Hox гены были первоначально идентифицированы как ключевые регуляторы качественных особенностей сегментов тела у плодовых мушек Drosophila melanogaster, базируясь на анализе мутантов, у которых сегмент тела приобретал качественные особенности другого (a.k.a. гомеозисная трансформация; rev. Lewis, 1994). Генетический и молекулярный анализ выявил, что гены, затрагиваемые этими мутациями (гомеозисные гены) расположены в виде геномного кластера, который подвергся дупликациям, так что большинство позвоночных имеет 4 кластера, хотя костистые рыбы имеют до 7 кластеров (rev. Lemons and McGinnis, 2006). Как результат геномы мыши и человека имеют 39 Hox белков, тогда как рыбки данио 48. Клонирование гомеотических генов далее выявило, что обладают общим helix-turn-helix ДНК связывающим мотивом, гомеобоксом (rev. Gehring et al., 1994). Присутствие этого ДНК связывающего домена подтверждает, что Hox белки действуют как транскрипционные факторы (rev. Levine and Hoey, 1988). Т.о., возникла модель, где Hox белки регулируют экспрессию генов, участвующих в формировании специфических признаков для сегментов тела. Однако, вскоре стало очевидным, что Hox белки обладают низким сродством и специфичностью к ДНК последовательностям, при этом большинство Hox белков связывает AT богатые последовательности (Levine and Hoey, 1988). Эта низкая биохимическая специфичность находится в резком контрасте с взыскательной генетической специфичностью, выявляемой с помощью различных фенотипов, наблюдаемых у Hox мутантов. Более того, было установлено, что один и тот же Hox белок может или активировать или репрессировать транскрипцию в зависимости от точных обстоятельств (Krasnow et al., 1989), в результате возникают вопросы, какие же активности в действительности обеспечиваются Hox белками. Разрешение этой загадки пришло само собой, когда стало очевидным, что Hox белки не действуют в изоляции, а кооперируют с др. факторами, чтобы выполнять свои функции (rev. Mann et al., 2009). Поскольку список факторов, действующих вместе с белками Hox, был первоначально относительно коротким, но он существенно вырос в последние годы, подтвердив, что Hox белки функционируют в виде крупных комплексов из многих белков.

COMPOSITION OF HOX TRANSCRIPTION COMPLEXES

Поскольку Hox белки могут действовать во многих наборах, то они взаимодействуют непосредственно с факторами, участвующими в процессах столь разнообразных как везикулярный трафик и клеточная миграция (Lambert et al., 2012), здесь будет рассмотрена роль Hox белков в транскрипционной регуляции. В этом контексте на современном представлении, что Hox белки действуют в многокомпонентных регуляторных комплексах, т.е. на факторах, которые, как было установлено, действуют как часть Hox комплексов c помощью биохимических подходов. Однако необходимо отметить, что генетический скрининг идентифицировал факторы, которые кооперируют с Hox белками и очень вероятно, что некоторые из этих факторов также соединяются с Hox комплексами, вообще-то контекст-специфическим способом (rev. Mann et al., 2009). Принимая во внимание эти критерии, компоненты Hox комплексов могут, отчасти для простоты, подразделены на три группы: 1. Белки Hox сами по себеs; 2. Кофакторы с ДНК-связывающими доменами, которые взаимодействуют с Hox белками и соединяются с соседними ДНК элементами; 3. Общие факторы, которые не соединяются с ДНК непосредственно, но рекрутируются c помощью Hox белков и/или кофакторов (Fig. 1A). Figure 1.

Hox Proteins

В контексте многокомпонентных комплексов, Hox белки обеспечивают несколько специфических функций. Во-первых, Hox белки ответственны за нахождение комплексов с соотв. регуляторными элементами генов. ДНК связывающие специфичности гомеодомен-содержащих белков недавно были охарактеризованы в деталях (Berger et al., 2008; Noyes et al., 2008), идентифицировано, по крайней мере, 65 различных специфичностей для гомеодоменовых белков мышей и 11 для гомеодоменовых белков у D. melanogaster. Поскольку существует много типов гомеодоменовых белков помимо Hox белков, то первый уровень классификации подразделяет Hox белки на две группы: Abd-B группа (соответствующая группе паралогов 9-13 у хордовых) и на Antp группу, содержащую Hox белки из остальных групп паралогов (rev.Affolter et al., 2008). Однако более тщательная проверка ДНК-связывающих специфичностей выявила, что Hox белки могут быть подразделены и далее на базе их предпочтений к сайтам-мишеням с низким сродством. Следовательно, Hox белки, как семейство, связывает относительно широкий ранг последовательностей ДНК, тем самым позволяя индивидуальным Hox белкам избирательно находить транскрипционные комплексы с разными регуляторными элементами, хотя не совсем ясно, как сайты с низким сродством действуют избирательно in vivo (see next section for a potential role for cofactors in this process). Во-вторых, Hox белки обеспечивают поверхности для взаимодействия, которые рекрутируют дополнительные факторы в комплекс. Напр., Hox белки взаимодействуют с белками семейства Extradenticle (Exd)/Pbx посредством короткого мотива (YPWM), обнаруживаемого на N-конце гомеодомена (Fig. 1B; rev. Mann and Chan, 1996). Этот мотив присутствует во многих Hox белках, а центральный остаток типтофана осуществляет контакт непосредственно с петлёй Exd/Pbx гомеодомена. Некоторые Hox белки, которые лишены мотива YPWM , тем не менее содержат триптофан в сходной позиции, который может участвовать в контакте с Exd/Pbx белками (Shen et al., 1997b). Отметим, что регионы в Hox белках, иные, чем YPWM мотив (такие как гомеодомен и C-терминальные остатки; Chan et al., 1994) также, скорее всего, необходимы для связывания Exd/Pbx, особенно в присутствии Homothorax (Hth)/Meis/Prep факторов (Hudry et al., 2012). Кроме того, некоторые Hox белки взаимодействуют непосредственно с Hth/Meis/Prep факторами (Fig.1B). Такое взаимодействие, по-видимому,ограничивается прежде всего, но не исключительно, Abd-B паралогами (Shen et al., 1997a; Williams et al., 2005) и может быть независимым от консервативного триптофанового мотива, вместо этого необходима N-терминальная последовательность в Hox белке. Hox белки также содержат домены, способные взаимодействовать с компонентами генерального транскрипционного аппарата, также как и с регионами, которые рекрутируют хроматин-модифицирующие энзимы (Fig. 1B). Напр., N-концы некоторых Hox белков соединяются с CBP/p300 ацетилтрансферазами (Chariot et al., 1999; Saleh et al., 2000; Shen et al., 2001; Choe et al., 2009), которые функционируют как коактиваторы c помощью ацетилирования гистонов (Bannister and Kouzarides,1996; Ogryzko et al., 1996) и др. транскрипционных компонентов (напр., p53; Gu and Roeder, 1997). Наконец, недавнее исследования Hoxa1-связываемых белков выявило более сорока взаимодействующих факторов, это подтверждает, что многочисленные дополнительные компоненты рекрутируются на Hox комплексы (Lambert et al., 2012). Следовательно, Hox белки играют центральную роль в нахождении транскрипционных комплексов со специфическими геномными регуляторными элементами, а также в рекрутировании ключевых компонентов таких комплексов.

Безусловно, Hox белки экспрессируются в тканях ограниченным способом, так что любая данная клетка экспрессирует только субнабор Hox белков. Такая упорядоченность, подкрепляемая c помощью Hox белков, активирует или репрессирует каждую из др. состояний экспрессии в виде перекрестно-регуляторных паттернов, также как и c помощью действия микроРНК, нацеленных на Hox транскрипты (rev. Yekta et al., 2008). Тканевое ограничение транскрипции указывает, что Hox функция частично регулируется на уровне транскрипции, гарантируя, что Hox комплексы с определенной специфичностью будут присутствовать только в субпопуляции клеток, хотя имеются также доказательства, что активность Hox может быть модулирована после трансляции (напр., c помощью фосфорилирования; see below). Ограниченная экспрессия Hox белков особенно бросаетсяв глаза во время эмбриогенеза, когда Hox белки обнаруживают ограниченные домены вдоль передне-задней, дорсо-вентральной и проксимо-дистальной осей (rev. Kmita and Duboule, 2003). Напр., Hox белки обнаруживают колинеарную экспрессию вдоль передне-задней оси в том смысле, что Hox гены, расположенные на 3' конце Hox кластеров, экспрессируются раньше и более кпереди, чем гены, расположенные более 5'. Эти домены экспрессии Hox перекрываются, вызывая экспрессию нескольких, Hox генов в одном и том же регионе. В этих случаях, очевидно, что имеется функциональная иерархия, где активность задних Hox белков доминирует на активностью передних. Этот феномен известен как фенотипическая супрессия или заднее доминирование (rev. Duboule and Morata, 1994), механизм его неясен, но может быть связан с тем, что более задние Hox белки конкурируют с передними белками за Exd/Pbx факторы (Noro et al., 2011).Следовательно, тканевое ограничение экспрессии Hox белков, связано с процессами, такими как заднее доминирование, служащее для ограничения функции Hox in vivo.

Cofactors

Факторы, которые взаимодействуют с белками Hox могут быть подразделены на два класса: кофакторы и генеральные факторы (Fig. 1A). Кофакторы связывают ДНК, они содержат гомеодомены хотя и слегка отличающегося типа, чем те, что найдены в Hox белках, и выполняют важные роли в модулировании функции Hox. Существует два типа Hox кофакторов: Extradenticle/Pbx (здесь обозначаемые как PBC белки) и Homothorax/Meis/Prep (здесь обозначаемые как HMP белки).

PBC proteins

Extradenticle (exd) был идентифицирован у Drosophila в виде мутации, которая вызывает гомеотические фенотипы, не влияя на экспрессию Hox генов, указывая, что ген необходим для функционирования Hox (rev. Mann and Chan, 1996). Pbx белки были первоначально открыты как белки слияния, возникающие в результате хромосомных транслокаций, которые вызывали pre-B клеточную лейкемию у человека (rev. Korsmeyer, 1992). Впоследствие, Pbx белки, как было установлено, необходимы для Hox функционирования в некоторых биологических системах (P?pperl et al., 2000; DiMartino et al., 2001; Selleri et al., 2001; Waskiewicz et al., 2002; Manley et al.,2004). Хотя имеется только один exd ген у Drosophila, имеется, по крайней мере, 4 Pbx гена у позвоночных. Анализ последовательностей продемонстрировал, что Exd и Pbx белки являются ортологами. В самом деле, PBC гены, по-видимому, широко законсервированы и обнаружены также у C. elegans (Burglin and Ruvkun, 1992; Burglin, 1997; Van Auken et al., 2002). Анализ последовательностей также выявил присутствие гомеодомена в PBC белках. PBC гомеодомен уникален тем, что содержит дополнительные три аминокислоты в петле между спиралью 1 и спиралью 2. Такое расположение символизирует "three amino acid loop extension" (TALE) подкласс гомеодоменов (Bertolino et al., 1995). Очевидно, что эти дополнительные аминокислоты образуют карман, который необходим для контакта с YPWM мотивом из Hox белков (Passner et al., 1999; Piper et al., 1999) и является, следовательно, важным для взаимодействия между PBC и Hox белками, которые обладают этим мотивом, преимущественно Antp класс Hox белков (Shen et al., 1997b). Pbx также осуществляет контакт с Hox белками посредством дополнительной спирали непосредственно на C-конце гомеодомена PBC и посредством остатка в линкере между гомеодоменом и YPWM мотивом (Piper et al., 1999; Saadaoui et al., 2011). В самом деле, разные способы взаимодействия Hox:PBC могут быть использованы в разных контекстах (Saadaoui et al., 2011).

Взаимодействие с PBC белками является критическим для функции Hox (rev. Mann and Chan, 1996). Во-первых, в нескольких исследованиях было продемонстрировано, что Hox белки соединяются с ДНК с большим сродством в комплексе с PBC белками, чем сами по себе. Фактически, во многих примерах этот эффект выглядит как кооперативный, так что сродство комплекса выше, чем суммарное сродство двух мономеров (Chan et al., 1994; Chang et al., 1995; Popperl et al., 1995). Во-вторых, PBC белки влияют на выбор ДНК мишени белками Hox (Chan et al., 1994; Chang et al., 1996; Lu and Kamps, 1997; Joshi et al., 2007; Slattery et al., 2011). Эта повышенная избирательность обеспечивается, по крайней мере, частично с помощью N-терминального плеча гомеодомена и соседней линкерной области, осуществляющих контакты в малой борозде ДНК. Эти взаимодействия являются, как полагают, предпочтительнее в димерах из-за соединения PBC с YPWM мотивом и фиксации региона N-терминальнее относительно Hox гомеодомена в конформации, благоприятной для контактов с малой бороздой. Напротив, имеются относительно небольшие изменения в предпочтении связывания ДНК с помощью PBC после димеризации Hox белков (Chang et al., 1995; Slattery et al., 2011), в соответствии с тем, что Hox белки вносят вклад в избирательность мишеней, тогда как PBC белки необходимы для полного завершения такой избирательности. В-третьих, PBC белки связывают факторы помимо Hox белков и играют важные роли в рекрутировании таких факторов в Hox транскрипционные комплексы (Fig. 1B). Напр., Pbx связывает histone deacetylases (HDACs) и histone acetyltransferases (HATs) (Saleh et al., 2000; Choe et al., 2009), также как и N-CoR/SMRT корепрессоры (Asahara et al., 1999), подтверждая роль Pbx в регуляции активности Hox транскрипционных комплексов. Дополнительные факторы, взаимодействующие с Pbx, такие как zinc finger Pbx1-interacting protein (ZFPIP; Laurent et al., 2007) и hematopoietic Pbx-interacting protein (HPIP; Abramovich et al., 2000), продолжают выявляться, но их функция пока непонятна. Наконец, имеется несколько сообщений, о Pbx гомодимерах (Neuteboom and Murre, 1997; Calvo et al., 1999), но их потенциальные роли in vivo неясны. Следовательно, PBC белки соединяются с Hox белками, чтобы повлиять на сродство и избирательность последовательностей ДНК мишеней, также как и рекрутируют дополнительные факторы в Hox транскрипционный комплекс. Важно, что PBC белки исполняют эту функцию не только для Hox белков, но и также для др. транскрипционных факторов, таких как Engrailed, Pdx1, Emx2, Smads и MyoD (Peers et al., 1995; Serrano and Maschat, 1998; Knoepfler et al., 1999; Kobayashi et al., 2003; Bailey et al., 2004; Capellini et al., 2010).

Очевидно, что некоторые функции, по-видимому, законсервированы внутри семейства PBC, напр., Drosophila exd может восстанавливать эмбриональное развитие pbx4 мутантных рыбок данио (P?pperl et al., 2000). Однако, не все функции могут быть законсервированы. В частности, некоторые Pbx гены подвергаются альтернативному сплайсингу, приводя к образованию отличающихся изоформ (Nourse et al., 1990; Monica et al., 1991; Milech et al., 2001). В то время как такие изоформы не отличаются по специфичности связывания ДНК, они могут вносить вклад в разные активности транскрипционных комплексов. Напр., изоформа Pbx1a связывает N-CoR/SMRT корепрессоры, а изоформа Pbx1b. которая лишена C-терминального расширения, нет (Fig. 1B; Asahara et al., 1999).

В противоположность Hox генам, чья экспрессия тонко контролируется как в пространстве, так и во времени во время развития и дифференцировки, exd широк экспрессируется у Drosophila , а Pbx гены часто экспрессируются широк и перекрываясь в доменах у позвоночных (Monica et al., 1991; Rauskolb et al., 1993; Roberts et al., 1995; P?pperl et al., 2000; Vlachakis et al., 2000; Maeda et al.,2002). Следовательно, маловероятно, что ограниченная экспрессия PBC представляет собой регуляторную ступень, контролирующую их доступность как кофакторов для Hox. Однако, имеются доказательства, что как ядерная локализация, так и стабильность белков PBC факторов контролируются посредством взаимодействий с др. факторами, такими как Hth/Meis/Prep (Aspland and White, 1997; Rieckhof et al., 1997; Pai et al., 1998; Abu-Shaar et al.,1999; Berthelsen et al., 1999; Vlachakis et al., 2001; Waskiewicz et al., 2001), а ядерная локализация гена Pbx регулируется также с помощью PKA-обеспечиваемого фосфорилирования (Kilstrup-Nielsen et al., 2003), подтверждая, что доступность PBC может контролироваться после трансляции.

HMP proteins

Второе семейство Hox кофакторов состоит из Homothorax, Meis и Prep белков. Эти белки также принадлежат семейству TALE, но образуют подгруппу, отличающуюся от PBC белков. Ортолог Drosophila известен как homothorax (hth; Rieckhof et al., 1997) и ортологи генов также обнаружены у C. elegans (Burglin, 1997; Van Auken et al., 2002). Как и в случае с exd, разрушение hth вызывает гомеотический фенотип без вовлечения экспрессии Hox генов (Rieckhof et al., 1997). Meis гены были первоначально идентифицированы как протоонкогены, коактивируемые с Hox генами при лейкемии (Moskow et al., 1995; Nakamura et al.,1996b), тогда как белки Prep были открыты как транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию гена urokinase plasminogen activator (Berthelsen et al.,1998b). Последующий анализ выявил существование трех генов Meis у позвоночных (Meis1, 2, 3; (Nakamura et al., 1996a); четырех у рыбок данио; Waskiewicz et al.,2001) и двух генов Prep у позвоночных (Prep1, 2; Imoto et al., 2001). Многими было продемонстрировано, что HMP белки образуют комплексы с PBC и Hox белками (rev. Mann and Affolter, 1998).В частности, HMP белки взаимодействуют с PBC белками посредством консервативных доменов на N-концах HMP и белков семейства PBC (Fig. 1B; Chang et al., 1997; Knoepfler et al., 1997; Berthelsen et al., 1998a, 1999; Abu-Shaar et al., 1999; Jaw et al., 2000; Vlachakis et al., 2001). Поскольку PBC:HMP димеры, как было установлено, формируются на регуляторных элементах in vitro (e.g., Berthelsen et al., 1998b; Bischof et al., 1998) и такие димеры могут функционировать in vivo, они не будут рассматриваться здесь далее, поскольку они д. действовать независимо от Hox комплексов. Meis/Prep белки также способны связывать некоторые, но не все Hox белки. В частности, Meis белки взаимодействуют непосредственно с Hox белками класса Abd-B (группы паралогов 9-13) посредством C-терминального домена, содержащего Meis гомеодомен (Shen et al.,1997a). Напротив, Meis белки не взаимодействуют с классом Antp белков Hox (группы паралогов 1-8), по крайней мере не при тестировании с помощью gel shift (Shen et al.,1997a; Williams et al., 2005). Как обсуждалось выше, Pbx белки, по-видимому, имеют комплементарный паттерн Hox взаимодействий, так что Pbx связывают Antp, но не Abd-B класс Hox белков (Shen et al., 1997b). Поскольку PBC и HMP белки взаимодействуют др. с др. посредством N-терминальных доменов, в то же время оба семейства взаимодействуют с Hox белками посредством остатков внутри или вблизи их гомеодоменов, это объясняет, что HMP:PBC:Hox комплексы могут формироваться. В самом деле, многочисленные исследования продемонстрировали существование таких тримерных комплексов (Berthelsen et al., 1998a; Jacobs et al., 1999; Ryoo et al., 1999; Shanmugam et al., 1999; Shen et al., 1999; Ferretti et al., 2000; Vlachakis et al.,2000), а ChIP эксперименты идентифицировали присутствие всех трех семейств белков на Hox-регулируемых энхансерах в развивающихся эмбрионах (Choe et al., 2009; Penkov et al., 2013). Поскольку все Hox белки, по-видимому, взаимодействуют или с PBC или HMP белками, то формально возможно, что Hox белки из всех групп паралогов действуют в таких тримерных комплексах, но это не было исследовано подробно.

HMP необходимы для функционирования Hox в нескольких контекстах (Rieckhof et al.,1997; Jacobs et al., 1999; Ferretti et al., 2000; Waskiewicz et al., 2001; Choe et al.,2002). Однако, HMP белки, по-видимому, не модифицируют специфичность связывания с ДНК Hox, как это делают PBC белки. Вместо этого, HMP могут модулировать функцию Hox косвенно путем регуляции стабильности и ядерной локализации PBC, как обсуждалось выше (Aspland and White, 1997; Rieckhof et al., 1997; Pai et al., 1998; Abu-Shaar et al., 1999; Berthelsen et al., 1999; Vlachakis et al., 2001; Waskiewicz et al., 2001), а также путем модулирования взаимодействия между PBC и Hox белками (Hudry et al., 2012). Как и в случае PBC белков, HMP белки могут также регулировать поставки транскрипционных корегуляторов (Fig. 1B). В частности, Pbx:Hox комплексы связывают HDACs и репрессируют транскрипцию, по крайней мере, при некоторых условиях (Saleh et al., 2000). Эта репрессия может быть преодолена путем блокирования активности HDAC (с помощью TSA) или с помощью включения белков Meis (Saleh et al., 2000; Huang et al., 2005; Choe et al., 2009), подтверждая, что Meis белки функционируют, противодействуя активности HDAC. В самом деле, Meis белки конкурируют с HDAC за соединение с Pbx , так что в присутствии Meis, HDACs вытесняются из комплекса (Choe et al., 2009). Кроме того, Meis1 белок содержит C-терминальный домен активации, который активируется с помощью передачи сигналов PKA и/или GSK-3, чтобы взаимодействовать с TORC и CBP (Huang et al., 2005; Goh et al., 2009; Wang et al., 2010). Следовательно, HMP белки могут действовать, контролируя рекрутирование корегуляторов в комплексы Hox, модулируя тем самым функцию этих комплексов.

Два Prep гена экспрессируются пости повсеместно (Ferretti et al., 1999; Imoto et al., 2001; Waskiewicz et al., 2001), подобно Pbx генам, а hth is широко экспрессируется у Drosophila (Rieckhof et al., 1997). Кроме того, поскотьку экспрессия генов Meis ограничена в пространстве и во времени (Nakamura et al., 1996a; Waskiewicz et al., 2001), то имеются множественные Meis гены (три у позвоночных, за исключением 4-х у рыбок данио), то предполагается, что большинство клеток экспрессирует или один или несколько Meis/Prep белков. Имеется мало сообщений о функциональных отличиях между Meis и Prep белками, напр., Meis1 ускоряет HoxA9-зависимую лейкемию (Thorsteinsdottir et al., 2001) и реагирует на передачу сигналов PKA (Huang et al., 2005), но Prep1 так не действует. Однако в др. исследованиях Meis и Prep белки выглядели неотличимыми (Choe et al., 2002). Существуют также функциональные отличия среди белков Meis. В частности, С-конец Meis обладает доменом активации (Huang et al., 2005; Goh et al., 2009). C-терминальные последовательности варьируют существенно между членами семейства Meis, но Meis3 рыбок данио (с укороченным C-концом) тем не менее способен функционировать как кофактор Hox, чтобы активировать транскрипцию (Vlachakis et al., 2001; Choe et al., 2009). Следовательно, члены семейства Meis/Prep могут отличаться по некоторым функциональным свойствам, но также обладают общими ключевыми свойствами. Hox комплексы, которые содержат различных членов семейства Meis/Prep, могут, следовательно, обладать многими общими активностями, но могут также иметь некоторые самостоятельные функции, что подтверждается геномными ChIP данными (Penkov et al., 2013).

Наконец как в случае PBC белков, HMP белки действуют как кофакторы не только для Hox белков, но и для др. транскрипционных факторов, таких как MyoD и Engrailed (Kobayashi et al., 2003; Berkes et al., 2004).

General Factors

Второй класс факторов, которые ассоциируют с Hox комплексами, выполняет более общие роли в транскрипции. Большинство из этих факторов отличается от кофакторов PBC и HMP тем, что у них отсутствуют ДНК-связывающие домены , следовательно, д. рекрутироваться в Hox комплексы исключительно посредством межбелковых взаимодействий. В целом, эти факторы экспрессируются повсеместно и поэтому доступны для поставки в Hox комплексы в большинстве типов клеток. Эта группа факторов включает хроматин-модифицирующие энзимы, упоминаемые ранее. В особенности, Hox и Pbx белки взаимодействуют с CBP (Chariot et al.,1999; Saleh et al., 2000; Shen et al., 2001; Choe et al., 2009), как это делает и Meis1 (Huang et al., 2005; Wang et al., 2010), но безусловно не Meis3 (Choe et al.,2009). CBP действут как histone acetyltransferase (HAT), которая ацетилирует нуклеосомы, способствуя тем самым открытию хроматина и облегчая транскрипцию (Goodman and Smolik, 2000). CBP может также ацетилировать негистоновые белки, но нет доказательств, что ацетилирование компонентов Hox комплексов влияет на активность комплексов. Кроме того, Pbx белки взаимодействуют с HDAC1 и HDAC3 корепрессорами, или непосредственно или посредством NCoR/SMRT, (Asahara et al., 1999; Saleh et al., 2000; Choe et al., 2009). HDACs действуют как гистоновые деацетилазы в противоположность активности CBP, репрессируя тем самым транскрипцию. Рекрутирование корепрессоров, по-видимому, обеспечивается с помощью N- и C-терминальных доменов в Pbx (Asahara et al., 1999; Saleh et al., 2000), тогда как коактиватор CBP взаимодействует с N-терминальными доменами активации в белках Hox и с C-терминальным доменом в Meis1 (Chariot et al., 1999; Saleh et al., 2000; Huang et al., 2005; Goh et al., 2009).

Важно, что эти коактиваторы и корепрессоры сами по себе обнаруживаются как части крупных регуляторных комплексов. Напр., HDAC1 является частью Sin3, NuRD и CoREST комплексов, тогда как HDAC3 является частью NCoR/SMRT комплекса (rev. Hayakawa and Nakayama, 2011). Хотя эксперименты исследовали только рекрутирование индивидуальных коактиваторов и корепрессоров, но очень вероятно, что они рекрутируются как компоненты крупных комплексов, которые вносят вклад в дополнительные активности. Напр., и NuRD и CoREST комплексы содержат энзимы, которые регулируют позиционирование и модификации нуклеосом (Tong et al., 1998; Xue et al., 1998; Shi et al., 2004).

В конечном итоге RNA Polymerase II д. быть рекрутирована на Hox-регулируемые промоторы и активировать их для управления транскрипции. Как и в др. системах, это, скорее всего, сопровождается рекрутированием комплекса Mediator (rev. Conaway and Conaway, 2011). Mediator обычно рекрутируется на энхансеры с помощью последовательностей специфичных транскрипционных факторов и Mediator затем перебрасывает мостик на дистанцию к точке старта транскрипции, где он облегчает загрузку RNA Polymerase II. Следовательно, очевидно, что Hox, PBC и/или HMP белки рекрутируют Mediator. Однако, взаимодействия между этими факторами и Mediator tit не были достаточно охарактеризованы и пока неясно, как рекрутирование и активность Mediator регулируется с помощью Hox транскрипционных комплексов.

ARE THERE MULTIPLE TYPES OF HOX TRANSCRIPTION COMPLEXES WITH UNIQUE SUBUNIT COMPOSITION?

Сравнение между Hox белками выявило высокую изменчивость вне гомеодомена (rev. Sharkey et al., 1997), указывающую, что каждый Hox белок или, по крайней мере, каждая группа паралогов Hox, может взаимодействовать с уникальным набором факторов. Более того, количество известных Hox-взаимодействующих факторов велико и всё увеличивается, это делает маловероятным, что все эти факторы взаимодействуют с Hox комплексами одновременно. В самом деле, как обсуждалось выше, известны случаи, когда два фактора использовали одно и то же место взаимодействия в Hox комплексе, так что только один из факторов может быть связа о определенный момент времени (Choe et al., 2009). Следовательно, разнообразие последовательностей Hox белков и конкуренция между взаимодействующими факторами указывают на то, что, скорее всего, существуют множественные содержащие Hox комплексы, которые отличаются составом своих субъединиц.

Variations in Hox Complex Composition

По определению, каждый Hox транскрипционный комплекс должен содержать Hox белок. Как отмечалось выше, Hox белки обеспечивают специфичность связывания ДНК и являются поэтому ответственными за нахождение правильного регуляторного элемента. Поскольку Hox белки связывают ДНК плохо в виде мономеров, то, скорее всего, по крайней мере, один кофактор д. также участвовать в каждом Hox транскрипционном комплексе. PBC белки являются наиболее вероятными кандидатами в этом отношении, поскольку их роль заключается в улучшении сродства и специфичности связывания Нох с ДНК (Mann and Chan, 1996; Slattery et al., 2011). Возможно, что комплексы, содержат Hox белок вместе с кофактором из семейства HMP, но и в отсутствие PBC кофактора, существуют, особенно потому, что некоторые Hox белки, по-видимому, лишены сайтов взаимодействия с PBC белками (Shen et al., 1997b), но мало прямых доказательств, что такие комплексы выполняют функциональные роли in vivo. Значит, Hox белок вместе с кофактором PBC может представлять собой минимальный набор стержневых компонентов, общих всем Hox транскрипционным комплексам. Заметим, имеется, скорее всего, некоторая изменчивость среди комплексов уже на этом уровне, поскольку существуют множественные члены семейства Pbx, которые также могут подвергаться альтернативному сплайсингу (as discussed above).

Тримерные комплексы, состоящие из Hox, PBC и HMP белков, как известно, формируются в некоторых контекстах и необходимы для транскрипции некоторых регулируемых Hox генов (Berthelsen et al., 1998a; Jacobs et al., 1999; Ryoo et al., 1999; Shanmugam et al., 1999; Shen et al., 1999; Ferretti et al., 2000; Vlachakis et al., 2000). Следовательно, возможно единственное отличие между Hox транскрипционными комплексами, зависящее от присутствия одного (PBC) или двух (PBC и HMP) кофакторов в комплексе. Т.к. PBC и HMP кофакторы взаимодействуют с разными общими факторами, то комплексы, которые отличаются по составу кофакторов, д. в дальнейшем дифференцированно рекрутировать разные генеральные факторы. Фактически, состав комплексов может становиться очень сложным, если принимать во внимание, что один кофактор может взаимодействовать со многими общими факторами (напр., Pbx белки соединяются с HDAC и CBP; Saleh et al., 2000; Choe et al., 2009), или компоненты комплексов могут рекрутировать генеральные факторы с противоположными активностями, напр., Pbx кофакторы рекрутируют HDACs (Saleh et al., 2000) тогда как Hox белки рекрутируют CBP (Chariot et al., 1999; Saleh et al., 2000; Shen et al., 2001; Choe et al., 2009).

Regulation of Hox Complex Composition

Принимая во внимание разные типы Hox комплексов, очень вероятно появление, скорее всего, регуляторных механизмов, гарантирующих присутствие или активность только субнабора из всех возможных взаимодействующих факторов. На сегодня не описано случаев, где бы фактор присутствовал в Hox комплексе, но его ферментативная активность была бы супрессирована, хотя это вполне возможный механизм для контроля активности Hox комплексов. Напротив, имеются доказательства конкуренции между факторами за включение в Hox комплексы. Так, Meis белки конкурируют с HDACs за соединение с Pbx белками, что было продемонстрировано на клеточных линиях и у эмбрионов рыбок данио (Choe et al., 2009), подтверждая, что Hox комплексы. содержащие Meis белки, лишены активности HDAC. Более того, когда передние и задние Hox белки совместно экспрессируются, то задние, скорее всего, будут формировать комплексы с Exd на последовательностях мишенях у Drosophila, приводя к функционированию задних Hox, доминирующему на более передними Нох (Noro et al., 2011). Такой пример конкуренции между компонентами Hox комплексов указывает на то, что относительные концентрации и сродство связывания различных факторов могут диктовать точный состав каждого комплекса, но ни один из этих параметров не известен для компонентов любого из Hox комплексов.

На простейшем уровне, следовательно, формирование комплексов д. регулироваться путем контроля присутствия каждого фактора. Однако, исключая Hox белки, большинство компонентов Hox комплекса экспрессируется очень широко или как в случае белков Meis, имеются множественные члены семейства со сравнимыми активностями. Как результат, любая данная клетка, скорее всего, экспрессирует наиболее мощные компоненты Hox комплексов. По этой причине, кажется маловероятным, что тканеспецифичная экспрессия генов является важным механизмом в регуляции композиции Hox комплекса. Напротив, имеются доказательства регуляции на уровне субклеточной локализации, по крайней мере, в случае кофакторов (Fig. 2). В частности, PBC белки обнаруживаются в цитоплазме некоторых типов клеток (напр., Drosophila эмбрионы и Schneider клетки), по-видимому, в результате активного ядерного экспорта посредством зависимого от exportin-1 механизма (Rieckhof et al., 1997; Pai et al.,1998; Abu-Shaar et al., 1999; Berthelsen et al., 1999), хотя также возможно, что PBC белки сохраняются в цитоплазме благодаря взаимодействиям с не-мышечным миозином (Huang et al., 2003). PBC белки локализуются в ядре после взаимодействия с HMP факторами, скорее всего, как результат этого взаимодействия, блокирующего PBC nuclear export signal (NES), но локализация PBC также зависит от PKA-обусловленного фосфорилирования (Kilstrup-Nielsen et al., 2003). Сходным образом, HMP белки располагаются в цитоплазме многих типов клеток (напр., NIH3T3, COS7, HeLa клетки и у эмбрионов рыбок данио) и проникают в ядро после взаимодействия с PBC факторами (Berthelsen et al., 1999; Vlachakis et al., 2001). Следовательно, и PBC и HMP белки, как полагают, располагаются в ядре клеток, которые совместно экспрессируют кофакторы из обеих семейств. Взаимная зависимость PBC и HMP белков для ядерной локализации д. , по-видимому, исключать образование ядерных Hox комплексов, содержащих только один кофактор. Однако, Exd является ядерным в некоторых тканях Drosophila, а Pbx является ядерным в некоторых клеточных линиях млекопитающих, также как у эмбрионов рыбок данио, очевидно независимо от HMP взаимодействий (Rieckhof et al., 1997; Berthelsen et al., 1999; Vlachakis et al.,2001; Choe et al., 2002), указывая, что PBC факторы могут вступать с ядро с помощью множественных механизмов и подтверждая существование Hox транскрипционных комплексов, содержащих PBC, но не HMP, белки. Соотв., ядерная локализация является правдоподобным механизмом для регуляции включения кофакторов в Hox комплексы. Поскольку такая регуляция может иметь определенные преимущества, напр., быстрый контроль образования комплексов без необходимости в трансляции белков, это, тем не менее, представляет довольно грубый регуляторный подход. В частности, имеется, скорее всего, множество различных Hox комплексов, действующих в клетке в данный момент времени и все эти комплексы д. затрагивается, если кофактор сохраняется в цитоплазме. Следовательно, регуляция ядерной локализации может быть использована в качестве ключевой онтогенетической ступени, когда инициируется дифференцировка ткани, но, по-видимому, вряд ли это обеспечивает тонкий контроль состава индивидуальных Hox комплексов. Figure 2.

Также возможно, что состав комплексов регулируется на уровне сборки (Fig. 2). Напр., Antennapedia (Antp) Hox белок может быть фосфорилирован с помощью casein kinase II (CKII; Jaffe et al., 1997). Когда консенсусные CKII сайты мишени мутируют в glutamic acid (имитирует фосфорилирование), то Antp существенно страдает в отношении своей способности взаимодействовать с Exd (Jaffe et al., 1997), подтверждая, что фосфорилирование влияет на сборку Hox комплексов. Кроме того, ассоциация между CREB и Meis, регулируемая с помощью GSK-3 обеспечивает фосфорилирование CREB (Wang et al., 2010). Имеется мало доказательств для др. ковалентных модификаций компонентов Hox комплексов, очевидно, что такие модификации имеют место, напр., Hox и Pbx белки взаимодействуют с acetyl transferases, и что они модифицируют сборку Hox комплексов.

Образование комплексов может также контролироваться с помощью композиции сайтов мишеней (Fig. 2). Напр., данный регуляторный элемент ДНК может отсутствовать в сайте связывания для одного из кофакторов, тем самым образование специфических комплексов или ориентация сайтов связывания могут накладывать ограничения на Hox комплекс так, что определенные субъединицы не могут быть включены. Однако это проблематично сделать вывод о типе формируемого комплекса, особенно о регуляторном элементе из этих сайтов, представленных в этом элементе. Во-первых, иногда трудно реально определить сайты связывания с помощью анализа последовательностей. В самом деле, некоторые элементы, первоначально описанные как содержащие только Hox и Pbx сайты, как было показано впоследствии, содержат также сайты Meis/Prep (напр., Popperl et al., 1995; Ferretti et al., 2000). Во-вторых, HMP кофакторы могут участвовать в Hox комплексах, не контактируя с ДНК. Напр., HMP-содержащие комплексы могут формироваться на местах, лишенных Hth, Meis или Prep сайтов связывания, конструкции HMP, лишенные их гомеодоменов, могут всё ещё включаться в комплексы, хотя образование таких комплексов иногда менее эффективно (Berthelsen et al., 1998a; Ryoo et al., 1999; Shanmugam et al., 1999; Vlachakis et al., 2000, 2001).

Следовательно, скорее всего, имеются множественные типы Hox транскрипционных комплексов с уникальной композицией субъединиц, но механизмы, с помощью которых регулируется состав субъединиц, только начинает проясняться.

DO DIFFERENT COMPLEXES HAVE DIFFERENT ACTIVITIES?

Возможное существование Hox транскрипционных комплексов с уникальным составом субъединиц открывает вероятность, что такие комплексы могут отличаться в терминах свой активности и активность комплексов может динамически регулироваться за счет альтераций в составе субъединиц. Интересно отметить, что ранний функциональный анализ показал, что Hox белки могут или активировать или репрессировать транскрипцию (rev. Hayashi and Scott, 1990). Фактически, в некоторых случаях один и тот же Hox белок функционирует как активатор или репрессор в зависимости от контекста эксперимента, как в случае ultrabithorax (Krasnow et al., 1989; Vachon et al., 1992; Capovilla et al., 1994; Galant and Carroll, 2002). Потенциальное объяснение этим наблюдениям начинает возникать по мере открытия кофакторов. В частности, исследователи установили, что в некоторых случаях Hox активность изменяется, когда Hox белки взаимодействуют с белками PBC (Pinsonneault et al., 1997). Этот эффект сохраняется при условиях, при которых PBC белки не были нужны для облегчения связывания Hox белков с ДНК (Li et al., 1999), подтверждая, что формирование комплексов может менять активность Hox независимо от связывания ДНК.

Поскольку имеются, скорее всего, множественные пути для переключения между репрессированием и активированием Hox транскрипционных комплексов, данные недавних сообщений, по-видимому, сходятся на общем расположении к одному возможному механизму (Fig. 3). В частности, некоторые сообщения показывают, что комплексы, содержащие Hox и Pbx неспособны активировать транскрипцию в некоторых контекстах. Напр., эксперименты по котрансфекции в клеточных линиях выявили, что Hox и Pbx не могут активировать экспрессию репортерной конструкции, содержащей Hox-регулируемый элемент из промотора hoxb1 (Saleh et al., 2000; Choe et al., 2009). Сходным образом, неправильная экспрессия Hoxb1b и Pbx не активирует эктопическую экспрессию hoxb1a вне заднего мозга у рыбок данио (Vlachakis et al., 2001). По крайней мере, в этом аспекте кажется, что Hox:Pbx комплексы не являются неактивными, а активно репрессируют транскрипцию путем рекрутирования корепрессоров (Saleh et al., 2000; Choe et al., 2009). Отметим, что не все Hox:Pbx комплексы могут действовать как репрессоры, учитывая факт, что Pbx белки существуют во многих сплайс-формах, причем некоторые из форм взаимодействуют с корепрессорами, тогда как др. нет (Asahara et al., 1999; Saleh et al., 2000), вместе с фактом, что Pbx может связывать CBP коактиваторы (Choe et al., 2009), подтверждается, что некоторые Hox:Pbx комплексы могут быть активаторами. Важно однако, что репрессивные Hox:Pbx комплексы могут быть превращены в активирующие комплексы путем обработки клеток trichostatin A (TSA; ингибитором HDAC) или ретиноевой кислотой (RA), или с помощью стимуляции путей PKA или GSK-3 (Saleh et al., 2000; Huang et al., 2005; Goh et al., 2009; Wang et al., 2010). Как обсуждалось выше совместная экспрессия Meis белков также превращает Hox:Pbx комплексы в активаторы путем удаления HDACs (Choe et al., 2009). Эти наблюдения могут быть скомбинированы в модель превращений между репрессивными и активирующими комплексами (Fig. 3). Комплекс Hox:Pbx д. быть репрессивным благодаря рекрутированию NCoR/SMRT и HDAC корепрессоров. Воздействие TSA д. репрессировать активность HDAC, позволяя комплексу поддерживать транскрипцию, возможно с помощью др. факторов, таких как CBP. Напротив, RA, GSK-3 и/или PKA пути могут действовать посредством Meis белков, чтобы создавать активирующие комплексы. В частности, RA индуцирует экспрессию Meis (Oulad-Abdelghani et al., 1997), тогда как передача сигналов PKA и GSK-3 способствует CBP-опосредуемой активации транскрипции посредством Meis C-конца (Huang et al., 2005; Goh et al., 2009; Wang et al., 2010). Следовательно, конечным результатом процесса превращения д. быть вытеснение корепрессоров и рекрутирование коактиваторов. Пока неясно, почему все три сигнальные пути необходимы одновременно. Напр., клетки, которые уже экспрессируют Meis могут не нуждаться в передаче сигналов RA. В зависимости от типа клеток, также возможно, что пути, иные, чем PKA или GSK-3, могут действовать, чтобы регулировать функцию Meis. Наконец, неясно, как широко распространена эта модель и возможно, что разные гены мишени регулируются разными способами, но примечательно, что HMP белки необходимы для экспрессии некоторых хорошо изученных Hox-регулируемых промоторов (Jacobs et al., 1999; Ryoo et al., 1999; Ferretti et al., 2000; Vlachakis et al., 2001), подтверждая, что HMP факторы могут обычно ассоциировать с активирующими Hox комплексами. В результате кажется, что композиция из субъединиц непосредственно влияет на функцию Hox транскрипционных комплексов, хотя взаимоотношения между композицией и функцией ещё определены не полностью. Figure 3.

Эти находки также ставят вопрос, как изменения в составе субъединиц могут изменять функцию комплекса. В случае Hox:PBC комплексов функциональное переключение, вызываемое Meis белками, конкурирует с HDACs за соединение с Pbx N-концом (Choe et al., 2009). В отсутствие Meis кофакторов, HDAC связан с Pbx и комплекс оказывается репрессивным, но в присутствии Meis белков, Meis ассоциирует с Pbx, а HDAC вытесняется. Более того, когда HDAC вытесняется, то CBP (гистоновая ацетилтрансфераза) может ассоциировать с комплексом Hox:Pbx:Meis и способствовать транскрипции. Сходный процесс замещения был обнаружен для Otx2 гомеодоменового белка, где Meis2 вытесняет Tle4 репрессор (Agoston and Schulte, 2009), подтверждая, что это может быть генеральным механизмом контроля активности транскрипционного комплекса. Однако легко можно представить себе др. механизмы для достижения того же результата, напр., модификации субъединиц за счет ковалентных модификаций, таких как фосфорилирование (Galant and Carroll, 2002; Ronshaugen et al., 2002) или ацетилирование, могут влиять на их активность и, скорее всего, что такие альтернативные механизмы будут обнаружены.

Наконец, важно иметь ввиду, что большинство генов контролируется множественными регуляторными элементами, каждый из которых воспринимает разные импульсы, часто посредством разных сигнальных путей. Т.о., эффект Hox комплексов, действующий на один из таких регуляторных элементов д. быть интегрирован с эффектами др. факторов, действующих на соседние регуляторные элементы, чтобы контролировать активность гена в целом. Фактически имеются многочисленные примеры, где Hox-регулируемые гены получают импульсы от нескольких сигнальных путей ( rev. Mann et al.,2009).

PERSPECTIVES

Several important questions remain with regards to the composition and function of Hox transcription complexes. First, we still do not know the exact composition of even one Hox-transcription complex and it is, therefore, difficult to study the function and regulation of such complexes. It would be useful to identify all components of a complex under well-defined conditions, perhaps by purification from cell lines followed by mass spectrometry analysis. Second, it would be informative to compare the composition of two closely related complexes that have different activity, e.g., two complexes that contain the same Hox protein, but that function either as an activator or a repressor, to understand which components are responsible for imparting a specific activity. Third, a system for reconstitution of Hox complex function would allow the identification of a minimal set of factors required for each function. While these approaches rely on biochemical purification strategies to identify novel complex components, candidates can also be identified by protein interaction screens (as recently reported for Hoxa1; Lambert et al., 2012), or genetic screens, followed by functionally characterization to determine if they act in Hox-complexes.

Hox regulation of transcription: More complex(es) Franck Ladam, Charles G. Sagerstrom Developmental Dynamics 243:4-15, 2014

Hox regulation of transcription: More complex(es)
Franck Ladam, Charles G. Sagerstrom
Developmental Dynamics 243:4-15, 2014