; Willecke et al, 2006), Kibra (Baumgartner et al., 2010; Genevet et al., 2010; Yu et al., 2010), Crumbs (Chen et al., 2010; Grzeschik et al., 2010; Ling et al., 2010; Robinson et al., 2010) и Pez (Poernbacher et al., 2012). За редким исключением, общая тема заключается в том, что эти вышележащие регуляторы физически взаимодействуют с киназным каскадом Hippo через многочисленные межбелковые взаимодействия для доставки киназной кассеты Hippo к плазматической мембране для активации. Интересно, что экспрессия многих из этих вышележащих регуляторов отрицательно регулируется сигналом Hippo, образуя петлю отрицательной обратной связи (Genevet et al., 2010; Hamaratoglu et al., 2006).

Каскад киназ Hippo может дополнительно регулироваться киназами и фосфатазами. TAO-1, в частности, непосредственно фосфорилирует и активирует Hpo (Boggiano et al., 2011; Poon et al., 2011). Напротив, протеин-фосфатазный комплекс под названием STRIPAK непосредственно дефосфорилирует Hpo и тем самым ингибирует каскад киназ Hippo (Ribeiro et al., 2010). Комплекс STRIPAK становится молекулярным хабом (центром), который интегрирует разнообразные импульсы, исходящие сверху по течению на путь Hippo, от обработки лизофосфатидной кислотой в культивируемых клетках млекопитающих (Chen et al., 2019) до бактериальной инфекции у дрозофилы (Liu et al., 2016).

Молекулярная сложность каскада киназ Hippo выше по течению соответствует только разнообразным физиологическим сигналам, которые, как было показано, регулируют Hippo-сигнализацию, таким как адгеренс-переход, клеточная полярность, стресс и механическая сила (Davis and Tapon, 2019; Halder et al., 2012; Yu et al., 2015; Zheng and Pan, 2019). В частности, большое внимание уделяется регуляции передачи сигналов Hippo механической силой и связанной с ней динамикой цитоскелета. Эта концепция была вдохновлена исследованиями клеток млекопитающих, показавшими актомиозин-зависимые изменения активности YAP/TAZ при культивировании на узорчатом внеклеточном матриксе с различной жесткостью или размером островков (Dupont et al., 2011), а также исследованиями на дрозофиле, показавшими, что изменения актинового цитоскелета влияют на рост тканей путем модуляции пути Hippo (Fernandez et al., 2011; Sansores-Garcia et al., 2011). Расшифровка молекулярных механизмов, лежащих в основе механической регуляции передачи сигналов Hippo, остается передовым направлением в области Hippo и механобиологии.

Сложная регуляция сигнала Hippo четко отличает его от других канонических путей развития, таких как Wnt, Notch и Hedgehog (рис. 3). В свете его исконной функции в многоклеточном морфогенезе у одноклеточных родственников животных (см. ниже), возникает соблазн предположить, что путь Hippo, возможно, эволюционировал, чтобы связать архитектуру ткани с ее ростом и гомеостазом. Таким образом, путь Hippo очень чувствителен к нарушению нормальной целостности тканей и клеток, что, вероятно, влияет на адгерентные (слипчивые) соединения, полярность клеток и механическую силу, все с помощью которых могут модулировать активность пути Hippo. Это гарантирует, что любое отклонение от нормальной тканевой и клеточной архитектуры может быть эффективно восстановлено посредством Yki/YAP/TAZ-опосредованных транскрипционных ответов.

Наряду с быстрым прогрессом в понимании функции и регуляции пути Hippo в развитии и болезнях, в этой области начали задумываться об эволюционном происхождении пути Hippo. В сотрудничестве с лабораторией Inaki Ruiz-Trillo's мы сделали неожиданный вывод о том, что функциональные ортологи, кодирующие киназный каскад, транскрипционный механизм и вышележащие регуляторы пути Hippo, могут быть идентифицированы у близких одноклеточных родственников метазоа, таких как choanoflagellates и filastereans (Sebe-Pedros et al., 2012). Для хоанофлагеллят характерно наличие воронкообразного воротничка у основания жгутика (Fairclough et al., 2010), а филастерии - это маленькие, округлые амебоиды, покрытые длинными богатыми актином филоподиями (Sebe-Pedros et al., 2012). Многие хоанофлагелляты и филастерии демонстрируют многоклеточное поведение в своих жизненных циклах, образуя при определенных условиях многоклеточные колонии или агрегаты. Как ближайшие живые одноклеточные родственники животных, хоанофлагелляты и филастерии являются полезными моделями для понимания характеристик последнего одноклеточного предка животных в эволюционной биологии развития (evo-devo). Интересно, что компоненты других основных путей развития, таких как Wnt, BMP и Hedgehog, в основном отсутствуют у хоанофлагеллят и филастерий, что ставит путь Hippo в уникальное эволюционное положение, предшествующее появлению животных.

В качестве отправной точки для изучения биологической функции пути Hippo у этих одноклеточных организмов мы недавно разработали инструменты для генетических манипуляций у Capsaspora owczarzaki, филастерии, которая представляет собой самый низший из известных одноклеточных организмов, кодирующий все ключевые компоненты пути Hippo (Sebe-Pedros et al., 2012). В отличие от животного аналога, мы неожиданно обнаружили, что ортология Yki/YAP/TAZ (coYki) из Capsaspora не нужна для пролиферации клеток, но регулирует трехмерную (3D) форму агрегатов Capsaspora. В отличие от нормальных клеток Capsaspora, которые объединяются в сферические многоклеточные агрегаты, клетки coYki-/- образуют уплощенные агрегаты неправильной формы (Phillips et al., 2021). Далее мы проследили дефект формы 3D-агрегатов до аномального кортикального цитоскелета в отдельных клетках coYki-/- . Было высказано предположение, что возникновение многоклеточности стимулируется фаготрофными хищниками одноклеточных организмов, поскольку крупные многоклеточные агрегаты с меньшей вероятностью могут быть эффективно фагоцитированы хищниками и, таким образом, избирательно предпочтительны (Stanley, 1973). Таким образом, представляется правдоподобным, что передача сигналов Hippo могла бы обеспечить селективное преимущество, регулируя морфологию агрегатов у одноклеточных предков животных. Интересно, что мутация YAP с потерей функции у рыбок медака вызывает фенотип уплощения тканей (Porazinski et al., 2015), подобный тому, что наблюдается в агрегатах coYki-/- Capsaspora (рис. 4). Провокационная гипотеза заключается в том, что Yki/YAP/TAZ, возможно, сначала были отобраны в ходе эволюции для регулирования трехмерной формы многоклеточных агрегатов/колоний у одноклеточных предков животных, а затем были использованы для регулирования размера органов у животных. Изучение пути Hippo у других одноклеточных родственников животных, таких как хоанофлагелляты, должно еще больше прояснить предковую функцию этого пути в возникновении многоклеточности животных.



Fig. 4. A schematic showing the flattened 3D shape of coYki?/? Capsaspora multicellular aggregates (top) and the flattened body phenotype of YAP?/? medaka fish embryos (bottom).

На протяжении более века генетические исследования дрозофилы были ведущими в открытии многих консервативных механизмов биологии животных, от сигнальных путей до генов Hox и Toll-подобных рецепторов. Путь Hippo является свежим напоминанием об этой непреходящей теме. Преимущества простых модельных организмов, таких как дрозофила, заключаются не только в простоте фенотипического и генетического анализа для исследований, основанных на гипотезах, но, возможно, что более важно, в их способности к непредвзятым исследованиям. С ростом внимания к трансляционным исследованиям становится все более важным, чтобы широкое сообщество не упускало из виду незаменимую роль модельных организмов в экосистеме биомедицинских исследований. Возможно, не случайно два основных сигнальных пути, предназначенных для контроля роста, Hippo и mTOR, возникли в результате исследований на простых модельных организмах - Hippo на плодовых мушках и mTOR на почкующихся дрожжах.

Размышления о ранних открытиях пути Hippo также напоминают нам о важности технологий, как красноречиво сказал Сидни Бреннер: "Прогресс в науке зависит от новых методов, новых открытий и новых идей, возможно, именно в таком порядке". (Бреннер, 2002). В случае с Hippo трудно представить, как этот путь мог бы быть открыт без мощной техники FRT/FLP-опосредованной мозаики. Аналогично, поиск прямого субстрата Wts был бы чрезвычайно трудным и неэффективным без использования метода дрожжевой двугибридной технологии. Многогранный подход к любому биологическому вопросу требует готовности применять все возможные методы и знания, многие из которых, вероятно, находятся за пределами предыдущей подготовки. Такое отношение, или "техническая смелость", как выразился Джозеф Голдштейн (Goldstein, 1986), является важным атрибутом, который нам всем пригодится.

Область исследований Hippo значительно выросла с первых дней своего существования, о чем ярко свидетельствует ошеломляющий рост числа публикаций, связанных с Hippo (рис. 5). Я до сих пор помню первые несколько международных семинаров по передаче сигналов Hippo, на которых исследователи дрозофилы составляли около половины участников. Сейчас это число составляет менее 10%. Быстрый прогресс в области исследований Hippo за последние два десятилетия в немалой степени обусловлен слиянием различных талантов, опыта и моделей. Такая синергия будет продолжать расширять границы фундаментальных знаний и трансляционных приложений в ближайшие годы.



Fig. 5. The number of Hippo pathway-related publications each year from 2003 to 2021, by searching the PubMed using the key word "Hippo pathway".