Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) в действии: на ст.14 эмбрионы Drosophila экспрессируют как Hox белок AbdA, слитый с одной половинкой флюоресцентного белка Venus, так и PBC белок Exd, слитый с др. половинкой. Зелёная флюоресценция обнаруживается, когда in vivo взаимодействия между AbdA и Exd сводят обе половинки Venus вместе, чтобы восстановить интактный флюоресцентный белок. Одной из самых ранних ступеней эмбриогенеза животных связано со становлением качественных особенностей эмбриональных структур и тканей с головы до хвоста вдоль передне-задней оси. Hox гены кодируют семейство белков, которые выполняют важную и сильно законсервированную роль в закладке онтогенетической дорожной карты у большинства животных.

Уже некоторое время ощущалось, что функция Hox довольно хорошо изучена: которая аминокислотная последовательность в Hox белках, наз. hexapeptide (HX) мотив управляет формированием комплекса между Hox и белком из второго семейства, наз. PBC. Такие Hox/PBC комплексы соединяются с ДНК, чтобы регулировать экспрессию мириадов др. генов, при этом различные комбинации белков Hox/PBC оказывают разные эффекты на экспрессию генов в разных областях эмбриона. Однако, Bruno Hudry, Samir Merabet с коллегами в данном номере PLoS Biology, показали, что HX мотив в действительности не нужен всем Hox белкам для образования Hox/PBC комплексов-вместо этого, как правило, действует альтернативный способ взаимодействия.

HX мотив безусловно необходим для собственно функции Hox in vitro, поскольку более ранние исследования показали, что если он мутантен, то Hox белки оказывались неспособными формировать комплексы с PBC. Однако, вто время как эти находки подтверждали, что Hox белки с мутантными HX мотивами д. нарушать эмбриональное развитие, но недавние исследования оказались неспособны подтвердить это ожидание. Это расхождение и побудило Hudry с коллегами провести систематические исследования важности HX мотива для образования функциональных комплексов Hox белков у многих видов.

Чтобы проверить важность HX мотива, Hudry et al. использовали подход, наз. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). При BiFC, флюоресцентный белок, такой как GFP, делится на две части, которые помещают на два др. белка, чьё взаимодействие тестируется. Если эти два белка соединяются др. с др., тогда фрагменты флюоресцентного белка воссоединяются, делая возможной флюоресценцию. Соотв., Hudry с коллегами сливали одну половинку флюоресцентного белка с каждым Hox белком, желая протестировать, др. половинку на PBC партнере, и экспрессировали оба слитых белка в клетках или эмбрионах. Затем они попытались установить будет ли флюоресценция служить показателем взаимодействия между Hox и PBC белками.

Как и ожидалось, дикого типа Hox белки соединялись с PBC in vivo и вызывали флюоресценцию. Однако тогда как ранние исследования in vitro подтвердили, что мутации в HX мотиве д. устранять Hox/PBC взаимодействия (а значит и флюоресценцию), но вместо этого авт. установили, что флюоресценция оставалась неизменной для большинства тестированных мутантных по HX белков Hox. Это было верным для белков. тестированных от мух и мышей и подтверждало, что существует альтернативный независимый от HX способ взаимодействия, когда Hox белки экспрессируются в клетках в противовес результатам, полученным in vitro.

Как объяснить такое поведение? Hudry и коллеги задались вопросом, не присутствует ли в клетках некий кофактор, который отсутствует в исследованиях in vitro, и который мог бы способствовать независимым от HX взаимодействиям Hox/PBC. Их подозрения сразу упали на Meis, белок, который, как известно, участвует в трехкомпонентных комплексах с Hox и PBC. Meis, как полагают, модулирует регуляторные функции Hox генов, и версии Meis оказались эволюционно законсервированы во всем животном царстве, делая его, скорее всего, виновником. Исследователи предположили, что Meis белки присутствуют в клетках и эмбрионах (но отсутствуют в in vitro экспериментах, проведенных до сих пор) и могут быть способны облегчать образование комплексов Hox/PBC, когда HX мотив мутантен.

Следующей ступенью д. быть тестирование способности Meis способствовать HX-независимому формированию комплекса Hox/PBC, поэтому авт. возвратились к экспериментам in vitro, используя очищенные Hox, PBC и Meis белки. Их эксперименты показали, что в отсутствие Meis большинство Hox тестируемых белков нуждается в интактных HX мотивах для образования комплексов с PBC in vitro. Однако, если присутствовал Meis, то оказывалось, что HX мотив необязателен (трехсоставные комплексы, содержащие Hox, PBC и Meis, могут формироваться даже, если HX мотивы Нох белков мутантны). Лишь немногие из протестированных Hox белков обнаруживают абсолютную необходимость в HX мотиве.

Способность Meis способствовать образованию независимо от HX комплексов, по-видимому, законсервирована широко; авт. обнаруживали эту активность, когда они сравнивали эквивалентные Hox белки у мух, мышей и даже морских анемон. Более того, авт. установили, что некоторые Hox белки не нуждаются ни в Meis, ни в HX мотиве, чтобы формировать комплексы с PBC, вместо этого комплексы образуются на базе др. доменов в Hox белке. Итак, эти результаты разрешают ранее кажущиеся противоречивые находки о роли HX мотива, и открывают новые перспективы.

Hudry B, Remacle S, Delfini M-C, Rezsohazy R, Graba Y, et al. (2012) Hox Proteins Display a Common and Ancestral Ability to Diversify Their Interaction Mode with the PBC Class Cofactors. doi:10.1371/journal. pbio.1001351