Во время эмбриогенеза онтогенетические события контролируются изменениями экспрессии генов. Соотв. экспрессии в пространстве и во времени обеспечивают формирование паттерна, процесс, при котором клетки становятся последовательно специфицированными и дифференцируются, чтобы сформировать морфологические структуры. Результат транскрипции гена или субнабора генов в клетке или группе клеток регулируется на множественных уровнях, включая взаимодействия между промотором, энхансером, транскрипционными факторами, эпигенетическими модификаторами и некодирующими РНК.

Открытие кластера Hox у Drosophila выявило удивительное соответствие между физическим порядком генов в Hox кластере и их доменами экспрессии вдоль эмбриональной передне-задней (A-P) оси, феномен, известный как пространственная колинеарность (Lewis, 1978). Последующие исследования ортолгов Hox комплексов выявили консервативность пространственной колинеарности у позвоночных и кроме того показали, что Hox гены последовательно активируются во времени с 3' по 5' конец кластера (временная колинеарность) (Gaunt et al., 1986, 1989; Dolle et al., 1989; Duboule and Dolle, 1989; Graham et al., 1989; Izpisua-Belmonte et al., 1991). Пространственный и временной контроль экспрессии Hox генов важен для формирования паттерна плана тела позвоночных; пока механизм, лежащий в основе пространственной и временной "colinearity" остается в основном неизвестным. После инициальной активации домены пространственной экспрессии каждого Hox гена всё более уточняются и в дальнейшем поддерживаются во время эмбрионального развития посредством механизмов, которые, скорее всего, варьируют между тканями. Возникающие в результате домены пространственной экспрессии или дифференциальные качественные и количественные комбинации разных продуктов генов Hox вдоль оси (referred to as the "HOX Code") оказываются существенными для формирования паттерна развивающихся эмбрионов (Kessel and Gruss, 1991). Следовательно, выяснение механизмов, с помощью которых пространственные домены Hox устанавливаются и поддерживаются, является важным для понимания эмбрионального развития и болезней.

Генетический анализ у мышей подтверждает, что цис-регуляторные элементы могут участвовать в последовательной активации Hox генов от 3' к 5' (Kmita et al.,2002; Spitz et al., 2003; Deschamps, 2007). Последующие посттрансляционные модификации гистонов, т.e., от специфического замалчивания транскрипции к специфическим активным формам, также коррелируют с последовательной активацией генов (Soshnikova and Duboule, 2009). Более того, было предположено, что изменения организации хроматина высшего порядка, напр., деконденсация хроматина (Noordermeer and Duboule, 2013) и петлеобразование хромосомных территорий, вносят вклад в последовательную активацию Hox генов (Chambeyron and Bickmore, 2004; Chambeyron et al., 2005; Morey et al., 2007). Хотя остается неясным, являются ли эти последние изменения причиной или следствием последовательной активации Hox генов. Поскольку последовательная активация предопределяет пространственные координаты экспрессии Hox генов в некоторых типах животных, образование кластеров per se , по-видимому, несущественно для пространственной колинеарности (Deschamps, 2007; Duboule, 2007). Было предположено, что пространственная колинеарность является изначальным свойством, тогда как образование кластеров и временная колинеарность были приобретены во время эволюции (Duboule, 2007).

Во время развития конечностей, гены из кластеров HoxA и HoxD активируются последовательно вследствие их упорядоченного расположения внутри кластера, приводя к доменам экспрессии, которые колинеарны как в пространстве, так и во времени (Kmita and Duboule, 2003; Zakany and Duboule, 2007; Montavon and Duboule, 2013). Экспрессия генов HoxD происходи двумя независимыми фазами (обозначаемыми как фаза 1 и 2) , которые базируются на отличающихся цис-регуляторных элементах, локализованных по обеим сторонам кластера (Nelson et al., 1996; Tarchini and Duboule, 2006; Montavon and Duboule, 2013). Регуляторный регион 3' (early limb control region; ELCR) контролирует последовательную временную активацию гена (фаза экспрессии 1) (Zakany et al., 2004). Одновременно, 5' регуляторный регион (POST) оказывает рецессивный эффект на пространственно ограниченную экспрессию 5' Hoxd в задней части мезенхимы ранних зачатков конечностей (Tarchini and Duboule, 2006). Впоследствии, этот домен ранней экспрессии позднее фиксируются как презумптивный домен zeugopod (Tarchini and Duboule, 2006). Фаза два экспрессии HoxD генов осуществляется исключительно в презумптивном регионе, формирующем пальцы, и механистически не связана с первой фазой экспрессии (Spitz et al., 2003; Tarchini and Duboule, 2006; Gonzalez et al., 2007; Montavon et al., 2011). Различные удаленные регуляторные элементы, расположенные на бедной генами 5' стороне кластера управляют фазой транскрипции 2 (Montavon et al., 2011; Tschopp and Duboule,2011). Это происходит обратным колинеарным образом, т.к. большинство 5' транскрипционных единиц, напр., Hoxd13, экспрессируются строго по всей презумптивной территории пальцев, тогда как Hoxd12 по Hoxd9 транскрибируются со всё более низкой эффективностью и исключаются из региона пальца-1 (Kmita et al., 2002; Montavon et al., 2008). В обеих фазах регуляции положение транскрипционной единицы относительно регуляторных регионов определяет пространственные и временные параметры экспрессии HoxD. Изменения в геномной позиции транскрипционных единиц относительно 3' регуляторного региона (напр., с помощью целенаправленной делеции в кластере) изменяет время её активации, тогда как пространственная экспрессия затрагивается в зависимости от относительной позиции делеции в 5' регуляторных регионах. Предполагается, что сходные механизмы используются и для кластера HoxA.

В данном исследовании, посредством анализа разных мутаций HoxA и HoxD, мы получили доказательства, что HOX белки сами по себе важны для предопределения пространственных параметров экспрессии HoxA и HoxD в дистальной части зачатка конечности. Как сообщалось ранее, мы наблюдали, что делеция 5' Hoxd генов влияет только на экспрессию HoxD. Напротив, потеря белка HOXA13 оказывает более генерализованное влияние на экспрессию как HoxA, так и HoxD генов. Более того, мы показали, что присутствие белков группы паралогов HOX 13 является обязательным для разделения доменов экспрессии "zeugopod" и "autopod" генов HoxA и HoxD.

DISCUSSION

Во время развития конечности проксимальные клетки, маркированные экспрессией Meis1 детерминированы, чтобы формировать stylopod (плечо), тогда как более дистальная мезенхима в конечном счете дает два отличающихся анатомических сегмента: zeugopod (предплечье) и autopod, которые состоит из mesopod (запястья) и acropod (пальцев). Дистальная часть мезенхимы молекулярно подразделена за счет экспрессии генов HoxA и HoxD, при этом Hoxa11 экспрессируется в регионе презумптивного zeugopod, тогда как Hoxa13 экспрессируется в презумптивных регионах mesopod и acropod. Двухфазная регуляция HoxD генов запускает экспрессию в презумптивном регионе zeugopod (фаза 1) и acropod (фаза 2). Возникает фундаментальный вопрос, как это молекулярное подразделение, которое специфично для конечностей тетрапод, осуществляется и поддерживается.

Альтерации в экспрессии HoxA и HoxD наблюдались в зачатках конечностей разных мутантов. Удивительно, большинство этих альтераций обнаруживается вдоль A-P оси, тогда как альтерации вдоль P-D оси описаны только для HoxD генов после делеций в цис-положении (Kmita et al., 2002; Tarchini and Duboule, 2006). Изменения в экспрессии HoxA и HoxD, описанные в данной работе, является первым доказательством для большинства 5' HOX продуктов, контролирующих экспрессию HoxA и HoxD генов вдоль P-D оси.

Function of HOX Paralogous Group 13 Proteins is Required for the Segregation of Hox Domains Along the P-D Axis

Наши результаты показали, что делеция большинства 5' Hoxd генов, в цис-положении, помимо влияния на экспрессию HoxD генов, соседних с точкой разрыва делеции (Zakany and Duboule, 1996), а также некоторые ранее недооцененные эффекты. В HoxDdel(11-13) аллеле, Hoxd4 и Hoxd9 отделены от точки разрыва делеции 4 и 2 транскрипционными единицами, соотв., и их экспрессия, как ожидается, сохраняется в зачатках дикого типа. Мы установили, что их экспрессия в презумптивном домене zeugopod обнаруживает склонность к осуществлению более каудально в мутантном контексте. Это может быть следствием модифицированного их положения в отношении 5' репрессивного региона (POST), это, в свою очередь, д. подтверждать, что POST осуществляет свой эффект на более длинное расстояние, чем считалось ранее (Tarchini and Duboule, 2006). Однако, такое изменение в экспрессии не обнаруживается для Hoxd10 даже когда он располагается близко к точке разрыва делеции, чем Hoxd9 и Hoxd4. Интересно, что недавнее сообщение показало, что делеция 5' регуляторного ландшафта затрагивает только фазу 2 экспрессии 5' Hoxd генов (Hoxd10-12), тогда как презумптивные домены zeugopod остаются незатронутыми (Montavon et al., 2011). Итак, полученные результаты подтверждают, что становление презумптивных доменов экспрессии zeugopod могут дифференциально регулироваться для Hoxd1-9 скорее, чем для Hoxd10-12. Несмотря на это на мутантном фоне двухфазная экспрессия HoxD генов и сегрегация фаз 1 и 2 HoxD сохраняются и экспрессия HoxA генов не затрагивается.

Напротив при HoxDdel(11-13)/del(11-13), инактивация Hoxa13 приводит к двум основным изменениям: (i) Hoxa11 и HoxD гены эктопически экспрессируются дистально, в основном в презумптивной территории digit-1 и (ii) разделение между фазами экспрессии 1 и 2 существенно снижено. Эти результаты подтверждают, что механизм, который супрессирует фазу 1 регуляции HoxD генов и экспрессия Hoxa11 в презумптивном регионе mesopod и digit-1 нарушается после инактивации Hoxa13. Это указывает на то, что белок HOXA13 может играть критическую роль в сегрегации экспрессии Hox в презумптивных доменах zeugopod и autopod. Более того, наши результаты показывают, что HOXA13 и HOXD13 действуют синергичным способом, т.к. когда оба белка инактивированы, появляется транскрипция Hoxa11 и Hoxd4 во всей дистальной части зачатка конечности, а сегрегация доменов zeugopod и autopod HoxD генов теряется. Итак, полученные данные предоставляют исчерпывающие доказательства, что группа паралогов HOX 13 является критической для собственно сегрегации Hox доменов вдоль P-D оси.

Даже если HOX13 белки действуют синергичным образом (Fromental-Ramain et al., 1996), наши результаты показывают выдающуюся роль HOXA13. Наиболее глобальное изменение в регуляции наблюдается только, когда Hoxa13 инактивируется, тогда как эффект делеции 5' HoxD обнаружим только в остальных HoxD генах. Преобладающий эффект Hoxa13 обусловлен его паттерном экспрессии, который покрывает весь домен autopod и mesopod быстрее, чем Hoxd13, что вероятнее, чем различия в функциональных свойствах HOXA13 и HOXD13 per se.

Possible Mechanisms by Which HOX Proteins Contribute to Cluster-wide Regulation

Отсутствие белков HOX группы паралогов 13 ведет к эктопической экспрессии Hoxa11 и Hoxd4 дистальнее и к потере сегрегации доменов экспрессии zeugopod и autopod HoxD генов. Поскольку HoxD гены затронуты, то несколько возможностей могут объяснить нарушения их регуляции: (i) фаза 1 регуляции эктопически активна в клетках презумптивного аутопода; (ii) фаза 2 регуляции теряет свою ограниченность наиболее 5' генами, тем самым запускается эктопическая экспрессия большего количества 3' генов в презумптивном autopod; и (iii) комбинация двух последних сценариев. Исходя из прогрессивной дистализации экспрессии Hoxd4 в мутантных контекстах, мы склоняемся в пользу эктопической активности фазы 1 в клетках autopod как ответственной за нарушение регуляции HoxD в отсутствие белков HOX группы паралогов 13. Однако необходимо детальное исследование организации хроматина HoxD локуса в мутантных контекстах, чтобы однозначно решить вопрос, какая фаза регуляции затрагивается. Несмотря на это наши результаты показали, что функция белков группы паралогов HOX 13, особенно HOXA13, является критической для становления "dichotomy" экспрессии HoxD (домены zeugopod и autopod), тем самым генерируемый промежуточный лишенный HoxD домен рассматривается как презумптивный домен запястья (Woltering and Duboule, 2010)

Совсем недавнее исследование, идентифицирующее регуляторный домен, расположенный в 3' кластера HoxD (T-DOM), контролирующий фазу 1 экспрессии генов HoxD в раннем зачатке конечности и презумптивном zeugopod (Andrey et al., 2013), иогда как вторая фаза экспрессии контролируется с помощью регуляторного домена, расположенного в 5' кластера HoxD (C-DOM) (Montavon et al., 2011; Andrey et al., 2013). Переключение с фазы 1 к фазе 2 регуляции в дистальных клетках сопровождается посттрансляционными модификациями гистонов, переключением состояния хроматина из активного в неактивное в T-DOM и с неактивного в активное в C-DOM. Интересно, что замалчивание фазы 1 регуляции в дистальных клетках не зависит от фазы 2 активации и было предположено, что разрыв между доменами экспрессии HoxD zeugopod и autopod соответствует клеткам, в которых фаза 1 выключается, но фаза 2 не активируется (Andrey et al., 2013). Исходя из наших результатов, показавших, что потеря этого пробела в отсутствие HOX группы паралогов 13, мы полагаем, что эти белки могут действовать как переключатели для смены фазы 1 регуляции. Доказательство, что HOX белки могут взаимодействовать с гистоны/хроматин модифицирующими комплексами (Shen et al., 2001; Lu et al., 2003; Luke et al., 2006), открывает возможность, что белки HOX группы паралогов 13 могут влиять на состояние хроматина в кластере HoxD и/или его регуляторный ландшафт. Альтернативно, белки HOX группы паралогов 13 могут вызывать минорные изменения в конформации хроматина в HoxD локусе, нарушая его взаимодействие с регуляторными последовательностями фазы 1, способствуя тем самым взаимодействию в презумптивном домене autopod.

Random Incident or a Coordinate Strategy?

Годами гены Hox исследовались или как индивидуальные гены или как кластеры. Лишь в немногих случаях, таких как во время формирования паттерна заднего мозга, были описаны"локальные" ауто- или перекрестные регуляторные взаимодействия между Hox генами (Arcioni et al., 1992; Popperl et al., 1995; Studer et al., 1998; Manzanares et al., 2001). Здесь мы показали, что HOX белки сами по себе, скорее всего, участвуют в генерации "глобальных" пространственных параметров экспрессии Hox в развивающихся конечностях. Мы полагаем, что становление паттернов экспрессии Hox использует "само-регуляторный" механизм, причем функционально доминантные HOX белки детерминируют пространственные параметры экспрессии др. Hox генов в данной ткани. Согласно этому мнению, у животных, у которых Hox гены или собраны в кластеры или не собраны, функционально доминантных HOX белков, в конечном итоге устанавливают и/или поддерживают специфичность пространственной экспрессии или HOX код, в конечном счете предопределяя судьбу клеток.

Simple Step and Big Leap Forward

Появление парных придатков стало главной ступенью в эволюции тетрапод и в колонизации суши (Coates, 1994; Clack, 2005). Данные по окаменелостям подтверждают, что конечности развились из плавников, но как произошла эта морфологическая трансформация пока неясно (Cohn et al., 2002; Schneider and Shubin, 2013). Удивительно, HoxA и HoxD кластеры генов экспрессируются в перекрывающихся доменах в плавниках, тогда как отличительным признаком конечностей тетрапод стала сегрегация доменов экспрессии Hox в дистальных частях зачатков конечностей, по крайней мере, у изученных в этом отношении видов (Metscher et al., 2005; Woltering and Duboule, 2010). Расхождение доменов экспрессии Hox, как полагают, явилось важным изменением в эволюции хорошо артикулированных, функциональных конечностей тетрапод (Metscher et al., 2005; Woltering and Duboule, 2010).

Приобретение новых цис-регуляторых элементов, модулирующих экспрессию Hox или увеличивающих пролиферацию дистальных клеток путем пролонгации функции AER, предполагается в качестве возможных механизмов, участвующих в этой эволюционной трансформации (Sordino et al., 1995; Freitas et al., 2012; Schneider and Shubin, 2013). Недавние исследования на мышах показали, что гены HoxA и HoxD важны для роста зачатков конечностей помимо их участия в формировании паттерна (Kmita et al., 2005; Sheth et al., 2013). Избыточная экспрессия HOXD13 в плавниках рыбок данио приводит к дистальному разрастанию, сегрегации доменов Hox и экспрессии маркеров, специфичных для аутопода (Freitas et al., 2012). Здесь мы показали, что HOX13 белки важны для сегрегации др. Hox доменов вдоль P-D оси. После инактивации HOX13, др. HoxA и HoxD гены экспрессируются в перекрывающихся доменах, напоминая паттерны экспрессии Hox в плавниках рыб. Следовательно, можно предположить, что в ходе эволюции приобретение новых цис-регуляторных элементов и/или модуляция передачи сигналов AER вносят вклад в дистальную специфическую экспрессию Hoxa13. В свою очередь дистальная экспрессия гена Hoxa13 гарантирует экспансию предшественников аутопода и создание условий, необходимых для сегрегации доменов autopod и zeugopod генов HoxA и HoxD, делая возможным развитие запястья и пальцев, и тем самым делая возможным возникновение богатых суставами, функциональных конечностей тетрапод.

“Self-regulation,” a new facet of Hox genes' function Rushikesh Sheth, Maria Felix Bastida,Marie Kmita,Marian Ros Developmental Dynamics 243:182–191, 2014.

“Self-regulation,” a new facet of Hox genes' function
Rushikesh Sheth, Maria Felix Bastida,Marie Kmita,Marian Ros
Developmental Dynamics 243:182–191, 2014.